一、胃癌侵袭转移及预后的标志物（论文文献综述）
江涛[1]（2021）在《FNDC1促进胃癌侵袭及腹膜转移的作用和机制研究》文中研究指明背景和目的胃癌的恶性度高,预后差,腹膜转移是其最常见、侵袭性最强的转移类型。胃癌腹膜转移的具体机制尚未完全阐明,由于缺乏有效预测指标,其诊断难度较大,且治疗手段有限,疗效欠理想。腹腔灌注化疗（IPC）是临床防治胃癌腹膜转移的有效手段,但IPC也存在治疗风险。因此,鉴别腹膜转移危险因素,寻找特异性分子标志物,对高危患者进行预防性IPC干预值得重视。在前期研究中,我们通过全外显子捕获测序（WES）,筛选出多个与胃癌腹膜转移潜在相关的基因,其中FNDC1在腹膜转移患者中突变富集,提示其可能与胃癌腹膜转移有关。本课题在此基础上,应用生信分析、基因转染、RNA干扰、动物模型和蛋白组学等手段,旨在分析FNDC1与胃癌腹膜转移的相关性并阐明其具体作用机制。方法1.利用基因表达数据库进行生物信息分析,筛选胃癌腹膜转移相关基因,将结果比对WES数据,验证FNDC1与胃癌腹膜转移的相关性。2.使用免疫组化分析74例胃癌和癌旁组织中FNDC1表达水平,解析其与胃癌患者临床资料及预后的关系。3.应用实时荧光定量PCR和免疫印迹（WB）检测人胃癌细胞株（AGS、MGC803、BGC823、HGC27）和正常胃黏膜上皮细胞GES-1中FNDC1基因的m RNA转录水平及蛋白表达情况。4.构建慢病毒介导的FNDC1基因敲减载体并进行病毒包装,转染FNDC1高表达的胃癌细胞株AGS和MGC803,并进行细胞计数试剂盒（CCK8）、细胞周期检测、侵袭迁移能力、克隆形成、Edu细胞增殖检测等细胞功能学实验,验证FNDC1在胃癌侵袭转移过程中的作用。5.通过动物实验观察FNDC1敲减对MGC803胃癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。6.构建慢病毒载体,在AGS和MGC803细胞中敲减FNDC1,并在FNDC1表达相对较低的BGC823细胞中过表达FNDC1。再分别使用胃癌细胞及移植瘤组织,通过WB和免疫共沉淀检测上皮细胞间充质转化（EMT）及Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白变化,明确FNDC1调控Wnt/β-catenin信号通路介导胃癌细胞EMT的作用。7.回复实验验证,通过慢病毒转染,在FNDC1敲减的MGC803细胞中过表达β-catenin,通过细胞克隆、划痕实验,观察其对胃癌细胞侵袭迁移的影响。结果1.通过公共数据库筛选获得FNDC1基因,生信分析显示FNDC1在胃癌及腹膜转移组织中表达上调,与胃癌患者预后不良显着相关。基因集富集分析显示FNDC1的高表达与EMT正相关。2.FNDC1表达水平与患者肿瘤大小、肿瘤分期、浸润程度、淋巴结转移及腹膜转移情况相关,并与无疾病进展生存期（DFS）和总生存期（OS）减少有关。FNDC1的表达水平和浸润程度是导致患者预后不良的独立危险因素。3.胃癌细胞中FNDC1的m RNA转录和蛋白表达水平均显着高于GES-1,其中AGS和MGC803的表达水平最高,BGC823表达水平相对较低。4.FNDC1敲减抑制了胃癌细胞AGS和MGC803的增殖、侵袭及迁移,并导致G2～M期阻滞。5.动物实验发现FNDC1敲减后MGC803的裸鼠皮下成瘤能力减弱。6.FNDC1敲减后,在胃癌细胞MGC803及移植瘤组织中均显示EMT关键蛋白E-cadherin和Krt12蛋白水平显着上调,vimentin,survivin,Snail和Slug显着下降。而过表达FNDC1,则使E-cadherin和Krt12蛋白水平显着下降,vimentin、survivin、Snail和Slug蛋白水平显着上升。7.FNDC1敲减后,胃癌细胞AGS、MGC803的总β-catenin和细胞核内β-catenin蛋白水平均显着下降,β-catenin泛素化水平显着升高。8.FNDC1敲减后,胃癌细胞的侵袭迁移能力减弱,而在FNDC1敲减的胃癌细胞株中过表达β-catenin,能够逆转这一趋势。结论FNDC1与胃癌侵袭及腹膜转移有关,其在胃癌组织和细胞中表达上调。FNDC1高表达是影响患者预后的独立危险因素。FNDC1敲减能显着抑制胃癌细胞的增殖、侵袭迁移活性、G2～M期阻滞。FNDC1可通过调控Wnt/β-catenin信号通路,诱导胃癌细胞发生EMT,促进胃癌的侵袭转移。FNDC1有可能作为胃癌腹膜转移的预测因子,也可作为胃癌腹膜转移的潜在治疗靶点进行深入研究,具一定的转化应用价值,值得进一步验证。
饶敏[2]（2021）在《hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究》文中认为背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,是全球第三大癌症致死原因。我国胃癌的发病率及死亡率均高于世界平均水平。胃癌病程隐匿,目前早期诊断及治疗的手段仍有局限。circRNA成为近年肿瘤研究的热点,其可作为竞争性内源RNA与miRNA结合,参与相应mRNA的表达调控。circRNA-miRNA-mRNA网络这一全新基因表达调控模式与肿瘤包括胃癌的发生发展关系密切。而外泌体中的circRNA,存在于肿瘤微环境及各种体液中,不仅是肿瘤细胞与其微环境之间信息交流的桥梁,也因其方便检测而被认为是潜在的肿瘤生物标志物。许多研究已经探索了它们在胃癌诊断以及新型治疗中的可能应用。近年来,多项高通量分析关注了胃癌组织和体液中差异表达的circRNA（DE circRNA）,但血浆外泌体目前尚无研究报道。因此,本研究希望通过高通量RNA测序检测出胃癌患者血浆外泌体中的DE circRNA,进而通过体内外功能实验筛选出在胃癌进展中发挥重要功能的circRNA,从而帮助阐明胃癌的发病机制,并为胃癌的诊断和治疗提供新的线索。研究方法:（1）使用exoEasy Maxi Kit（Qiagen）从胃癌（GC）患者及健康对照（HC）血浆中分离外泌体,通过Western blot和透射电子显微镜对外泌体性状进行鉴定;而后通过高通量RNA测序和生物信息学分析,筛选外泌体中差异表达的circRNA;并通过GO和KEGG分析预测DE circRNA可能的发挥的功能和参与的信号通路;通过RT-q PCR对高通量测序结果加以验证,并筛选出进行功能研究的circRNA。（2）通过统计学分析评估GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。（3）利用circBase数据库查询（http://www.circbase.org）hsa＿circ＿0014606的序列、亲本基因及染色体定位。使用NCBI的基因组工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）进行基因组序列比对。利用Circ Bank数据库（http://www.circbank.cn/）查询hsa＿circ＿0014606的翻译和修饰信息。（4）构建过表达和敲减hsa＿circ＿0014606的慢病毒载体,包装慢病毒,感染GC细胞建立稳定细胞株。通过CCK8实验检测GC细胞增殖;通过Annexin VAlexa Fluor 488/PI染色检测细胞凋亡;通过划痕愈合实验检测细胞迁移能力;通过基质胶包被的Transwell实验检测细胞侵袭能力。（5）使用PMA刺激THP-1细胞使其分化为M0巨噬细胞,与GC细胞外泌体共培养后通过RT-q PCR检测M1巨噬细胞的标志性分子IL-12和i Nos,以及M2巨噬细胞的标志性分子IL-10和Arg-1,从而确定巨噬细胞的极化方向。（6）通过生物信息学分析预测hsa＿circ＿0014606的靶标miRNA及其下游靶基因;双荧光素酶报告实验验证它们之间的结合和相互作用。（7）使用NCD免疫缺陷小鼠构建了GC移植瘤模型以确定hsa＿circ＿0014606在体内对GC细胞成瘤的影响,及其对靶标miRNA及其下游靶基因的影响。研究结果:（1）我们采集了5名GC患者和5名健康供者的外周血样本,并从血浆中成功分离出外泌体。通过高通量RNA测序,在所有血浆外泌体样品中共检测到67,880个circRNA,筛选出1,060个在GC中差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。（2）GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。（3）RT-q PCR结果显示选定的6个上调的circRNA在GC细胞和/或GC组织中显着上调;其中hsa＿circ＿0014606上调最为稳定及显着。（4）GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。（5）hsa＿circ＿0014606来自YY1AP1（YY1 associated protein 1）基因,为外显子-内含子circRNA（EIciRNA）。其可能具有编码蛋白质的能力。（6）体外实验证实过表达hsa＿circ＿0014606促进GC细胞增殖、迁移和侵袭;敲减hsa＿circ＿0014606促进GC细胞凋亡。（7）AGS细胞外泌体能够促进THP-1细胞向M2巨噬细胞方向极化;过表达hsa＿circ＿0014606后的AGS细胞外泌体进一步促进了M2极化,而敲减hsa＿circ＿0014606则抑制了M2极化。（8）miRNA-194-5p是hsa＿circ＿0014606的靶miRNA,其在GC组织中表达下调,在AGS细胞中过表达hsa＿circ＿0014606可显着抑制其表达。（9）双荧光素酶报告实验证实hsa＿circ＿0014606可与miRNA-194-5P结合。（10）YAP1被预测为miRNA-194-5p的靶基因,双荧光素酶报告实验证实YAP1可与miRNA-194-5p结合,后者能够促进其转录本降解。（11）hsa＿circ＿0014606促进AGS细胞NCD小鼠体内成瘤,且可下调miRNA-194-5p并上调YAP1的表达。结论:通过高通量RNA测序,我们在GC患者血浆外泌体样品中筛选出1,060个差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了与GC发生发展密切相关的生物过程和通路,如细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。RT-q PCR证实了高通量测序的结果,且提示血浆外泌体中表达上调的circRNA很可能来自肿瘤组织和细胞。hsa＿circ＿0014606在GC组织和细胞中上调最为显着,其在患者血浆外泌体中的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。功能研究表明hsa＿circ＿0014606可能作为miRNA-194-5p的海绵,上调YAP1的表达,在GC细胞内发挥促进增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡的功能,并可进入GC细胞外泌体促进共培养的巨噬细胞向M2表型极化,从而促进GC的发生发展。
邹丹[3]（2021）在《内皮型一氧化氮合酶影响胃癌腹膜转移的机制及其作为胃癌治疗靶点的研究》文中研究说明目的:内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS,NOS3）是一氧化氮合酶家族成员之一,是参与细胞内一氧化氮生成的催化酶。近几年的研究结果证实了NOS3在乳腺癌、肠癌、胰腺癌及前列腺癌中参与促进血管生成、肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制免疫反应和肿瘤细胞凋亡等。但是,目前关于NOS3在恶性肿瘤中表达情况的研究仍然较少,并且其影响肿瘤发生发展的机制研究还不全面,有待深入挖掘。胃癌是目前最常见的恶性肿瘤之一。在我国,多数胃癌患者在诊断时已经是进展期,虽然以胃癌根治切除术为核心的治疗方案一定程度上改善了患者的预后,但仍有约1/3的胃癌患者手术后复发。在胃癌中,腹膜播散几乎占胃癌复发的50%,发生腹膜转移的胃癌患者的中位生存时间只有7-16个月。因此,进一步探索预防和治疗胃癌腹膜转移的诊疗方案对改善胃癌患者的预后,延长生存时间具有重要的意义。NOS3作为胃癌患者预后标志物及其作为胃癌腹膜转移治疗靶点的价值还没有研究报道。蟾毒灵提取自常见的中药蟾酥,是其有效成分之一,作为华蟾素的主要有效成分,蟾毒灵被广泛用于治疗多种恶性肿瘤。蟾毒灵可以促进多种肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和其他恶性生物学过程。然而,蟾毒灵对胃癌腹膜转移的作用并且NOS3在此过程中扮演的角色还不清楚。研究方法:1.从UCSC Xena、GEO数据库和CCLE数据库下载肿瘤组织、正常组织及人类癌细胞系中NOS3 mRNA表达数据和肿瘤患者的表型数据;2.分别比较肿瘤组织、正常组织及癌细胞系中NOS3 mRNA的表达水平;3.t-检验比较各肿瘤类型中肿瘤组织和正常组织的NOS3表达水平;4.t-检验比较各肿瘤类型中早期肿瘤和晚期肿瘤的NOS3表达水平;5.Kaplan-Meier、Log-rank和COX回归分析检验各肿瘤类型中NOS3表达与患者预后之间的关系;6.免疫组化实验检测收集的90例胃癌患者病历组织中NOS3表达水平,并分析其与患者临床数据和生存之间的关系;7.使用siRNA或NOS3抑制剂（L-NAME）干预胃癌细胞中NOS3的表达,或者使用蟾毒灵处理胃癌细胞;8.MTT实验检测胃癌细胞的增殖能力;9.粘附实验检测胃癌细胞粘附于基质胶的能力;10.伤口愈合实验和Transwell实验检测胃癌细胞的侵袭和迁移能力;11.Western blot实验检测胃癌细胞中NOS3、p-NOS3（Ser-1177）、EMT过程关键蛋白、MAPK通路关键蛋白的表达;12.使用MKN-45P细胞构建胃癌腹膜转移裸鼠模型,统计终止实验时裸鼠的腹膜转移瘤数量和质量、腹水体积,免疫组化实验检测NOS3、E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达情况。