一、一株带有显性免疫抑制能力的鸭肠炎病毒（论文文献综述）
吴咪[1]（2021）在《鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究》文中认为鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV）属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科,可引起鸡的传染性喉气管炎。早在1925年美国首次报道鸡传染性喉气管炎以来,在上世纪六十年代我国也发现了该病,相继在我国各省均有发生,该病是目前危害养禽业的重要疫病之一。国内外主要使用弱毒疫苗预防该病,但因疫苗株毒力普遍偏强,因此存在潜伏感染的危害以及无法鉴别疫苗株与野毒株的缺点。目前对ILTV基础研究较少,制约了鸡传染性喉气管炎防控技术的发展。本研究针对影响ILTV复制的关键宿主蛋白为切入点,首次鉴定到信号肽酶复合物亚基3（SPCS3）是影响ILTV在细胞中复制的关键宿主蛋白之一,发现SPCS3蛋白可以切割ILTV的gL蛋白。本研究内容及主要试验结果如下:1.分别对三株ILTV:SH2016、SH2017、GD2018的生长特性及致病性进行研究。三株ILTV均可在鸡肝癌细胞（LMH）增殖,感染ILTV后120h,SH2016滴度可达到103.08TCID50,SH2017和GD2018分别可达到103.42TCID50和105.08TCID50,其中GD2018较其它两株更适应LMH细胞生长;经绒毛尿囊膜方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达到103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.67TCID50和104.33TCID50,GD2018更适应在尿囊膜上生长;收取尿囊液,SH2016滴度可达102.67TCID50,SH2017和GD2018分别可达到100.33TCID50和100.5TCID50,SH2017和GD2018不生长,SH2016可以在尿囊腔中复制。以尿囊腔方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.58TCID50和101.83TCID50;收取尿囊液,SH2016滴度可达104.58TCID50,SH2017和GD2018分别可达到101.25TCID50和100.67TCID50,即SH2017和GD2018几乎不生长,而SH2016更适应在尿囊腔中增殖。此外,分别用三株ILTV感染8周龄SPF鸡,SH2016临床症状最明显,是唯一引起鸡死亡的毒株,且三株ILTV只能在鸡喉气管组织中复制,其他脏器并未检测到;GD2018在攻毒后第14d,抗体效价最高,SH2016在攻毒后第21d抗体效价最高。2.分别对三株ILTV基因组进行高通量测序,拼接出全基因组序列,根据基因组结构,预测各蛋白序列。三株ILTV基因组长度分别为:SH2016为153.805kb、SH2017为153.024kb、GD2018为153.855kb;GC含量分别为:SH2016为48.16%、SH2017为48.06%、GD2018为48.10%。三株ILTV基因组结构均由UL、US、IRs及TRs四个区域组成。对病毒基因组核酸序列及10个编码蛋白氨基酸序列进行系统进化分析,基因组DNA进化树上,SH2016与俄罗斯分离株Rus/Ck/Tatarstan/1009/1643株亲缘关系最近,而与SH2017、GD2018关系较远;SH2017与美国分离株LT Blen亲缘关系最近;GD2018与俄罗斯分离株Rus/Ck/Penza/2013/2701及意大利分离株4784/80亲缘关系较近。g C及gL蛋白进化树中,三株ILTV在同一分支,该蛋白具有较高的保守性;gD、gE及gG蛋白进化树中,SH2016与GD2018在同一分支,同源性较高,而与SH2017同源性较低;gB、gH、gM、gI及TK蛋白进化树中,SH2017与GD2018同源性较高,而与SH2016同源性较低。