结果:第一部分:基于泛癌症分析研究NOS3在胃癌中的表达及临床意义。1.1 NOS3 mRNA在各种肿瘤类型中的表达水平是不同的,其中在胃癌组织中的表达水平最高;1.2 NOS3 mRNA表达水平位列前三名的细胞系为在胃腺癌、结肠腺癌以及神经系统肿瘤组织的细胞系;1.3 NOS3 mRNA在直肠腺癌、胃腺癌、胰腺癌、卵巢浆液性囊性腺癌、皮肤黑色素瘤和头颈部鳞状细胞癌中表达水平显着高于正常组织;1.4皮肤黑色素瘤中,NOS3在分期较晚的患者中表达更高。胃腺癌中,NOS3表达与肿瘤分期之间未显示出显着的关联;1.5 NOS3 mRNA表达水平较高的胃癌患者总生存时间显着缩短;1.6综合TCGA-STAD和GSE29272数据集分析,发现NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素;1.7免疫组化实验检测我们收集的90例胃癌患者病理组织发现NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素。第二部分:NOS3在胃癌腹膜转移过程中的作用及机制。2.1选择胃癌细胞系MGC-803和胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P进行细胞实验,使用siRNA敲低NOS3表达后,胃癌细胞黏附、侵袭和迁移能力显着降低,EMT过程被逆转;2.2 L-NAME抑制NOS3表达后,胃癌细胞黏附、侵袭和迁移能力显着降低,EMT过程被逆转;2.3生物信息学分析发现胃癌中NOS3可能通过MAPK通路调控胃癌的恶性生物学行为;2.4胃癌细胞中干预NOS3表达后,ERK和p38的磷酸化水平显着降低,MAPK通路活化被抑制。第三部分:蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌腹膜转移的影响。3.1蟾毒灵通过与NOS3蛋白结合降低其磷酸化（Ser1177）水平;3.2蟾毒灵处理胃癌细胞MGC-803和胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P后,胃癌细胞的黏附、侵袭和迁移能力被明显抑制,EMT过程被逆转;3.3使用胃癌腹膜高转移细胞系MKN-45P构建胃癌腹膜转移裸鼠模型,结果发现实验组（蟾毒灵单药,L-NAME单药和双药组）裸鼠的腹膜转移瘤数量、质量和腹水体积明显减少;3.4实验组裸鼠腹膜转移瘤中NOS3蛋白表达降低,E-钙粘蛋白表达增多而波形蛋白表达降低。结论:通过分析公共数据集以及收集的胃癌患者病理组织,我们证实了NOS3的高表达与胃癌患者的预后不良有关,NOS3是胃癌患者预后的独立危险因素。NOS3通过MAPK信号通路调控胃癌细胞的侵袭、迁移和定植能力以及EMT过程。NOS3可能通过MAPK通路正向调节胃癌的腹膜转移过程,导致胃癌患者的不良预后。Ser1177磷酸化是NOS3的主要活性形式之一,通过筛选发现蟾毒灵是以NOS3为靶标的临床治疗药物,它可以降低NOS3的磷酸化水平来抑制NOS3的活性。蟾毒灵可通过抑制NOS3-MAPK信号通路阻止胃癌腹膜转移的进程。这些结果提示我们NOS3可能是胃癌患者预测总生存时间的生物标志物,并且是胃癌治疗的潜在靶点。蟾毒灵可能通过抑制NOS3活性,下调MAPK通路的活化,进而抑制胃癌的腹膜转移进程。本研究为蟾毒灵腹腔内灌注治疗胃癌腹膜转移提供了更多的证据支持。
原凌燕[4]（2021）在《基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究》文中提出背景:恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma,MM）是极具侵袭力的恶性肿瘤之一,具有发病隐匿,易转移,治疗反应差的特点,死亡病例占皮肤肿瘤总死亡病例的80%。多数患者确诊之前就已经发生远处转移,由于晚期有效的治疗方法和治疗药物有限,伴发转移患者总生存期仅为6-9个月,3年生存率不足15%。目前,即使包括最新获批用于转移性黑色素瘤的分子靶向治疗药物KRAS抑制剂和抗细胞毒性T淋巴细胞抗原（CTLA）-4抗体Ipilimumab在内的免疫治疗的受益群体也相当有限,而且几乎无法预测不同个体伴随治疗的严重副作用。因此,鉴定筛选与恶性黑色素瘤的预后高特异、高选择性相关的标志物,筛选出新治疗方法的获益群体,并据此预测预测筛选开发针对性的治疗方法,对改进MM的治疗至关重要,这也很可能有助于发现未来针对性研发MM新药的潜在靶点。目的:分析和筛选MM原发病例样本和转移病例样本中的差异表达基因,构建预后风险模型,并探索预后风险模型基因对肿瘤微环境的影响,分析基因标志物与MM恶性程度和免疫耐受复杂特性的关系,获取基因标志物影响黑色素瘤恶性表型相关的功能证据,为改善MM转移患者的临床治疗决策和相关新药研发提供参考依据。方法:（1）筛选基因标志物:1)以生物信息学方法,获取和清洗TCGA数据库的MM病例的基因组表达谱、生存数据,因为数据库中缺乏恶性黑色素瘤原发病例和转移病例的配对样本,所以根据数据库中恶性黑色素瘤病例的临床特征、治疗干预措施等,我们严格制定纳入和排除标准,保证原发病例样本和转移病例样本的一般资料具有可比性后,进行两组样本的差异表达基因分析;2)使用Imm Port（The Immunology Database and Analysis Portal）数据库的免疫相关基因数据集,取交集匹配出免疫相关基因标志物。3)为了保证预后时间的准确性,我们使用观察到的生存间隔时间（observed survival interval,OBS,即从TCGA采样到患者死亡或最后一次随访的时间间隔）代替总生存时间（overall survival,OS）;为了排除病例临床表型和治疗干预措施等因素的影响,我们纳入了年龄、性别、AJCC分期、Clark评分、Breslow厚度值进行单变量和多变量逐步Cox风险比例回归分析以构建预后基因标志物的预测模型,并通过R软件的“survminer”软件包构建,根据ROC曲线下面积验证模型的有效性。4)通过CIBERSORTx反卷积方法重构MM样本的免疫浸润淋巴细胞的相对含量丰度,“Spearman”相关性分析确定预后模型基因与免疫浸润淋巴细胞的相关性;5)本研究还收集MM单细胞测序数据,通过单细胞组学数据对转移预后基因标志物与肿瘤微环境的浸润淋巴细胞亚组进行相关性分析并比较计算结果,进一步对反卷积计算的结果加以验证。（2）验证基因标志物:1)利用人类蛋白质图谱（The human protein atlas,HPA）数据库的人类肿瘤样本免疫组学数据验证基因标志物,包括目标蛋白在细胞内的定位、肿瘤组织中的表达水平及免疫组化的特征等;针对缺乏免疫组化数据的目标靶基因,使用TCGA泛癌数据验证该基因对多种肿瘤的预后作用;2)利用分子生物学方法,通过Cas9技术基于向导RNA（small guide RNA,sg RNA）敲除CXCR4,构建敲除目标基因的恶性黑色素瘤细胞系sg-A375细胞,通过划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验获取CXCR4影响黑色素瘤细胞恶性生物学行为的功能证据,以实验研究验证CXCR4基因对A375细胞侵袭和转移的促进作用。结果:（1）通过一系列分析,构建了一个可以预测MM转移患者预后的由6个免疫相关基因（immune-related genes,IRGs）-SLPI,S100A7,LYZ,CCL19,CXCR4和CD79A-组成的基因标志物模型,该模型能够在训练集中区分转移MM患者的预后风险,（TCGA,n=226,log-rank test,P<0.001）;且6-IRGs是MM独立的预后危险因素,不受性别、年龄和病理分期等临床特征的影响（HR=20.84,95%CI:5.00-86.93,P<0.001）;在GEO独立数据集中的验证结果显示该模型对转移患者的预后也能做出有效预测（GSE19234,n=106,log-rank test P<0.001,GES53118,n=79,log-rank test,P<0.001）,并通过ROC曲线验证模型的有效性;通过CIBERSORTx重构免疫浸润细胞的含量丰度,6个IRGs与免疫浸润细胞及免疫检查点基因（immune-checkpoint genes,ICGs）均具有一定的相关性。（2）通过GEO（GSE72056）单细胞测序数据集,运用单细胞分析软件及方法分析了MM转移病例样本中的细胞特征和聚类分型。结果显示,样本细胞注释后分为18类,与免疫微环境有关的肿瘤细胞亚群包括B细胞、DC细胞、成纤维细胞、粒细胞集落刺激因子、CD34造血干细胞、神经上皮细胞、神经元细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、前体CD34B细胞、晚期CD34B细胞、早幼粒细胞、T细胞和组织干细胞。与原发病例样本的肿瘤微环境比较,上述细胞（除NK细胞和T细胞）在淋巴结转移病例样本的含量丰度有显着差异（P<0.001）;单细胞中检测到的3个基因标志物（CXCR4,LYZ和CD79A）与上述差异细胞具有显着的相关性（P<0.001）。其中,CXCR4和多种免疫浸润细胞具有较高的相关性,因此CXCR4作为后期的实验验证对象,进行生物实验验证其功能。（3）通过HPA数据库中102例MM样本的免疫组化数据验证分析了筛选出的5个IRGs（SLPI,S100A7,LYZ,CCL19和CD79A）的蛋白组化结果显示在恶性黑色素瘤中均可以看到5个基因的蛋白免疫组化的染色;CXCR4和免疫浸润细胞呈高度相关,但是CXCR4在HPA数据库缺少蛋白组化数据,因此,为深入探讨CXCR4在肿瘤中的功能,基于TCGA泛癌的数据,分析CXCR4出恶性黑色素瘤之外的多种肿瘤的预后风险比（hazard radio,HR）,将CXCR4对不同肿瘤患者预后的HR进行Meta分析。结果显示,CXCR4对胃癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺腺癌、肾透明细胞癌、头颈部癌、食管腺癌和宫颈癌的OS有预测作用（P<0.001）,其中,在胃癌和肾透明细胞癌的预后是保护性因素（HR<1）,在其余肿瘤的预后为危险性因素（HR>1）。CXCR4对于多种肿瘤患者的无复发生存时间（Relapse-Free Survival,RFS）预后HR的Meta分析结果显示,CXCR4的高表达对胃癌、卵巢癌、肺腺癌、肾透明细胞癌和膀胱癌具有预后预测作用（P<0.001）,在胃癌、肺腺癌和肾透明细胞癌患者的RFS是保护性因素（HR>1）,而在卵巢癌还和膀胱癌中是高风险因素（HR>1）。（4）通过生物实验验证CXCR4与MM的增殖、转移功能关联:使用Cas9技术,利用sg-RNA转染敲除CXCR4后构建MM的CXCR4基因敲除细胞系A375细胞（sg-A375）,然后通过划痕实验和Transwell小室实验检测sg-A375细胞的迁移及穿透力,获取CXCR4与黑素瘤恶性行为相关功能的证据。与A375细胞比较,sg-A375细胞的划痕实验修复能力和迁移及侵袭能力显着下降。结果证实敲除CXCR4可抑制黑素瘤增殖、侵袭、迁移过程,表明MM中CXCR4高表达和患者预后不良相关。结论:（1）通过TCGA数据库筛选获得6个IRGs（SLPI,S100A7,LYZ,CCL19,CXCR4和CD79A）组成的可用于MM转移患者预后预测的免疫相关基因标志物（immune-related gene signature,IRGS）,经GEO不同维度的独立数据集验证该6个IRGs组成的IRGS模型具有很好的适用性。（2）转移MM病例的单细胞分析结果说明:转移病例样本中的B细胞、粒细胞集落刺激因子、中性粒细胞和成纤维细胞的浸润,与MM患者预后相关,同时上述浸润细胞含量丰度和免疫预后基因表达呈显着正相关。（3）HPA数据库验证基因标志物的结果显示,除CXCR4外,其余SLPI,S100A7,LYZ,CCL19和CD79A5个基因蛋白可以在数据库验证;基于泛癌数据的meta分析结果显示,CXCR4对多种肿瘤患者的OS和RFS均具有较好的预测作用。对不同的肿瘤,CXCR4具有不同的预后判断价值。（4）CXCR4不仅促进A375细胞的增殖和克隆,还与细胞的迁移和侵袭行为密切相关,说明CXCR4可能通过影响免疫微环境而改变患者的预后。
齐明然[5]（2021）在《长链非编码RNA RP11-7K24.3通过miR-17-5p/ZBTB4轴对胃癌发生发展的调控作用及相关机制研究》文中研究说明胃癌是世界范围内最常见的恶性消化系统肿瘤之一,是由多种因素参与诱导、多种分子动态调控、病理机制极为复杂的系统性疾病,近年来关于胃癌的分子机制研究在不断进步,但仍缺少早期诊断和精准治疗的特异性靶标,通过整体性构建胃癌中的分子共调控网络,深入挖掘关键调控分子及其功能,对于阐明胃癌发生与发展的潜在机制、寻找有效的诊断及治疗靶点、研制个性化治疗方案具有重要意义。已有研究表明长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）可以通过多种模式参与胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等多种生物过程,在胃癌的发生与发展过程中起着关键的调控作用,对于胃癌患者的早期诊断与预后评估具有重要价值,因此,系统而深入地分析胃癌中lncRNA的表达情况,构建lncRNA相关的调控网络,探索关键lncRNA的生物功能,可以为胃癌的分子机制研究提供一条新思路,为研发新的诊治方案奠定研究基础。本研究中通过分析TCGA数据库内胃癌样本中差异表达的lncRNA、miRNA及mRNA,运用生物信息学分析技术构建了胃癌中的lncRNA/miRNA/mRNA共调控网络,对调控网络中的差异基因进行功能分析及模块提取,由此筛选得到关键lncRNA,进一步针对关键lncRNA进行临床特征相关性分析与生存分析。此外,通过检测生存相关的lncRNA RP11-7K24.3在胃癌细胞和胃癌组织中的表达情况,以及RP11-7K24.3/miR-17-5p/ZBTB4三者之间的靶向调控关系,深入地分析了RP11-7K24.3/miR-17-5p/ZBTB4轴对胃癌细胞生物学功能的影响,从而明确其在胃癌发生与发展中的重要调控作用。第一部分胃癌中lncRNA/miRNA/mRNA共调控网络的构建及关键lncRNA的筛选从TCGA数据库下载372例胃癌样本和32例癌旁样本的转录组测序数据和临床信息,通过差异分析筛选得到2221个差异lncRNA,168个差异miRNA及3879个差异mRNA,整合使用Target Scan、miRDB、DIANA等数据库资源,构建了胃癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA共调控网络,通过对网络中的差异基因进行GO功能注释和KEGG代谢通路富集分析,以及构建蛋白互作网络（PPI）和模块分析,筛选得到76个关键lncRNA,进一步对关键lncRNA进行临床特征相关性分析和生存分析,分析发现HULC和RP11-314B1.2与多个临床特征密切相关,AC018647.3、MAGI2-AS3、MIR99AHG、NR2F1-AS1、LINC00106、PVT1、RP5-1074L1.4和RP11-7K24.3与总体生存期相关,并构建了一个由LINC00106和RP11-999E24.3组成的预后风险模型。通过q RT-PCR对临床特征相关的11个关键lncRNA在胃癌细胞中的表达水平进行检测,发现RP11-7K24.3在多种胃癌细胞内一致性低表达,推测RP11-7K24.3不仅可以作为胃癌预后分析的特异性标志物,还可能与胃癌的发生与发展密切相关,值得进一步探索其潜在的生物学功能及分子调控机制。第二部分RP11-7K24.3在胃癌中的生物学功能研究通过在55例胃癌及癌旁组织样本中对RP11-7K24.3的表达水平进行验证,发现RP11-7K24.3在胃癌组织内显着低表达,且其低表达状态与胃癌患者的肿瘤大小和远端转移密切相关。利用细胞核质RNA分离实验,发现RP11-7K24.3主要定位于细胞质中。将pc DNA3.1 RP11-7K24.3转染至胃癌细胞HGC-27和SGC-7901内以实现过表达RP11-7K24.3,同时利用CCK-8和EdU实验检测细胞生长情况,结果提示过表达RP11-7K24.3可以明显抑制胃癌细胞的增殖能力;利用细胞划痕实验和transwell细胞迁移/侵袭实验检测发现过表达RP11-7K24.3可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力;利用Western Blot检测过表达RP11-7K24.3胃癌细胞内的E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达情况,发现过表达RP11-7K24.3可以抑制EMT过程;通过流式细胞仪检测到过表达RP11-7K24.3可以促进胃癌细胞的凋亡。另外,通过小鼠移植瘤实验,发现过表达RP11-7K24.3可以在体内水平降低胃癌的生长速度和肿瘤体积。体内体外实验均证明RP11-7K24.3在胃癌的发生与发展过程中起到一定的保护作用。第三部分RP11-7K24.3调控胃癌发生发展的分子机制研究荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀实验证实了miR-17-5p与RP11-7K24.3的结合关系。通过q RT-PCR检测到miR-17-5p在胃癌细胞内明显高表达,且RP11-7K24.3过表达后可以抑制miR-17-5p的表达水平。利用miR-17-5p mimics或miR-17-5p inhibitor在胃癌细胞HGC-27和SGC-7901中进行转染,以完成miR-17-5p的过表达或敲降,同时通过CCK-8和EdU实验检测发现miR-17-5p可以促进胃癌细胞的增殖能力;在细胞划痕实验和transwell细胞迁移/侵袭实验中发现miR-17-5p可以促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力;通过Western Blot实验发现miR-17-5p可以促进EMT过程;通过流式细胞仪检测发现miR-17-5p可抑制胃癌细胞凋亡;然而通过共转染miR-17-5p mimics和pc DNA3.1RP11-7K24.3后可以逆转miR-17-5p对胃癌细胞增殖、迁移与侵袭的促进作用和对凋亡的抑制作用。与此同时,通过荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀实验证实了miR-17-5p与ZBTB4的结合关系。通过q RT-PCR和Western Blot检测到ZBTB4在胃癌细胞内明显低表达,过表达miR-17-5p可以抑制ZBTB4的表达,而过表达RP11-7K24.3可以促进ZBTB4的表达,表明RP11-7K24.3可以通过竞争性结合miR-17-5p,抑制miR-17-5p对ZBTB4的沉默作用。另外,通过CCK-8、EdU实验、细胞划痕实验、transwell细胞迁移/侵袭实验、Western Blot、流式细胞仪检测细胞凋亡实验等发现ZBTB4过表达后可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT过程,并促进胃癌细胞凋亡,但共转染miR-17-5p mimics后可以逆转ZBTB4单独过表达的调控功能。此外,我们通过Western Blot初步检测到RP11-7K24.3通过miR-17-5p/ZBTB4轴对下游转录因子Sp1、Sp3和Sp4的调控作用。系列实验结果表明RP11-7K24.3/miR-17-5p/ZBTB4轴可能参与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡过程,影响胃癌的发生与发展进程。
饶雪峰[6]（2021）在《miR-27a-3p靶向调控GATA6在胰腺导管腺癌侵袭转移中作用机制的体外研究》文中指出研究背景:胰腺癌具有高度致死性,5年生存率很低,它的特点是容易早期转移,快速浸润,并且对标准治疗容易产生耐药性。胰腺癌以胰腺导管腺癌为主,胰腺导管腺癌占90%以上。根治性手术切除是胰腺癌治疗成功主要手段,但是能被早期诊断出来的胰腺导管腺癌只有15-20%。大部分胰腺癌病人错过手术时机,被诊断出来时已经到了晚期或出现远处转移性。近年来,虽然对胰腺癌的治疗进行了很大的改进（包括化疗、放疗和分子靶向治疗等）,但是胰腺癌病人的5年存活率仍低于7%。过去的几十年里,尽管已阐明了与肿瘤发生有关的一些风险因素,在胰腺癌发展的分子机制上进展甚微。因此,明确提出参与胰腺癌进展的新型生物标志物对于提供早期诊断和开展有效治疗是必要的。微小RNA（miRNAs,miRs）是一类小分子无编码功能的RNA,通过与信使RNA（m RNA）的3′-非翻译区（UTR）直接作用,从而对基因的表达产生抑制作用。在过去的十年中研究显示miRNA在癌变过程中失调,它们与肿瘤的发生、转移和复发密切相关。miRNA异常表达与胰腺癌有密切的关系。例如,miR-10a-5p通过调节转录因子AP-2γ（AP2C）促进胰腺癌吉西他滨耐药。miR-148a通过靶向调控WNT10B从而抑制胰腺导管腺癌细胞从上皮向间质转化,以及抑制胰腺导管腺癌细胞侵袭。miR-337瞄准了Homeobox B7（HOXB7）抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖和侵袭。此外,miR-181b-5p、ETS原癌基因1（ETS1）和MET原癌基因（c-Met）信号通路的激活导致了胰腺癌病人很差的预后。miR-27a-3p是成熟miR-27a的亚型,位于人类19p13染色体上,并且发现其经常异常表达,并有助于各种类型的癌症进展。Wang等通过使用来自三个独立队列的Hi Seq 2000测序（健康控制、良性胰腺疾病和胰腺癌）,确定了可以通过联合检测血清CA199和外周血单核细胞的miR-27a-3p水平来鉴别胰腺良恶性肿瘤。最近,Silvestris等认为miR-27a-3p对胰腺癌产生重要的血管生成作用。然而,miR-27a-3p对胰腺癌产生的生物学作用和潜在机制仍有待阐明。目的:本研究将探讨miR-27a-3p在胰腺导管腺癌组织和细胞系中的表达水平,并研究miR-27a-3p在胰腺导管腺癌细胞的体外侵袭、迁移和血管生成中的生物学作用及机制:miR-27a-3p靶向调控GATA6表达,进一步激活VEGFA/VEGFR2信号通路,促进胰腺导管腺癌的侵袭、迁移和血管生成;为miR-27a-3p在胰腺导管腺癌靶向治疗中提供理论基础。方法:通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析胰腺导管腺癌组织和癌细胞系中miR-27a-3p、GATA6、VEGFA和VEGFR2的表达情况;用卡方检验分析胰腺导管腺癌病人临床病理特征与miR-27a-3p表达之间的关系;生物信息学分析和荧光素酶报告验证miR-27a-3p对GATA6的靶向调控机制;通过毛细管生成试验和侵袭试验及划痕试验测定肿瘤细胞血管生成和肿瘤细胞侵袭及迁移能力等。结果:在胰腺导管腺癌组织和癌细胞系中,miR-27a-3p表达明显上调（P<0.05）;高表达的miR-27a-3p与肿瘤大小、血管浸润、淋巴结转移和临床分期具有相关性（P<0.05）;高表达的miR-27a-3p与胰腺导管腺癌患者的不良预后具有相关性（P<0.05）。过表达miR-27a-3p降低了GATA6 3′-UTR-WT载体的相对荧光素酶活性（P<0.05）,但对GATA6 3′-UTR-MUT载体的荧光素酶活性没有影响;并且高表达的miR-27a-3p下调了胰腺导管腺癌细胞中GATA6的表达,上调了VEGFA和VEGFR2的表达（P<0.05）,以及增加了癌细胞体外迁移、侵袭能力和血管生成能力（P<0.05）。抑制miR-27a-3p增强了GATA6 3′-UTR-WT载体的相对荧光素酶活性（P<0.05）,但对GATA6 3′-UTR-MUT载体的荧光素酶活性没有影响;并且抑制miR-27a-3p上调了胰腺导管腺癌细胞中GATA6的表达,下调了VEGFA和VEGFR2的表达（P<0.05）,以及抑制了癌细胞体外迁移、侵袭能力和血管生成能力（P<0.05）;GATA6被确定为miR-27a-3p的功能靶基因;同时,在抑制miR-27a-3p的癌细胞中,沉默GATA6可部分逆转VEGFA和VEGFR2蛋白的表达水平,并部分逆转了抑制miR-27a-3p对胰腺导管腺癌细胞迁移、侵袭能力和血管生成能力的影响（P<0.05）。结论:在胰腺导管腺癌组织和癌细胞系中,miR-27a-3p表达明显上调,miR-27a-3p过表达预示着胰腺导管腺癌患者预后不良。miR-27a-3p靶向下调GATA6表达,进一步激活VEGFA/VEGFR2信号通路,促进胰腺导管腺癌的侵袭、迁移和血管生成;miR-27a-3p/GATA6/VEGFA/VEGFR2信号轴为胰腺导管腺癌侵袭转移的重要作用机制。这些表明了miR-27a-3p可作为临床预后检测指标,也可能是胰腺导管腺癌有希望的治疗靶标。
张铖[7]（2021）在《FOXF2转录调控LINC02532介导SOX7 mRNA稳定性调控胃癌进展的机制研究》文中研究指明目的:胃癌是世界范围内第五大最常见的肿瘤,同时也是第四大肿瘤死亡原因,患者预后相对较差,严重威胁着人类健康。其中,东亚地区占据着胃癌发病和死亡例数的主要部分,而每年近一半新发和死亡病例在中国。目前胃癌的诊断金标准为内镜检查,然而由于诊断费用高并且患者依从性较差,在中国诊断为早期胃癌的患者比例低于10%。早期胃癌患者的存活率超过了60%,而晚期胃癌存活率却低于24%。胃癌的发生和进展是由遗传学,表观遗传学和环境等多种因素共同作用的结果,其中,表观遗传学是近些年研究的热点,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及非编码RNA调控等。非编码RNA在胃癌等多种肿瘤中的重要调控作用已被证实,因此,探索非编码RNA调控机制有助于揭示胃癌发生发展规律以及发掘有效的胃癌诊断,治疗和预后管理生物标志物。研究发现,人类基因组序列中仅有较少部分基因具有编码蛋白的功能,而绝大部分的基因组序列没有编码蛋白的功能,而是转录后形成非编码转录本。其中的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是指长度大于200个核苷酸、不具备蛋白编码功能的长链RNA分子,已被证实可以参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。本研究旨在通过分析TCGA（The Cancer Genome Altas）数据库胃癌RNA-Seq数据,发掘异常表达的lncRNA基因。测序数据发现LINC02532在胃癌组织中的表达水平显着高于癌旁组织,且LINC02532高表达的胃癌患者预后较差。这些发现提示LINC02532有可能作为原癌基因促进胃癌的发生和发展,然而目前关于LINC02532在胃癌发生发展中的分子机制尚不清楚。因此,我们进一步通过体内、外实验,证实了FOXF2/LINC02532/SOX7轴在胃癌细胞迁移和侵袭调控中的作用。研究方法:通过分析TCGA数据库RNA-Seq和临床参数数据,选择异常高表达并且具有重要临床意义的lncRNA LINC02532进行深入研究。实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测LINC02532在胃癌细胞及组织水平的表达情况,并分析其临床病理意义。生物信息学的方法研究LINC02532的亚细胞定位情况和非编码功能,RNA荧光原位杂交技术证实LINC02532亚细胞分布情况。设计LINC02532过表达质粒和小干扰RNA（si RNA）,通过Transwell实验检测LINC02532过表达及沉默后对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。同时,通过裸鼠成瘤实验观察过表达LINC02532对胃癌细胞成瘤能力的影响。q RT-PCR和Western blot实验观察沉默LINC02532对上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关基因mRNA和蛋白水平的调控。