对三株ILTV病毒10个蛋白氨基酸突变位点进行比较,发现除三株ILTV的gC蛋白序列完全一致外,其它9个病毒蛋白都有不同程度的氨基酸位点差异,这些蛋白差异疑与三株ILTV复制能力及致病性的差异相关。3.构建鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库,对LMH细胞全基因组范围进行逐一扫描式敲除,构建基因敲除细胞文库,然后用ILTV感染细胞文库,对存活的细胞进行高通量测序,确定存活细胞中敲除的宿主基因。第一次测序结果发现3个非编码RNA（ncRNA）基因和SPCS3（信号肽酶复合物亚基-3）基因可能与病毒复制相关,随后的三次重复实验结果均显示,SPCS3基因是存活细胞中敲除率最高的基因,因此推测宿主蛋白SPCS3可能是影响ILTV复制的关键蛋白之一。4.比较ILTV在LMH细胞和SPCS3蛋白截短的LMH细胞系（分别命名为1-6和1-14）中的生长,在1-6细胞系中,ILTV的病毒滴度降低102.625倍,在1-14细胞系中,ILTV的病毒滴度降低103.75倍,表明SPCS3蛋白截短确实可以对ILTV的复制起到抑制作用。通过在线生物软件对ILTV中具有信号肽及多个跨膜结构的病毒蛋白进行预测,成功构建9个含有单一信号肽的病毒蛋白及4个含有多个跨膜结构的病毒蛋白真核表达质粒,转染细胞后,其中8个病毒蛋白成功表达,比较各病毒蛋白在LMH细胞及1-14细胞系中表达差异,结果显示,ILTV的衣壳糖蛋白L（gL）蛋白在两种细胞中的蛋白分子量差异明显,表明SPCS3蛋白截短影响了其切割gL蛋白的功能,这可能是影响ILTV复制的主要原因。5.为了解SPCS3蛋白截短对其它α疱疹病毒的影响,分别将鸭肠炎病毒（DEV）和人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）两种α疱疹病毒感染LMH细胞和1-14细胞系,比较其生长差异。结果显示,与在LMH细胞上相比,DEV在1-14细胞系中病毒滴度降低102倍,而HSV-1在两种细胞上的生长无差异。进一步构建DEV和HSV-1两种病毒的gL蛋白真核表达质粒,分别转染LMH细胞和1-14细胞系后,两种病毒的gL蛋白在LMH细胞与1-14细胞系中,分子量大小无明显变化,但是DEV的gL蛋白在1-14细胞系中表达量明显低于LMH中的表达量,而HSV-1的gL蛋白在1-14细胞系种表达量没有明显变化,进一步表明截短的SPCS3可能影响gL蛋白的稳定性,从而影响DEV复制。本研究丰富了我国ILTV毒株全基因组序列生物学信息,明确了三株ILTV流行株的生物学特性。通过CRISPR/Cas9高通量筛选技术,筛选到一种与禽疱疹病毒复制相关的宿主蛋白分子,完善了ILTV复制中发挥关键作用的宿主蛋白作用机制,为ILTV致病分子机制研究尝试了新的思路。
尹馨[2]（2021）在《H7N9亚型禽流感病毒的进化监测及关键生物表型的分子机制研究》文中提出2013年,我国首次出现低致病性H7N9亚型流感病毒感染并致人死亡事件。2017年,该低致病性H7N9亚型流感病毒进一步突变为高致病性H7N9病毒,并呈现对鸡的高致病力。鉴于此,2017年9月开始,我国在家禽中全面实行疫苗免疫政策,疫苗免疫不但有效阻断了H7N9病毒在家禽中的流行,为养禽业每年挽回数百亿元的经济损失,更在阻断人感染H7N9病毒方面取得“立竿见影”的效果,将一场“潜在的人流感大流行”扼杀在萌芽状态。然而,在后续的监测中,我们发现H7N9病毒在我国尚未被完全根除,其进化和生物学特性仍需进一步跟踪并开展研究。本研究在2018年2月至2019年12月的监测和诊断过程中分离到19株H7N9病毒,对它们进行了系统的分析评估。遗传演化以及关键氨基酸分析发现,19株H7N9病毒在HA、NA、M基因的核苷酸同源性分别为97%～100%、97.6%～100%和97.1%～100%,与2017年高致病性H7N9病毒属于同一分支内。19株中的18株病毒在PB2、PB1、PA、NP和NS基因的核苷酸同源性分别为97.6%～100%,98%～100%,98%～100%,98%～100%和97.7%～100%,而DK/FJ SE0377/18病毒株与它们的核苷酸差异较大,与其他18株病毒的PB2、PB1、PA、NP和NS在进化树上分布于不同的分支内,核苷酸同源性分别为85.7%～86.2%,88.8%～89.4%,90.5%～91.4%,93.7%～94.6%和69.1%～69.7%。