以LINC02532表达中位数将TCGA胃癌病人分成两组,通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）探索LINC02532可能发挥的调控方式。q RT-PCR和Western blot实验检测胃癌组织水平FOXF2和SOX7表达,Pearson统计分析LINC02532分别与FOXF2和SOX7表达相关性。生物信息学工具预测FOXF2与LINC02532启动子区域转录结合位点以及LINC02532与SOX7 3’UTR区域结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证结合位点。应用放线菌素D药物处理胃癌细胞,观察沉默LINC02532表达后对SOX7降解速率的影响。然后,分别进行Transwell实验检测FOXF2/LINC02532轴以及LINC02532/SOX7轴对胃癌细胞迁移和侵袭能力的调控。结果:1.TCGA数据库表明LINC02532在胃癌组织中表达显着高于癌旁组织（P=0.001）,Kaplan-Meier生存分析表明LINC02532高表达病人预后显着差于低表达病人（log-rank P=0.003）,Cox回归分析发现LINC02532可以作为胃癌独立的预后因素。q RT-PCR实验证实LINC02532在胃癌细胞系（SGC-7901,MGC-803,AGS,MKN-45）和52对胃癌组织中表达异常升高。卡方检验分析52对胃癌组织LINC02532表达与临床病理参数关系,结果表明LINC02532高表达与高TNM分期（P=0.008）和低肿瘤分化程度（P=0.023）相关。2.沉默LINC02532表达减弱了胃癌细胞迁移和侵袭能力,而过表达LINC02532增强了胃癌细胞迁移和侵袭能力。过表达LINC02532的MGC-803细胞系可促进裸鼠成瘤能力的增强。LINC02532表达沉默处理胃癌细胞后可显着提高上皮型EMT标志物E-cadherin的mRNA和蛋白水平,而间质型EMT标志物N-cadherin、Vimentin和SLUG的mRNA和蛋白水平显着降低。3.GSEA结果表明LINC02532高表达与基础转录因子通路显着负相关（P=0.039）,Jaspar生物信息学网站预测发现转录因子FOXF2可以和LINC02532启动子区域结合。Pearson相关性分析发现胃癌组织中FOXF2表达与LINC02532呈负相关,且FOXF2表达沉默可显着提高LINC02532的表达。荧光素酶报告基因实验证实了FOXF2对于LINC02532的负调控作用。细胞功能实验结果显示FOXF2可以通过负调控LINC02532影响胃癌细胞迁移和侵袭能力。4.上述GSEA结果同时也表明LINC02532高表达与RNA降解通路显着正相关（P=0.027）,Inta RNA网站预测发现LINC02532与SOX7 mRNA的3’UTR区域结合。RNA荧光原位杂交实验表明LINC02532主要定位于细胞质中,提示LINC02532主要在细胞质发挥作用。Pearson相关性分析提示胃癌组织中LINC02532水平与SOX7呈负相关,且沉默表达LINC02532可显着提高SOX7的表达量。双荧光素酶报告基因实验证实了LINC02532与SOX7 mRNA的3’UTR区域结合。放线菌素D药物实验发现沉默表达LINC02532后SOX7降解速率显着低于阴性对照组。细胞功能实验表明LINC02532可以负调控SOX7参与调节胃癌细胞迁移和侵袭的能力。结论:1.LINC02532在胃癌细胞系和组织水平表达均异常升高,可以促进胃癌细胞的迁移和侵袭,并且参与调控EMT相关标志物的表达。2.LINC02532的表达与胃癌TNM分期和分化程度显着相关,可以作为胃癌独立的预后因素,用于预测胃癌患者1年,2年和3年生存率。3.FOXF2低表达减弱了对LINC02532的转录抑制作用而引起LINC02532异常高表达,FOXF2通过转录调控LINC02532参与调控胃癌细胞迁移和侵袭能力。4.LINC02532通过与SOX7 mRNA的3’UTR区域结合促进其降解和表达减少,同时参与胃癌细胞迁移和侵袭能力的调控。
孙丹[8]（2021）在《Hsa＿circ＿001988/miR-197-3p/FBXW7轴对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制研究》文中指出目的:随着RNA测序和生物信息学技术的发展,环状RNA已被证实在人类细胞中具有多种功能。许多研究报道了环状RNA在胃癌中的表达谱发现其在调控细胞功能方面具有潜在的价值,并在胃癌的发生和发展过程中发挥重要作用。Hsa＿circ＿001988作为环状RNA,已有文献报道其参与结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和肾透明细胞癌的调控。但hsa＿circ＿001988在胃癌中的作用尚无报道。此外,更多的证据表明环状RNA通过海绵吸附miRNA,进而调控下游靶基因从而发挥其促进肿瘤发生发展的作用。本研究拟探索hsa＿circ＿001988在胃癌组织及细胞系中的表达情况,分析其与胃癌患者临床病理因素间的关系,探究其在体内、外对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。另外,利用生物信息学软件,我们预测了可能与hsa＿circ＿001988相互作用的RNA结合蛋白U2AF65和EIF4A3,可能靶向结合的miR-197-3p及其下游靶基因FBXW7。通过一系列实验探索并阐明U2AF65和EIF4A3介导hsa＿circ＿001988通过海绵吸附miR-197-3p发挥其抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法:1.收集341例中国医科大学肿瘤外科手术切除的胃癌组织（经术后病理确认）及其远癌正常胃粘膜新鲜标本组织。采用实时定量PCR法检测hsa＿circ＿001988在胃癌组织及其配对正常胃粘膜组织,胃癌细胞系中的表达。分析hsa＿circ＿001988与胃癌患者临床病理因素间的关系。2.脂质体转染法将高表达hsa＿circ＿001988和空载体质粒转染BGC823细胞系,G418压力筛选后构建稳转细胞株;si RNA干扰AGS细胞中hsa＿circ＿001988的表达,q RT-PCR法验证敲减效率;分别采用CCK-8实验、克隆形成实验、流式细胞术、划痕愈合实验和Transwell迁移、侵袭实验评估不同hsa＿circ＿001988表达水平对胃癌细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期分布情况、细胞迁移与侵袭能力的影响。在过表达hsa＿circ＿001988后,重复上述实验并采用裸鼠皮下成瘤实验对裸鼠皮下移植瘤的生长情况进行评估。3.实时定量PCR法检测miR-197-3p和FBXW7在33例胃癌组织及其匹配的正常胃粘膜组织中的表达,分析miR-197-3p、FBXW7和hsa＿circ＿001988表达的相关性关系;实时定量PCR法检测CCDC6在69例胃癌组织及其匹配的正常胃粘膜组织中的表达;应用KMPLOT网站评估GEO数据库中FBXW7和CCDC6对631例胃癌患者预后的影响;实时定量PCR法检测hsa＿circ＿001988不同表达水平对miR-197-3p、FBXW7、CCDC6mRNA表达的影响;Western Blot法检测hsa＿circ＿001988不同表达水平对Cyclin D1、YAP1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达的影响。4.实时定量PCR法和Western Blot检测hsa＿circ＿001988上游RNA结合蛋白U2AF65在33例胃癌组织及其配对正常胃粘膜中的mRNA和蛋白表达;应用Human Protein Atlas数据库分析U2AF65对TCGA数据库中354胃癌患者预后的影响;RIP实验检测U2AF65和EIF4A3与hsa＿circ＿001988是否存在结合作用关系;进一步采用si RNA分别干扰AGS和BGC823细胞系中U2AF65和EIF4A3的表达,q RT-PCR法检测U2AF65和EIF4A3敲减对hsa＿circ＿001988表达的影响。结果:1.Hsa＿circ＿001988在胃癌组织中的表达水平显着低于其在正常胃粘膜组织中的表达水平（P<0.001）,且Hsa＿circ＿001988低表达与胃癌患者WHO组织学分型、Lauren分型和肿瘤浸润深度密切相关（P<0.05）;根据hsa＿circ＿001988的表达建立ROC曲线进行分析,结果显示ROC曲线下面积为0.708,敏感度和特异度分别为0.716和0.566。与人永生化正常胃粘膜细胞系GES-1细胞相比,hsa＿circ＿001988在胃癌细胞系中的表达显着下降,在AGS细胞系中表达最高,在BGC823细胞系表达最低。2.q RT-PCR法检测验证成功构建hsa＿circ＿001988稳定高表达的BGC823胃癌细胞系,si RNA成功敲减AGS细胞系中hsa＿circ＿001988的表达;敲减hsa＿circ＿001988表达后,CCK8结果示AGS细胞增殖能力明显增强;克隆形成实验结果示AGS细胞集落形成能力明显增强;流式细胞术检测结果示AGS细胞G0/G1期比例减少;划痕愈合实验结果示AGS细胞迁移能力明显增强;Transwell迁移和侵袭实验结果示AGS细胞迁移和侵袭能力明显增强;而在BGC823细胞中过表达hsa＿circ＿001988后作用相反,且体内实验表明BGC823过表达hsa＿circ＿001988后,裸鼠皮下成瘤能力明显减弱。3.与正常胃粘膜组织相比,miR-197-3p在33例胃癌组织的表达水平显着升高,而FBXW7在33例胃癌组织中的表达水平显着降低;另外,miR-197-3p在胃癌组织的表达水平与hsa＿circ＿001988、FBXW7的表达呈负相关关系;而FBXW7在胃癌组织的表达水平与hsa＿circ＿001988的表达呈正相关关系。4.CCDC6在69例胃癌组织中的表达水平显着低于其在正常胃粘膜组织中的表达水平。KMPLOT数据库显示GEO数据库中386例FBXW7高表达组的胃癌患者总生存中位时间（65个月）显着高于245例FBXW7低表达组（34.1个月,P=0.0041）。303例FBXW7高表达组的胃癌患者首次进展中位时间（49.47个月）较219例FBXW7低表达组明显延长（23.2个月,P=0.01）。265例CCDC6高表达组的胃癌患者总生存中位时间（100.8个月）显着高于366例CCDC6低表达组（31.2个月,P=2.7e-06）。239例CCDC6高表达组的胃癌患者首次进展中位时间（12.31个月）较283例CCDC6低表达组明显延长（8.4个月,P=5.4e-06）。5.AGS胃癌细胞系敲减hsa＿circ＿001988后,miR-197-3p表达显着升高,而下游FBXW7和CCDC6 mRNA表达显着降低;BGC823细胞稳定过表达hsa＿circ＿001988后miR-197-3p表达明显降低,而下游FBXW7和CCDC6 mRNA表达明显增加。6.AGS胃癌细胞系敲减hsa＿circ＿001988后,Cyclin D1,YAP1,Vimentin和N-cadherin蛋白表达显着升高,E-cadherin蛋白表达显着降低;BGC823胃癌细胞系稳定过表达hsa＿circ＿001988后,Cyclin D1、YAP1、Vimentin和N-cadherin蛋白表达明显降低,E-cadherin蛋白表达明显升高。7.与正常胃粘膜组织相比,U2AF65在胃癌组织中的mRNA和蛋白表达均显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。Human Protein Atlas数据库分析结果显示,TCGA数据库所提供354例胃癌患者中,91例U2AF65低表达的胃癌患者5年生存率明显差于263例U2AF65高表达胃癌患者,Log rank生存分析（P=4.80e-2）。RIP实验结果显示U2AF65和EIF4A3对hsa＿circ＿001988有富集作用,富集倍数分别为8.691±0.796和12.74±1.795,。在AGS和BGC823细胞中敲减U2AF65和EIF4A3的表达能够使hsa＿circ＿001988的表达显着降低。结论:1.Hsa＿circ＿001988在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达显着低于其在正常胃粘膜组织和人永生化正常胃粘膜细胞系的表达,其表达与胃癌患者WHO组织学分型、Lauren分型和肿瘤浸润深度密切相关,且对胃癌诊断有一定潜在价值。2.Hsa＿circ＿001988表达下调能显着促进胃癌细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,并使细胞周期G0/G1比例显着减少;上调hsa＿circ＿001988表达能够抑制胃癌细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,且抑制裸鼠皮下成瘤生长,提示hsa＿circ＿001988在胃癌中可能发挥抑癌基因的作用。3.Hsa＿circ＿001988可能通过海绵吸附miR-197-3p促进FBXW7的表达,并进一步调控下游CCDC6、Cyclin D1、YAP1、EMT通路关键蛋白E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白表达,从而发挥其抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。4.U2AF65在胃癌组织中显着低表达发挥抑癌基因作用,且U2AF65低表达与胃癌患者的不良预后密切相关。U2AF65和EIF4A3作为RNA结合蛋白,能够富集并促进hsa＿circ＿001988的环化和表达,从而在胃癌演进过程中发挥调控作用。