按照95%的核苷酸差异标准进行划分,可将19株H7N9病毒划分为2个基因型,其中18株病毒属于本实验室先前报道过的G2基因型,而DK/FJ SE0377/18病毒株单独形成一个新的基因型G10。动物感染试验表明,H7N9病毒对鸡呈现高致病性,对鸭致病力温和,对小鼠呈现出不同致病力,所有病毒均能在小鼠的肺以及鼻甲有效复制,部分病毒能在肾脏,脾脏以及脑中复制,其中4株病毒能引起小鼠不同程度的死亡。除CK/NX/SD007/2018、CK/LN/SD004/2019和CK/He B/S1118/2019不会引起小鼠体重下降外,其余病毒均能引起小鼠体重不同程度的下降,且CK/IM/SD010/2019的MLD50(Median mice lethal dose,MLD50小鼠半数致死量)为4.8 log10EID50。受体结合试验表明,目前监测到的H7N9病毒以高亲和力与禽型受体结合,但逐渐丧失了与人型受体结合的能力。抗原性试验表明,19株H7N9病毒明显的形成了两个抗原组:抗原I组包含疫苗株H7-Re2,CK/GX/SD098/17,和2018年分离到的11株病毒;抗原II组包含一株2018年的分离株CK/LN/SD014/18和7株2019年分离到的病毒株;且第二组病毒与Re-2疫苗株出现明显的抗原差异。为研究H7N9禽流感病毒的抗原性变异机制,我们分析了两个抗原组内病毒在HA1蛋白上的差异性氨基酸,发现8个氨基酸在抗原组I的病毒中是保守的,但在抗原组II的病毒中发生了突变。由此拯救出一系列点突变毒株,发现T135V,T160A突变能够增强CK/IM/SD010/2019与Re-2抗血清的反应性。也发现T135V和T160A的突变也会改变病毒与单抗的反应性。发现HA上135位和160位的突变会引入了两个糖基化位点,并由此导致了抗原漂移。以上研究结果对于我们了解疫苗免疫后我国H7N9亚型禽流感病毒的生物学特性变化具有非常重要的意义,为我国防控H7N9提供了重要的理论基础。
佟相慧[3]（2020）在《MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用》文中认为为了解决多种鸭病病毒没有适合的传代细胞系的现实问题,本论文利用无特定病原体（Specific pathogen free,SPF）鸭开展了鸭胚肝间充质干细胞（Duck embryo liver mesenchymal stem cells,Du LMSC）的研究。抗原相关转运体（Transporter associated with antigen processing,TAP）基因（Tap1和Tap2）和主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）I类分子重链编码基因（UAA）位于鸭MHC的核心区域,且位置比邻。本研究测定了Tap1和Tap2序列纯合的4个鸭品系（B1、B2、B3和B4）的UAA编码区序列,确定了各品系内UAA序列同源。利用此4个品系,采用Ⅳ型胶原酶消化法从鸭胚肝脏中分离DuLMSC,体外可传代培养至50代。细胞形态稳定呈长梭形贴壁生长,不表达造血干细胞分子标记,能够向成骨细胞和成脂细胞分化,且前35代细胞对裸鼠无致瘤性。将4个细胞株,分别命名为DuLMSC/1、DuLMSC/2、DuLMSC/3和DuLMSC/4。为比较鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）对4个细胞株的适应性,我们将DEV C-K CE株分别接种到4个细胞株上并连续传10代。结果显示F1至F10代病毒接种细胞后,均产生典型的细胞病变（Cytopathic effect,CPE）;F1至F10代病毒均能特异性地扩增出DEV的UL2基因片段,且F1、F5和F10代病毒的UL2基因核苷酸序列与原种毒完全同源;接毒24 h的细胞的细胞浆、细胞核和细胞间隙内存在典型的疱疹病毒样粒子;DEV在4个细胞株上的一步生长曲线表明DuLMSC/4上的各个时间点对应的病毒滴度都高于或接近其他3个细胞株;另外,F1至F10代的病毒滴度从F5代开始趋于稳定,Du LMSC/3或DuLMSC/4上的病毒滴度比DuLMSC/1或Du LMSC/2高约0.5个TCID50,且在4个细胞株上前五代的病毒滴度平均值始终比在CEF细胞上高0.5个TCID50左右。在分析鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）1型弱毒株和DHAV-3弱毒株对D uLMSC/4的适应性时,DHAV-1连续传代至F8代时产生CPE,F1至F15代病毒均能特异性地扩增出DHAV-1的3D基因片段且F1、F7和F15代的3D基因核苷酸序列与原种毒完全同源;DHA V-3连续传代至F3代时产生CPE,F1至F15代病毒均能特异性地扩增出DHAV-3的VP1基因片段且F1、F7和F15代的VP1基因核苷酸序列与原种毒完全同源。病毒增殖曲线结果显示DHAV-1核酸相对拷贝数范围为1-30,而DHAV-3核酸相对拷贝数在10-120之间。利用B3系鸭UAA部分α2和完整α3区的大肠杆菌表达产物制备了鸭MHC I类分子特异性鼠源单抗G1。G1的重链为IgM,轻链为Kappa型。G1对B4鸭外周血细胞和对SPF白来航鸡外周血细胞的流式细胞术检测结果分别为70.3%和19.4%。DEV感染Du LMSC/4后,细胞表面MHC I类分子的表达量先下调后上调,而细胞内MHC I类分子转录水平始终上调,推测DEV感染早期能抑制MHC I的递呈。本研究建立的DuLMSC/4,能支持DEV和DHAV增殖,能用于MHC I相关的基础研究,是鸭病防控技术研发的良好实验材料。
李如梦[4]（2020）在《基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究》文中认为2013年,H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现,迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰。截至2020年3月1日,实验室确诊人感染H7N9禽流感病毒共有1568例病例,其中616人死亡,病死率约为40%。另外,根据世界动物卫生组织（World Orgnization For Animal Health,OIE）的报告,截至2018年3月,在中国家禽中已报告11起高致病性H7N9亚型禽流感暴发,导致将近100万只家禽被扑杀。因此,H7N9亚型禽流感是对公共卫生和家禽养殖的重大威胁。接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产,具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外,灭活疫苗只能诱导抗体免疫,而不能诱导细胞免疫。因此,需要利用新的技术研发一种安全高效的H7N9禽流感疫苗,以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒,可模拟病毒粒子的天然结构,能激活细胞免疫反应和体液免疫反应,诱导的免疫保护更为全面。另外,利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产流感VLP疫苗,而且它由于不依赖鸡胚生产,保证了禽流感大流行时疫苗的充足供应,且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞悬浮培养平台,采用两种策略构建了表达H7N9禽流感病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）和基质蛋白（Matrix,M1）的VLP候选疫苗株。两种策略产生的候选VLP疫苗的抗原产量较高、免疫原性好、保护效力强,与商品化H7N9灭活疫苗的表现相当,为H7N9禽流感的防控提供了新的选择。1.