王贺雷[9]（2021）在《磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）参与调控胃癌淋巴结转移的分子机制研究》文中研究说明目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,疾病进展快,恶性程度高,其发病率位居全球癌症发病率的第5位,而其死亡率达到了第3位。胃癌发病缺乏早期临床表现,确诊时往往处于TNM分期的III期或者IV期,而且这些病人中大多数伴有区域性淋巴结转移。手术是目前治疗胃癌的主要治疗方法,还有放疗、化疗等治疗方法,但晚期胃癌患者的整体预后仍然较差。临床研究表明,肿瘤细胞的侵袭和迁移是胃癌高死亡率的关键原因,但胃癌侵袭和转移的分子基础仍不清楚。因此,探索胃癌转移的机制,找到有效地预测胃癌淋巴结转移的分子标志物,以提高胃癌诊断水平和开发更有效的生物靶向药物是当务之急。我们实验的目的是筛选出参与胃癌淋巴结转移机制的关键基因,明确其对胃癌细胞侵袭转移的影响及具体作用机制,为中晚期胃癌的治疗提供新的治疗靶点,从而帮助改善胃癌病人的预后。研究方法:本研究以人胃癌原位组织（Cancer in situ,CIS）和淋巴结转移组织（Lymph node metastasis,LNM）为标本,通过显微切割技术和高通量RNA测序技术,检测3例胃癌合并淋巴结转移病人的CIS组织和LNM组织的mRNA表达谱,筛选出差异表达的一些基因,利用q-PCR的方法验证差异基因,从中选定在LNM组织中明显上调的磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）,做进一步深入研究,明确其对胃癌细胞侵袭转移的影响及具体作用机制。在接下来的研究中,我们在56例临床样本中,利用免疫组化的方法验证PGAM1在CIS组织、癌旁组织及LNM组织中的表达差异,同时验证PGAM1在患者预后情况中的表达差异。在细胞水平,通过慢病毒载体构建稳定敲低PGAM1的胃癌细胞系SGC7901和BGC823,并通过Western-blot的方法验证敲低效率。成功敲低PGAM1后,利用CCK-8检测SGC7901和BGC823细胞增殖的变化;通过流式细胞仪检测SGC7901和BGC823细胞周期和早期凋亡的变化;通过划痕实验和Transwell检测SGC7901和BGC823细胞迁移和侵袭的变化。接着,我们建立了小鼠皮下荷瘤模型,进一步检测两种PGAM1基因敲低的胃癌细胞系的成瘤情况。最后,为了进一步研究PGAM1调控胃癌淋巴结转的具体机制,利用Western Blot的方法明确了参与PGAM1相关转移过程的潜在关键信号蛋白,以及PGAM1与Src/FAK/Paxillin信号转导通路的调控关系。结果:在本研究中,高通量RNA测序结果显示,与胃癌患者的CIS组织相比,PGAM1在LNM组织中显着高表达,且与患者预后不良相关。同样,定量PCR实验和免疫组化实验的结果证实了胃癌患者淋巴结转移中PGAM1呈高表达。为了阐明PGAM1在胃癌转移中的作用,我们在转移性胃癌细胞株SGC7901和非转移性胃癌细胞株BGC823中敲低PGAM1后,发现PGAM1敲低使细胞增殖受到损害,细胞周期出现停滞。此外,PGAM1敲低抑制胃癌细胞系的迁移,这与降低表达金属蛋白酶MMP2,MMP9和粘附分子ICAM-1有关。在小鼠异种移植模型中,PGAM1敲低的胃癌细胞在体内生长能力下降。Western Blot分析结果表明,相对于亲本细胞系,SGC7901和BGC823中PGAM1的敲低降低了Src、FAK和Paxillin的磷酸化。这些结果表明PGAM1可能通过Src/FAK/Paxillin信号转导通路驱动细胞增殖、激活细胞骨架重组和细胞迁移,从而在促进胃癌淋巴结转移中发挥重要作用。结论:1.PGAM1与胃癌预后相关:在伴有淋巴结转移的胃癌患者中,PGAM1在LNM组织中的表达要明显高于CIS组织。PGAM1在LNM组织中的高表达是胃癌预后不良的独立危险因素;2.PGAM1与胃癌细胞的增殖密切相关:敲低PGAM1后,胃癌细胞增殖速度减慢,细胞发生G1阻滞;3.PGAM1能调控胃癌细胞侵袭和转移:敲低PGAM1后,胃癌细胞的迁移速率降低,金属蛋白酶MMP2、MMP9以及粘附分子ICAM-1的表达降低,Src/FAK/Paxillin信号转导抑制,表明PGAM1能够通过调控胃癌细胞侵袭和转移密切相关蛋白的表达及相关通路活化,促进胃癌细胞的侵袭和转移。
赵江桥[10]（2021）在《LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究旨在分析lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的表达情况及与患者预后的关系,探究lncRNA LIFR-AS1对胃癌的影响及其参与的分子机制,为临床诊断、治疗及预后评估胃癌提供可靠的理论基础和新的方向。方法:1.通过RNA-seq测序分析,发现在胃癌中存在lncRNA LIFR-AS1表达的下调;通过样本表达分析,进一步证明lncRNA LIFR-AS1在数据库胃癌样本、胃癌组织和细胞系中的表达变化。2.研究lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的功能分析,主要通过过表达lncRNA LIFR-AS1分析lncRNA LIFR-AS1表达对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和肿瘤形成的影响。3.通过分子生物学、细胞生物学等手段探究lncRNA LIFR-AS1对胃癌作用的具体机制。结果:1.为了鉴定胃癌中的基因差异表达谱,我们对4组胃癌组织及其相应的癌旁组织进行了组织微阵列分析（tissue microarray analysis）,结果与癌旁组织相比,发现lncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈低表达;此外,我们还发现miR-4698、Cdc25B、CD133、SOX2、NANOG、ER等基因在胃癌中呈高表达。为了进一步证明我们测序结果的可靠性,我们通过qPCR进一步检测了胃癌组织及对应的癌旁组织中这些基因在RNA水平的表达变化,结果发现与测序结果一致,lncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈低表达,miR-4698、Cdc25B、CD133、SOX2、NANOG、ER等基因在胃癌中呈高表达。这些结果表明胃组织从正常状态转变为具有侵袭性的恶性胃癌不仅存在编码蛋白基因的改变,也存在大量非编码RNA（lncRNA、miRNA）的改变,其中lncRNA LIFR-AS1的变化尤为明显。接下来,我们将以lncRNA LIFR-AS1为重点研究对象,探讨该lncRNA对胃癌发生和发展的意义及具体的分子机制。为了研究lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的生物学作用,我们从TCGA中获取正常和肿瘤组织的基因表达数据,通过分析,我们发现与正常组织相比,lncRNA LIFR-AS1在胃癌组织表达下调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。利用RT-qPCR检测了lncRNA LIFR-AS1在41个GC组织和邻近组织中的表达情况,结果发现lncRNA LIFR-AS1在GC组织的确呈低表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。我们还进一步分析了lncRNA LIFR-AS1表达与胃癌临床特征的关系,结果发现,lncRNA LIFR-AS1在分化更低、恶性程度更高、淋巴转移更明显的胃癌组织中下调更为明显,且差异具有统计学意义（P<0.05）。之后,我们利用TCGA数据库分析了lncRNA LIFR-AS1表达与胃癌患者总体生存时间的关系。结果发现,lncRNA LIFR-AS1高表达的患者总体生存时间显着高于lncRNA LIFR-AS1低表达的胃癌患者,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,我们还分析了lncRNA LIFR-AS1在人正常胃粘膜细胞GES-1和胃癌细胞系（MKN45和AGS）中的表达情况,结果发现,lncRNA LIFR-AS1在MKN45和AGS细胞中的表达低于GES-1细胞,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明lncRNA LIFR-AS1的表达与胃癌的发生和发展呈负相关,lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌的进展。2.通过Lipofectamine（?）3000转染法将lncRNA LIFR-AS1转染到胃癌细胞MKN45和AGS中,通过qPCR检测lncRNA LIFR-AS1的表达情况。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1转染后在MKN45和AGS中的表达显着上调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。接下来,我们将用这两株过表达了lncRNA LIFR-AS1的胃癌细胞株进行增殖、凋亡、侵袭、转移以及肿瘤形成等细胞生物学功能的检测。我们利用CCK-8和Ed U试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS增殖的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的增殖,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的增殖。我们利用克隆形成试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS克隆形成的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞克隆的形成,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的克隆形成。我们利用流式细胞技术检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS凋亡的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着促进胃癌细胞的凋亡,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够促进胃癌细胞的凋亡。我们利用Transwell试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS侵袭的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的侵袭,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的侵袭。我们利用细胞划痕试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS迁移的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的迁移,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的迁移。我们利用裸鼠皮下成瘤模型检测lncRNA LIFR-AS1表达对MKN45细胞肿瘤形成的影响,利用Tunel染色法检测肿瘤中细胞的凋亡情况,利用Ki67染色法检测肿瘤中细胞的增殖情况。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制MKN45细胞肿瘤的形成,并且lncRNA LIFR-AS1过表达后肿瘤细胞Ki67信号明显减弱,Tunel信号显着增强,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌细胞肿瘤的形成,抑制胃癌细胞的增殖,促进胃癌细胞的凋亡。3.我们预测miR-4698在lncRNA LIFR-AS1中的预结合位点。为了验证lncRNA LIFR-AS1和miR-4698预测的序列结合位点,我们进行了荧光素酶报告基因检测,进一步确认它们之间的关联。结果显示,转染LIFR-AS1-WT和miR-4698模拟物后,MKN45和AGS细胞的荧光素酶活性降低,且差异具有统计学意义（P<0.05）。值得注意的是,过表达lncRNA LIFR-AS1降低了miR-4698在MKN45和AGS细胞中的表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,与正常组织和细胞相比,miR-4698在胃癌组织和胃癌细胞系中表达上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关检验显示,lncRNA LIFR-AS1与miR-4698呈负相关。以上结果表明,lncRNA LIFR-AS1与miR-4698之间存在负相关,lncRNA LIFR-AS1可能通过下调miR-4698抑制胃癌的发生。Target Scan揭示MTUS1的3’-UTR包含miR-4698的互补区域。用miR-4698模拟物和MTUS1-WT或MTUS1-MUT片段共转染后,评估荧光素酶活性的变化。结果显示miR-4698模拟物和MTUS1-WT共转染的细胞荧光素酶活性受到抑制,且差异具有统计学意义（P<0.05）。miR-4698过表达和抑制载体（miR-4698模拟物和miR-4698抑制剂）转染胃癌细胞后,监测miR-4698和MTUS1之间的相关性。miR-4698模拟物转染细胞后miR-4698表达明显增强,miR-4698抑制剂转染细胞则抑制miR-4698的表达。