基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究选取了一株 H7N9 亚型高致病性禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD1 5/2016（GD15）作为目的基因的供体。分别将 GD15 的 HA、NA、M1基因克隆在pVL1393载体上,通过与线性化的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（AcMNPV）基因组DNA共转染产生了三个重组杆状病毒（rBac-HA-GD15、rBac-NA-GD15、rBac-M1-GD15）。利用IFA方法能检测到外源蛋白的表达。将三个重组杆状病毒以MOI为1:1:1的比例共感染Sf9细胞。通过透射电镜可观察到直径80-120 nm、内部无遗传物质且与流感病毒结构相似的颗粒形成,即为H7N9 VLP（命名为VLP-1）。将VLP经超滤管浓缩后再经30-60%蔗糖密度梯度超速离心进行纯化,其血凝（HA）效价达到11 log2。分别收获超滤浓缩的VLP与超速离心纯化的VLP制备疫苗,同时以单独表达HA蛋白的重组杆状病毒rBac-HA-GD15制备的灭活疫苗为对照。疫苗经肌肉注射方式接种4周龄的SPF鸡,免疫后第3周各疫苗都能诱导产生抗体应答,平均血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）抗体滴度在6 log2以上;与对照组相比,各疫苗免疫鸡的血清中均能检测到中和抗体,纯化VLP-1组平均滴度能达到260;各疫苗组IgY抗体滴度均在2560以上,这些结果显示了 VLP-1疫苗具有较强的免疫原性。其中15 μg免疫剂量比7.5 μg免疫剂量能诱导更高的HI抗体水平。免疫3周后,用GD15毒株以106.0 EID50的剂量通过滴鼻点眼的方式攻毒。未免疫组在攻毒后出现严重的临床症状,且5天内全部死亡。所有疫苗免疫鸡在攻毒后14天内均未出现症状且未发生死亡,说明H7N9 VLP-1疫苗可提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,疫苗免疫后最高仅有30%的鸡能检测到排毒,且排毒量较低,其中纯化VLP-1组仅在攻毒后第3天能检测到排毒。组织病理学实验显示,VLP-1疫苗以15 μg剂量免疫时,H7N9病毒感染造成的肺脏病变明显较轻。以上结果说明,通过单独表达HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒共感染Sf9细胞可成功组装H7N9 VLP,且VLP-1疫苗能够诱导产生较强的抗体反应,能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护且显着抑制排毒。2.基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究将H7N9 GD15毒株的HA、NA和M1基因串联并克隆至穿梭载体中（pVL1393-NA-M1-HA）。将重组穿梭质粒与线性化的AcMNPV基因组DNA共转染Sf9细胞进行VLP的组装。利用IFA方法鉴定了 HA、NA与M1蛋白的表达,并用透射电镜观察到直径约为100 nm的流感病毒样颗粒,说明重组杆状病毒拯救成功且能够组装成H7N9VLP（命名为VLP-2）。重组杆状病毒接种Sf9细胞制备VLP,用超滤结合超速离心方法浓缩VLP,浓缩后VLP的HA效价显着提高（6 log2至11 1og2）。用两种构建策略制备的VLP疫苗（VLP-1与VLP-2）与商品化重组禽流感病毒H5+H7三价灭活疫苗进行动物的免疫与攻毒实验。VLP疫苗以15μg剂量肌肉注射4周龄的SPF鸡,第3周平均HI抗体滴度在6 log2以上,商品疫苗和VLP-1疫苗诱导的最高HI抗体均能达到10 log2以上。疫苗免疫血清与2013-2018年H7N9野毒株均具有良好的交叉反应性。各疫苗均能诱导中和抗体反应,但是VLP疫苗诱导的中和抗体比商品疫苗诱导的抗体略低。各疫苗均能诱导很高的IgY抗体水平（2560-5120）,且VLP疫苗与灭活疫苗之间无显着差异。其中,VLP-2与VLP-1都以15 μg剂量免疫时,VLP-1疫苗诱导的抗体水平更高。