Western-blot结果显示,miR-4698过表达可抑制MTUS1表达,miR-4698抑制则可增加MTUS1表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,通过qPCR检测,我们发现与正常组织和细胞相比,MTUS1在胃癌组织和胃癌细胞系（MKN45和AGS）中表达下调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关检验进一步证实了MTUS1与miR-4698之间存在负相关关系,MTUS1与lncRNA LIFR-AS1之间存在正相关关系。以上结果表明,MTUS1是miR-4698新的潜在靶基因,同时也受到lncRNA LIFR-AS1的正向调控。用pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1表达载体转染细胞,进而探索下游相关信号通路的改变。值得注意的是,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够显着抑制胃癌细胞系（MKN45和AGS）中MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。接下来,我们利用si-MTUS1载体转染胃癌细胞抑制MTUS1表达,探讨lncRNA LIFR-AS1与MTUS1的关系。结果发现,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够显着上调胃癌细胞系MKN45和AGS细胞中MTUS1的表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。相比之下,抑制MTUS1的表达能够显着增加MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1共转染后,si-MTUS1逆转了胃癌细胞系（MKN45和AGS）中MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明,在胃癌细胞中过表达的lncRNA LIFR-AS1能够通过上调MTUS1抑制MEK/ERK信号通路的激活。本研究还发现,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdc25B的表达。与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达可促进胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdk1的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1共转染后si-MTUS1逆转了胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdc25B的表达抑制和Cdk1的磷酸化诱导。以上结果表明,lncRNA LIFR-AS1可能通过抑制Cdc25B活性促进Cdk1的磷酸化。我们通过Western-blot和免疫组化分析了lncRNA LIFR-AS1表达对MKN45形成的肿瘤组织中MEK/ERK信号通路活性的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达不仅能够促进MTUS1的表达,还能抑制MEK和ERK的磷酸化,这进一步表明lncRNA LIFR-AS1通过上调MTUS1抑制MEK/ERK信号通路的激活。结论:LncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈异常低表达,且与患者的预后有关。在胃癌中,lncRNA LIFR-AS1通过下调miR-4698、上调MTUS1而抑制MEK/ERK信号通路的激活,促进细胞的凋亡,抑制细胞的增殖、侵袭和转移以及肿瘤的形成。因此,lncRNA LIFR-AS1可以作为胃癌治疗的潜在靶点。
二、胃癌侵袭转移及预后的标志物（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胃癌侵袭转移及预后的标志物（论文提纲范文）
（1）FNDC1促进胃癌侵袭及腹膜转移的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 生信分析筛选胃癌腹膜转移相关基因FNDC1 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 FNDC1 在胃癌中的表达水平及与预后的关系 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 FNDC1 对人胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5. 结论 |
| 第四部分 FNDC1 基因促进胃癌细胞 EMT 的机制研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 全文总结 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 胃癌腹膜转移的诊治进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CircRNAS的分类和特征 |
| 1.2.1 circRNAs的分类和生物发生 |
| 1.2.2 circRNAs的特征 |
| 1.3 CIRCRNAS在胃癌中的作用机制和生物学功能 |
| 1.3.1 胃癌中circRNAs的表达概况 |
| 1.3.2 circRNAs在胃癌中的作用机制 |
| 1.3.3 circRNAs对胃癌细胞生物学功能的影响 |
| 1.3.4 circRNAs在 GC中发挥作用的信号通路 |
| 1.3.5 外泌体circRNAs在 GC中的功能 |
| 1.3.6 circRNAs研究的公共数据库 |
| 1.4 CircRNAS在胃癌中的应用 |
| 1.4.1 circRNAs作为胃癌的生物标志物 |
| 1.4.2 circRNAs作为GC治疗靶点 |
| 1.4.3 外泌体circRNAs在 GC诊断和治疗中的应用价值 |
| 1.5 问题和展望 |
| 第2章 胃癌中差异表达的CIRCRNAS |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 患者和样本收集 |
| 2.2.2 细胞 |
| 2.2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分离外泌体 |
| 2.3.2 透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态 |
| 2.3.3 Western blot检测外泌体标志物 |
| 2.3.4 提取外泌体RNA |
| 2.3.5 RNA文库构建和测序 |
| 2.3.6 鉴定差异表达的circRNA |
| 2.3.7 GO(Gene ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome)分析 |
| 2.3.8 逆转录实时定量 PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 血浆外泌体的分离和鉴定 |
| 2.4.2 GC患者血浆外泌体中差异表达的circRNA |
| 2.4.3 DE circRNA的 GO和 KEGG富集 |
| 2.4.4 RT-qPCR验证DE circRNA的表达 |
| 2.4.5 GC患者血浆外泌体中hsa_circ_0014606 的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中发挥促癌作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 hsa_circ_0014606 序列分析 |
| 3.3.2 慢病毒包装和感染 |
| 3.3.3 GC细胞增殖实验 |
| 3.3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.3.5 划痕愈合实验 |
| 3.3.6 Transwell实验 |
| 3.3.7 THP-1 细胞分化和极化实验 |
| 3.3.8 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 hsa_circ_0014606 的亲本基因和剪接结构 |
| 3.4.2 hsa_circ_0014606在GC细胞中的过表达和敲减 |
| 3.4.3 过表达hsa_circ_0014606 促进GC细胞增殖和存活 |
| 3.4.4 hsa_circ_0014606 促进GC细胞迁移和侵袭 |
| 3.4.5 外泌体hsa_circ_0014606 促进THP-1 细胞向M2 巨噬细胞方向极化 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中的作用靶标 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞和实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 靶标miRNA和 mRNA预测 |
| 4.3.2 RT-qPCR |
| 4.3.3 荧光素酶报告实验 |
| 4.3.4 NCG小鼠体内成瘤实验 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 预测的靶标miRNA |
| 4.4.2 hsa_circ_0014606 对候选靶标miRNA表达水平的影响 |
| 4.4.3 hsa_circ_0014606 可与miRNA-194-5p直接结合 |
| 4.4.4 YAP1是miRNA-194-5p的靶基因 |
| 4.4.5 hsa_circ_0014606 促进GC细胞NCD小鼠体内成瘤 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）内皮型一氧化氮合酶影响胃癌腹膜转移的机制及其作为胃癌治疗靶点的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于泛癌症分析研究NOS3在胃癌中的表达及临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 TCGA、GTEx及GEO数据集的下载 |
| 2.2.2 分析NOS3在肿瘤和正常组织中的差异表达 |
| 2.2.3 NOS3表达和临床表型分析 |
| 2.2.4 细胞系中NOS3表达 |
| 2.2.5 胃癌患者病例收集 |
| 2.2.6 免疫组化染色 |
| 2.2.7 免疫组化染色结果评估 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 NOS3 mRNA在癌组织和正常组织中的表达水平 |
| 3.2 NOS3 mRNA在癌细胞系中的表达水平 |
| 3.3 NOS3在癌组织及正常组织中差异表达分析 |
| 3.4 NOS3 mRNA表达与临床表型之间的关联 |
| 3.5 生物信息学分析NOS3在胃癌中的临床意义 |
| 3.6 胃癌患者病理组织中NOS3的临床意义 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:NOS3在胃癌腹膜转移过程中的作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MKN-45P细胞系的建立 |
| 2.2.3 siRNA转染 |
| 2.2.4 伤口愈合实验 |
| 2.2.5 Transwell实验检测细胞迁移能力 |
| 2.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力 |
| 2.2.7 粘附实验 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 GSEA分析 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 敲低NOS3表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.2 抑制NOS3表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 3.3 生物信息学分析胃癌中NOS3表达相关通路 |
| 3.4 胃癌细胞中干预NOS3表达对MAPK通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌腹膜转移的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT实验 |
| 2.2.3 伤口愈合实验、粘附实验、Transwell实验和western实验 |
| 2.2.4 集落形成实验 |
| 2.2.5 胃癌腹膜转移模型构建 |
| 2.2.6 免疫组化实验 |
| 2.2.7 分子对接 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 蟾毒灵是以NOS3为靶点的抗肿瘤药物 |
| 3.2 蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌细胞的恶性生物学行为的影响 |
| 3.3 动物实验证实蟾毒灵抑制NOS3活性对胃癌腹膜转移的作用 |
| 3.4 蟾毒灵抑制NOS3活性对其下游信号的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 上皮间充质转化与肿瘤腹膜转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 恶性黑色素瘤的流行病学特点及治疗现状 |
| 1.1.2 恶性黑色素瘤分子缺陷的研究进展 |
| 1.1.3 恶性黑色素瘤生物标志物的研究进展 |
| 1.1.4 肿瘤微环境的研究进展 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 生物信息学方法 |
| 1.4.2 计算结果的独立数据集验证 |
| 1.4.3 分子生物学实验功能验证 |
| 1.5 技术路线图 |
| 参考文献 |
| 第二章 恶性黑色素瘤Bulk转录组测序数据分析 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 生物信息学与肿瘤治疗研究 |
| 2.1.2 技术路线图 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 数据来源和分类 |
| 2.2.2 数据预处理和数据质量标准化 |
| 2.2.3 差异基因分析 |
| 2.2.4 基因标志物的Cox风险比例回归分析 |
| 2.2.5 构建基因标志物预后风险模型 |
| 2.2.6 基因标志物通路和功能分析 |
| 2.2.7 反卷积网络重构恶性黑色素瘤的免疫微环境 |
| 2.2.8 预后基因标志物与肿瘤免疫浸润细胞的相关性分析 |
| 2.2.9 恶性黑色素瘤中突变基因分布统计 |
| 2.2.10 肿瘤突变负荷分数的计算和预后分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 患者人口统计学和临床因素 |
| 2.3.2 差异基因与免疫相关基因的识别 |
| 2.3.3 建立免疫相关基因的风险模型 |
| 2.3.4 评估预后模型的预测效果 |
| 2.3.5 基因本体分析与KEGG通路分析 |
| 2.3.6 原发和转移病例样本中肿瘤浸润免疫细胞的差异 |
| 2.3.7 基因标志物与肿瘤免疫微环境的相关性分析 |
| 2.3.8 GEO队列独立数据集验证模型的预后 |
| 2.3.9 GEO队列中恶性黑色素瘤验证集的免疫分析 |
| 2.3.10 评估低危和高危人群之间的免疫情况 |
| 2.3.11 评估基于CD274/PDCD1 转移亚组肿瘤微环境的差异 |
| 2.3.12 MM中的突变图谱 |
| 2.3.13 TMB对恶性黑色素瘤预后的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 恶性黑色素瘤单细胞转录组测序数据验证 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 数据来源 |
| 3.2.2 关键软件及数据库资源 |
| 3.2.3 质控:细胞的选择和过滤 |
| 3.2.4 数据标准化 |
| 3.2.5 识别高变异基因 |
| 3.2.6 中心化(Scaling)分析 |
| 3.2.7 主成分(PCA)分析 |
| 3.2.8 非线性降维(t-SNE) |
| 3.2.9 寻找差异表达的特征(聚类生物标志物) |
| 3.2.10 注释cluster中细胞类型 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 质控和细胞群分类 |
| 3.3.2 数据标准化 |
| 3.3.3 质控和细胞群分类 |
| 3.3.4 PCA降维并提取主成分分析 |
| 3.3.5 T-SNE聚类分析和marker基因 |
| 3.3.6 寻找差异表达的特征 |
| 3.3.7 细胞类型鉴定 |
| 3.3.8 基因标志物与肿瘤浸润免疫细胞的相关性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 HPA数据库基因标志物的免疫组化分析 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.1.1 人类蛋白质图谱网站数据对基因标志物的验证 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 数据来源与下载 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 蛋白SLPI的免疫组化特征 |
| 4.3.2 蛋白LYZ的免疫组化特征 |
| 4.3.3 蛋白CD79A的免疫组化特征 |
| 4.3.4 蛋白CCL19 的免疫组化特征 |
| 4.3.5 蛋白S100A7 的免疫组化特征 |
| 4.3.6 蛋白CXCR4 对泛癌的预后的meta分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 CXCR4促进 A375细胞的侵袭和转移的实验研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验试剂与实验仪器 |
| 5.2.2 仪器和设备 |
| 5.2.3 细胞株选择 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 Cas9敲除实验 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 构建CXCR4 敲除细胞系模型 |
| 5.4.2 实时荧光定量PCR检测A375细胞CXCR4 mRNA表达 |
| 5.4.3 CXCR4 能够促进A375 细胞克隆集落形成 |
| 5.4.4 CXCR4对A375细胞划痕实验的影响 |
| 5.4.5 CXCR4增强A375细胞转移和侵袭能力 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 附录一 CIBERSORTx计算结果(TCGA) |
| 附录二 CIBERSORTx计算结果(GSE19234,GSE53118) |
| 附录三 28 个差异基因的筛选结果 |
| 附录四 相关性分析结果(Primary Samples) |
| 附录五 相关性分析结果(Metastasis Samples) |
| 附录六 相关性分析结果(GSE19234) |
| 附录七 相关性分析结果(GSE72056) |
| 附录八 缩略语表(Abbreviation) |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）长链非编码RNA RP11-7K24.3通过miR-17-5p/ZBTB4轴对胃癌发生发展的调控作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 胃癌的最新研究进展 |
| 1.1.1 胃癌的流行病学现状 |
| 1.1.2 胃癌分子表达谱的研究进展 |
| 1.2 lncRNA的分子特征与生物功能 |
| 1.2.1 lncRNA的分类 |
| 1.2.2 lncRNA的作用模式 |
| 1.2.3 lncRNA的生物功能 |
| 1.3 lncRNA在胃癌中的研究意义 |
| 1.3.1 lncRNA与胃癌的早期诊断 |
| 1.3.2 lncRNA与胃癌的进展与转移 |
| 1.3.3 lncRNA与胃癌的预后判断 |
| 第2章 胃癌中lncRNA/miRNA/mRNA共调控网络的构建及关键lncRNA的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 胃癌中差异表达lncRNA、miRNA及mRNA的表达谱分析 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 胃癌中lncRNA/miRNA/mRNA共调控网络的构建及生物功能分析 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 关键lncRNA的筛选及初步验证 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 RP11-7K24.3在胃癌中的生物学功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 RP11-7K24.3在胃癌中的表达验证及亚细胞定位 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 过表达RP11-7K24.3抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭,并促进胃癌细胞凋亡 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 过表达RP11-7K24.3抑制胃癌小鼠模型肿瘤生长 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 RP11-7K24.3调控胃癌发生发展的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 RP11-7K24.3通过miR-17-5p调控胃癌的发生与发展 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 RP11-7K24.3通过竞争性结合miR-17-5p调控ZBTB4的表达 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 miR-17-5p通过ZBTB4调控胃癌的发生与发展 |
| 4.4.1 实验材料 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）miR-27a-3p靶向调控GATA6在胰腺导管腺癌侵袭转移中作用机制的体外研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胰腺导管腺癌概述 |
| 1.2 mi R-27a-3p概述 |
| 1.3 GATA6 概述 |
| 第2章 mi R-27a-3p在胰腺导管腺癌中表达 |
| 2.1 摘要 |
| 2.2 前言 |
| 2.3 材料和方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 结论 |
| 第3章 mi R-27a-3p促进胰腺导管腺癌细胞体外侵袭和迁移及血管生成 |
| 3.1 摘要 |
| 3.2 前言 |
| 3.3 材料和方法 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 结论 |
| 第4章 mi R-27a-3p靶向下调GATA6 |
| 4.1 摘要 |
| 4.2 前言 |
| 4.3 材料和方法 |
| 4.4 统计分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 结论 |
| 第5章 mi R-27a-3p/GATA6/VEGFA/VEGFR2 信号轴在胰腺导管腺癌细胞的侵袭、迁移和血管生成起重要作用 |
| 5.1 摘要 |
| 5.2 前言 |
| 5.3 材料和方法 |
| 5.4 统计学分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 结论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 转录调节因子 GATA6 在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 miR-27a-3p在消化系统肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）FOXF2转录调控LINC02532介导SOX7 mRNA稳定性调控胃癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:LINC02532在胃癌中的生物学作用及其临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器及生产商 |
| 2.1.2 主要试剂及生产商 |
| 2.1.3 细胞、病例组织和实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 TCGA数据库胃癌数据下载整理 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 总RNA提取 |
| 2.2.5 逆转录 |
| 2.2.6 实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) |
| 2.2.7 蛋白提取和定量 |
| 2.2.8 Western Blot |
| 2.2.9 Transwell细胞迁移实验 |
| 2.2.10 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.2.11 裸鼠成瘤实验 |
| 2.2.12 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LINC02532在胃癌细胞系和组织中的表达 |
| 3.2 胃癌中LINC02532表达的临床病理意义 |
| 3.3 LINC02532促进胃癌细胞的迁移和侵袭 |
| 3.4 LINC02532过表达增强裸鼠成瘤能力 |
| 3.5 LINC02532对EMT相关蛋白表达的调控 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:FOXF2转录调控LINC02532参与胃癌细胞的迁移和侵袭 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂及生产商 |
| 2.1.2 主要仪器及生产商 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析(GSEA) |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 总RNA提取 |
| 2.2.5 去除基因组DNA |
| 2.2.6 逆转录 |
| 2.2.7 qRT-PCR实验 |
| 2.2.8 Transwell迁移和侵袭实验 |