免疫后第3周用高致病性H7N9禽流感病毒GD15株以106.0 EID50的剂量进行攻毒。临床观察14天内,各疫苗免疫组均未出现明显的临床症状且未发生死亡,说明VLP疫苗与商品疫苗均能提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测,结果显示50%的商品疫苗免疫鸡能检测到排毒,两个VLP疫苗免疫鸡的排毒率分别为30%与40%,与商品化疫苗相比无显着差异。VLP疫苗与商品疫苗免疫鸡的脏器中均未检测到病毒,说明它们均能有效抑制病毒复制。以上结果说明,基于HA、NA、M1基因串联表达策略组装的H7N9 VLP疫苗能够在SPF鸡中诱导较强的抗体免疫应答,且能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护并显着抑制排毒及病毒在体内的复制,其免疫原性与保护效力与杆状病毒共感染组装的VLP-1疫苗及商品疫苗相当。
杨雯昱[5]（2019）在《HPAIV H7N9/AAca减毒活疫苗在哺乳动物模型上的免疫保护力评价及其与细菌的协同致死作用研究》文中研究指明H7N9流感病毒能够导致人类发病和死亡,自2013年在我国出现起一直在国内流行。2017年出现高致病性H7N9流感病毒（HPAIH7N9）,该病毒的HA片段裂解位点插入了四个连续氨基酸,获得对鸡的高致病性和高致死率,同时,HPAIH7N9病毒感染人的病例也在我国被发现,与低致病性H7N9流感病毒（LPAIH7N9）相比人感染死亡率进一步提升,故研发人用储备疫苗,有效控制H7N9流感病毒的流行已刻不容缓。人感染H7N9病例治疗中发现,部分H7N9流感患者出现继发性细菌感染,然而,对细菌和H7N9流感病毒在人感染病例中的协同作用研究数据十分有限,有必要进一步澄清细菌与H7N9流感病毒的协同致病、致死作用。因此,本文进行了:一、对H7N9/AAca弱毒疫苗阻止H7N9流感病毒复制的免疫保护力评价。H7N9/AAca是由反向遗传技术构建的重组弱毒疫苗,其携带人分离株A/Anhui/1/2013（H7N9）（AH/1）的表面基因HA和NA,以及冷适应流感毒株A/AnnArbor/6/60（H2N2）（AAca）的6个内部基因。本研究使用小鼠模型评价了 H7N9/AAca疫苗对异源HPAI H7N9 病毒（CK/S1220 和 CK/SD008-PB2/627K）和 LPAIH7N9 病毒（CK/SD057）的保护效力。对SPF级6W BALB/c小鼠经鼻腔接种106 EID50 H7N9/AAca疫苗,进行一次免疫和二次免疫,间隔三周,免疫后21d采血检测中和抗体水平,同时进行攻毒试验,经鼻腔感染 100 X MLD50 CK/S1220 病毒、100 X MLD50 CK/SD008-PB2/627K 病毒或100×MID50 CK/SD057病毒,3d后采样（鼻甲、肺、脾、肾、脑）接种鸡胚测定病毒含量。结果显示,一免后小鼠产生的抗H7N9/AAca、CK/S1220、CK/SD008-PB2/627K和CK/SD057病毒的中和抗体水平分别为65、13、20和17,攻毒后不发生死亡,仅免疫一次能够完全阻止高致病性CK/S1220和CK/SD008-PB2/627K病毒引起的发病和死亡,但不能阻止HPAI H7N9病毒在小鼠体内复制;能够阻止LPAI H7N9 CK/SD057病毒在小鼠体内复制。二免后,中和抗体水平分别上升为320、110、160和140,仅在鼻甲和肺中检测到含量极低的CK/SD008-PB2/627K病毒,感染CK/S12201的小鼠脏器内未检测到病毒。结论,一次免疫能够阻止HPAIH7N9流感病毒在小鼠上引起的发病和死亡,两次免疫完全阻止或显着降低（P<0.001）HPAIH7N9流感病毒在小鼠体内复制。二、H7N9/AAca弱毒疫苗阻止HPAIH7N9病毒传播的保护效力研究。106 EID50 H7N9/AAca疫苗经鼻腔接种SPF豚鼠,免疫后21d进行飞沫传播试验。传播试验分为两组,一组中免疫豚鼠作为感染动物接种106 EID50 CK/SD008-PB2/627K病毒,24h后将未免疫豚鼠放入相邻笼具;另一组中未免疫豚鼠感染106 EID50 CK/SD008-PB2/627K病毒,24h后将免疫豚鼠放入相邻笼具,每隔1d采集鼻洗液接种鸡胚,若检测到病毒即判定为感染。