| 2.2.9 启动子荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因富集分析(GSEA) |
| 3.2 FOXF2负调控LINC02532 |
| 3.3 FOXF2转录抑制LINC02532 |
| 3.4 FOXF2/LINC02532轴促进胃癌细胞迁移和侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:LINC02532通过介导SOX7 mRNA稳定性促进胃癌细胞的迁移和侵袭 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂及生产商 |
| 2.1.2 主要仪器及生产商 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 总RNA提取 |
| 2.2.5 去除基因组DNA |
| 2.2.6 逆转录 |
| 2.2.7 qRT-PCR实验 |
| 2.2.8 蛋白提取和定量 |
| 2.2.9 Western blot |
| 2.2.10 FISH实验 |
| 2.2.11 Transwell迁移和侵袭实验 |
| 2.2.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.13 mRNA稳定性实验 |
| 2.2.14 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因富集分析(GSEA) |
| 3.2 LINC02532在胃癌细胞中的定位 |
| 3.3 LINC02532负调控SOX7的表达 |
| 3.4 LINC02532与SOX7 mRNA的3'UTR区域结合降低其稳定性 |
| 3.5 LINC02532/SOX7轴促进胃癌细胞迁移和侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA调控机制及其在胃癌腹膜转移中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）Hsa＿circ＿001988/miR-197-3p/FBXW7轴对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:Hsa_circ_001988在胃癌组织及其匹配非癌粘膜中的表达及与临床病理因素间的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 组织标本及病理资料收集 |
| 2.2.3 RNA提取及反转录 |
| 2.2.4 实时定量 PCR(quantitive Real time polymerase-chain reaction, qRT-PCR) |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Hsa_circ_001988在胃癌组织中呈显着低表达 |
| 3.2 Sanger测序验证hsa_circ_001988的环状结构 |
| 3.3 Hsa_circ_001988表达与胃癌病理因素间的关系 |
| 3.4 Hsa_circ_001988ROC曲线分析 |
| 3.5 Hsa_circ_001988在胃癌细胞系组织中呈低表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Hsa_circ_001988在体内、外对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞转染与稳转细胞株建立 |
| 2.2.2 RNA提取及实时定量PCR检测 |
| 2.2.3 CCK-8实验 |
| 2.2.4 克隆形成实验 |
| 2.2.5 细胞周期实验 |
| 2.2.6 细胞划痕实验 |
| 2.2.7 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 2.2.8 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 si-circ001988沉默胃癌AGS细胞中hsa_circ_001988的表达 |
| 3.2 成功构建稳定高表达hsa_circ_001988的BGC823胃癌细胞株 |
| 3.3 CCK-8实验显示hsa_circ_001988表达抑制胃癌细胞活力 |
| 3.4 克隆形成实验显示hsa_circ_001988抑制胃癌细胞群体依赖性的克隆形成能力 |
| 3.5 流式细胞术检测发现hsa_circ_001988高表达使胃癌细胞阻滞于G0/G1期 |
| 3.6 细胞划痕实验示hsa_circ_001988高表达显着降低胃癌细胞划痕愈合能力 |
| 3.7 Transwell迁移实验示hsa_circ_001988高表达水平抑制胃癌细胞迁移能力 |
| 3.8 Transwell细胞侵袭实验示hsa_circ_001988高表达降低胃癌细胞胞侵袭能力 |
| 3.9 裸鼠皮下成瘤实验显示hsa_circ_001988高表达在体内明显抑制裸鼠皮下抑制瘤的生长 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:Hsa_circ_001988/miR-197/FBXW7轴调控胃癌细胞增殖、迁移与侵袭的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与细胞转染 |
| 2.2.2 RNA提取、反转录及实时定量PCR |
| 2.2.3 Western blot法检测蛋白表达 |
| 2.2.4 公共数据库分析 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 qRT-PCR实验显示miR-197-3p在胃癌组织中的表达显着升高 |
| 3.2 qRT-PCR实验显示FBXW7在胃癌组织中的表达明显降低 |
| 3.3 KMPLOT数据库示FBXW7低表达提示胃癌患者不良预后 |
| 3.4 Hsa_circ_001988,miR-197-3p和FBXW7三者之间在胃癌组织表达的相关性 |
| 3.5 qRT-PCR检测CCDC6在胃癌组织中呈低表达 |
| 3.6 KMPLOT数据库示CCDC6低表达提示胃癌患者不良预后 |
| 3.7 Hsa_circ_001988调控miR-197-3p和FBXW7mRNA表达水平 |
| 3.8 Hsa_circ_001988调控CCDC6mRNA、Cyclin D1、YAP1蛋白和EMT通路关键蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分:RNA结合蛋白U2AF65和EIF4A3结合并促进hsa_circ_001988的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 实时定量PCR检测基因mRNA表达 |
| 2.2.4 Western blot法检测基因蛋白表达 |
| 2.2.5 公共数据库分析 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 qRT-PCR实验示U2AF65 mRNA在33例人胃癌组织中低表达 |
| 3.2 Western Blot实验示U2AF65蛋白在33例人胃癌组织中低表达 |
| 3.3 TCGA数据库显示U2AF65低表达与胃癌患者的不良预后相关 |
| 3.4 U2AF65结合并促进hsa_circ_001988的表达 |
| 3.5 EIF4A3结合并促进hsa_circ_001988的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 环状RNA在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）参与调控胃癌淋巴结转移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胃癌概述介绍 |
| 1.1.1 胃癌发病率及死亡率 |
| 1.1.2 胃癌致病因素 |
| 1.1.3 胃癌治疗方法 |
| 1.1.4 胃癌预后 |
| 1.2 恶性肿瘤的转移 |
| 1.2.1 恶性肿瘤转移的机制 |
| 1.2.2 恶性肿瘤转移的过程 |
| 1.2.3 恶性肿瘤的淋巴结转移 |
| 1.2.4 胃癌转移的过程及机制 |
| 1.3 淋巴结转移相关基因的研究进展 |
| 1.4 胃癌淋巴结转移相关信号传导通路 |
| 1.5 磷酸甘油酸变位酶-1(PGAM1)与肿瘤的关系 |
| 1.6 PGAM1与其他肿瘤的关系 |
| 1.7 PGAM1与胃癌的关系 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.0 主要试剂 |
| 2.1.1 抗体信息 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 临床标本 |
| 2.1.4 细胞株 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床标本取材 |
| 2.2.2 显微切割技术 |
| 2.2.3 高通量测序分析 |
| 2.2.4 细胞培养方法 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 qPCR检测细胞中PGAM1表达水平 |
| 2.2.7 慢病毒转染及建立稳转细胞系 |
| 2.2.8 细胞增殖能力检测 |
| 2.2.9 细胞周期检测 |
| 2.2.10 细胞凋亡检测 |
| 2.2.11 划痕实验 |
| 2.2.12 Transwell实验 |
| 2.2.13 流式细胞实验检测迁移相关蛋白 |
| 2.2.14 Western Blot实验 |
| 2.2.15 小鼠荷瘤模型建立 |
| 2.2.16 免疫组化三步法染色 |
| 2.2.17 结果判定 |
| 2.2.18 临床数据分析 |
| 2.2.19 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 测序结果分析 |
| 3.1.1 差异基因表达水平聚类分析 |
| 3.1.2 差异基因表达水平火山图分析 |
| 3.1.3 差异基因GO富集性分析 |
| 3.1.4 差异基因KEGG富集性分析 |
| 3.2 差异基因验证,锁定靶基因PGAM1 |
| 3.3 敲低胃癌细胞系中PGAM1的表达 |
| 3.4 PGAM1对胃癌细胞生物学功能的影响 |
| 3.4.1 PGAM1敲低抑制了胃癌细胞增殖 |
| 3.4.2 PGAM1敲低引促进胃癌细胞的G1期停滞 |
| 3.4.3 PGAM1敲低不影响胃癌细胞的凋亡 |
| 3.4.4 PGAM1敲低能抑制胃癌细胞的迁移和侵袭 |
| 3.5 PGAM1敲低对胃癌迁移转移相关蛋白表达的影响 |
| 3.6 PGAM1受到Src、FAK、Paxillin信号转导通路调控 |
| 3.7 体内实验验证PGAM1的敲低抑制肿瘤细胞的增殖和转移 |
| 3.8 免疫组化检测PGAM1在CIS组织、癌旁组织及LNM组织中的表达差异 |
| 3.9 PGAM1在不同组织中表达情况与肿瘤患者分期的相关性分析 |
| 3.10 复发、死亡患者与无瘤生存患者PGAM1表达的差异分析 |
| 3.11 PGAM1表达与患者生存期预测分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 PGAM1在胃癌转移中作用 |
| 4.2 PGAM1在胃癌细胞的增殖和凋亡中的作用 |
| 4.3 PGAM1对转移相关信号通路的影响 |
| 4.4 PGAM1研究的临床意义 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LncRNA LIFR-AS1影响胃癌发生的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在胃癌中的作用及其临床应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、胃癌侵袭转移及预后的标志物（论文参考文献）
- [1]FNDC1促进胃癌侵袭及腹膜转移的作用和机制研究[D]. 江涛. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究[D]. 饶敏. 吉林大学, 2021(01)
- [3]内皮型一氧化氮合酶影响胃癌腹膜转移的机制及其作为胃癌治疗靶点的研究[D]. 邹丹. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究[D]. 原凌燕. 兰州大学, 2021(09)
- [5]长链非编码RNA RP11-7K24.3通过miR-17-5p/ZBTB4轴对胃癌发生发展的调控作用及相关机制研究[D]. 齐明然. 吉林大学, 2021(01)
- [6]miR-27a-3p靶向调控GATA6在胰腺导管腺癌侵袭转移中作用机制的体外研究[D]. 饶雪峰. 南昌大学, 2021(01)
- [7]FOXF2转录调控LINC02532介导SOX7 mRNA稳定性调控胃癌进展的机制研究[D]. 张铖. 中国医科大学, 2021(02)
- [8]Hsa＿circ＿001988/miR-197-3p/FBXW7轴对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制研究[D]. 孙丹. 中国医科大学, 2021(02)
- [9]磷酸甘油酸变位酶-1（PGAM1）参与调控胃癌淋巴结转移的分子机制研究[D]. 王贺雷. 吉林大学, 2021(01)
- [10]LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的作用及机制研究[D]. 赵江桥. 河北医科大学, 2021(02)