结果,免疫和未免疫的感染组豚鼠鼻洗液中检测到病毒含量较高的病毒,而两组传播试验的暴露动物均未被感染,因此仅免疫一次H7N9/AAca疫苗就可以有效的阻止CK/SD008-PB2/627K病毒在豚鼠间通过飞沫传播。三、H7N9流感病毒与细菌感染在小鼠模型中协同致死作用研究。研究使用2013年分离的PG/S1421和AH/1病毒,106 EID50 PG/S1421和106 EID50 AH/1流感病毒分别感染6W C57BL/6小鼠,PG/S1421病毒不能够引起小鼠体重下降和死亡,而AH/1病毒则在9d内杀死了所有小鼠。感染后7-8d,对入侵小鼠下呼吸道细菌平板计数,并进行细菌分离鉴定,结果显示PG/S1421病毒感染的小鼠下呼吸道无细菌继发感染,AH/1病毒感染小鼠下呼吸道有大量细菌入侵,包含五个种属细菌,葡萄球菌（Staphylococcus）、肠杆菌（Enterobacter）、克洛诺杆菌（Cronobacter）、埃希氏菌（Escherichia）和链球菌（Strepotococcus）。通过将分离到的五株细菌分别以108CFU浓度与亚致死剂量的104 EID50 AH/1病毒共同感染小鼠,发现葡萄球菌和肠杆菌与AH/1病毒的共感染组中5只小鼠死亡4只,链球菌与AH/1病毒的共感染组中5只小鼠全部死亡。因此葡萄球菌、肠杆菌和链球菌与AH/1病毒表现出的协同致病、致死效应,其中链球菌与AH/1病毒的协作导致小鼠的发病和死亡最为严重。此外,研究还发现,当小鼠在感染AH/1病毒前3d受到链球菌攻击,造成5只小鼠中2只死亡,且存活小鼠体重有恢复趋势;而小鼠在感染AH/1病毒后3d受到链球菌攻击时,小鼠则全部死亡。因此,只有当AH/1病毒先于或同时与链球菌攻击小鼠才能表现出协同致病、致死的效应。综上所述,H7N9/AAca冷适应弱毒活疫苗对HPAI H7N9病毒和新发现的LPAI H7N9病毒有良好的免疫保护性,可以成为有效的人用备用疫苗株;细菌与H7N9病毒有协同致死作用,治疗H7N9流感患者的方案中应该对非致病菌更加重视,尤其是链球菌,在怀疑病患为H7N9流感病毒感染者时需尽早使用抗生素作为辅助治疗。
张雪莲[6]（2017）在《鸭甲肝病毒3型广东分离株致病性及表达其VP1基因重组鸭肠炎病毒免疫效果的研究》文中指出鸭病毒性肝炎（DVH）是由鸭肝炎病毒（DHAV）引起的主要危害1月龄以内雏鸭的一种高度致死性疾病;DHAV分为DHAV-1、DHAV-2及DHAV-3 3个血清型;我国DVH主要由DHAV-1和DHAV-3引起;DHAV-3的出现及DHAV-1与DHAV-3的一同流行是我国DVH不能得到控制的主要原因。鸭病毒性肠炎是由鸭肠炎病毒（DEV）引起的主要感染鸭、鹅等水禽的致死性传染病;DEV属疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科马立克病毒属,其基因组较大且其感染具有宿主特异性,因此,以其为病毒载体构建二价重组病毒活载体疫苗成为研究的热点。本研究的主要内容包括两方面,分别为DHAV-3广东分离株的致病性的系统性研究及表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建及其免疫保护效果的评价。1.DHAV-3致病性的研究（1）DHAV-3毒力的鉴定将分离于广东的DHAV-3进行鸭胚攻毒及雏鸭回归试验,对该病毒感染致死雏鸭临床症状、组织病理变化及病毒载量进行观察及检测,并测定该病毒的鸭胚半数致死量及雏鸭半数致死量,结果显示,该病毒可快速引起鸭胚及雏鸭死亡且死亡率极高,剖检观察到肝脏、脾脏及胆囊出现严重的组织损伤,并引起雏鸭心、肝、脾、肺、肾、十二指肠及脑等组织器官出现不同程度的病理损伤,病毒拷贝数在肝脏中最高,脾脏次之,胸腺及肌肉中最低,且对11日龄鸭胚的LD50为10-5.167/0.2mL,对5日龄雏鸭的LD50为10-6.375/0.2mL。（2）雏鸭感染DHAV-3后肝脏的转录组分析以10LD50的DHAV-3感染5日龄雏鸭,利用RNA-Seq筛选病毒感染后12h及48h雏鸭肝脏中的差异表达基因,并对筛选获得的差异表达基因进行GO功能分类及KEGG信号通路分析;结果显示,感染后12 h和48 h,肝脏中基因表达模式差异显着,且感染后48 h,大量的免疫相关基因出现上调,并显着富集在细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号通路、RIG-1样受体信号通路、细胞凋亡及Jak-STAT信号通路等。（3）雏鸭感染DHAV-3天然免疫应答相关分子的检测利用实时荧光定量PCR方法对10LD50DHAV-3感染后3h、6h、9h、12h、24h、36h及48 h雏鸭肝脏及脾脏中DHAV-3的病毒载量及12种免疫应答相关分子的相对表达量进行检测,结果显示,雏鸭感染DHAV-3后3 h即可在肝脏及脾脏中检测到低拷贝的病毒,肝脏中的12种免疫应答分子的表达呈现不同程度的上调,但脾脏中的表达呈现多样性;感染后6 h～24 h,雏鸭肝脏及脾脏中的免疫应答分子的表达模式不同,随着时间的延长,病毒拷贝数的大量累积,至感染后36h～48 h,观察到大多数免疫相关分子出现不同程度的表达上调,但最终雏鸭未能抵抗DHAV-3的感染而死亡。2.表达DHAV-3 VP1基因重组鸭肠炎病毒的构建（1）DHAV-3全基因的克隆及其VP1蛋白抗原优势区的鉴定根据GenBank已公布的DHAV-3参考序列,将DHAV-3基因组分成6段相互重叠的片段,利用合成的简并引物对DHAV-3的全基因序列进行克隆;利用PCR方法克隆获得DHAV-3 VP1基因,并对该基因进行分段截短表达,利用鼠抗DHAV-3多抗及鸡源DHAV-3卵黄抗体对VP1蛋白的抗原优势区进行筛选和鉴定,初步确定DHAV-3 VP1蛋白的抗原优势区为90～175aa。（2）含gpt筛选标记的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建、筛选及鉴定将获得的VP1基因克隆至pcDNA3.1（+）中,扩增获得含CMV启动子、VP1基因及BHG pA的VP1表达盒基因,同时,以实验室保存的pMD18T-gpt表达盒质粒为模板,利用PCR方法在原gpt表达盒两端分别引入一个同向的loxP位点,扩增获得gpt-loxP表达盒基因,通过一系列酶切、连接的方式成功构建重组病毒转移载体pEASY-AUs10-gpt-loxP-VP1;将重组病毒转移载体pEASY-AUs10-gpt-loxP-VP1与DEV C-KCE基因组总DNA共转染至原代鸭胚成纤维细胞中,经11代霉酚酸加压筛选及4轮蚀斑纯化获得含有gpt筛选标记基因及DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒,PCR鉴定正确后,将其命名为rDEV-AUs 10-gpt-loxP-3-VP 1。（3）不含gpt筛选标记的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建、筛选及鉴定将真核表达重组质粒pKozak-NLS-Cre与重组病毒rDEV-△Us10-gpt-loxP-3-VP1基因组总DNA再次共转至DEF,在Cre酶的作用下,将两个同向loxP位点间的gpt表达盒删除,而仅保留一个loxP位点,利用PCR方法对重组病毒进行鉴定,结果显示存在不含gpt表达盒的重组病毒后,再进行5轮蚀斑纯化后得到纯净的、仅含单一 loxP位点及VP1基因的重组DEV,经 PCR、RT-PCR、Western blot 及 IFA 等试验鉴定正确后,将其命名为 rDEV-AUs1 0-3-VP1;提取重组病毒rDEV-AUs10-3-VP1第1、5、10、15及20代基因组总DNA,PCR均可扩增到VP1基因,表明DHAV-3 VP1基因可在DEVC-KCE基因组中稳定存在;将rDEV-AUs10-3-VP1病毒液超离浓缩后进行透射电镜观察,结果观察到包含囊膜和衣壳的鸭肠炎病毒粒子形态。3.动物的免疫及攻毒（1）产蛋鸭的免疫以 2×105、5×105 及 1×106 PFU 的重组病毒 rDEV-△Us10-3-VP1 及 2×105 PFU 亲本病毒DEVC-KCE免疫产蛋鸭,初次免疫后3周进行加强免疫。结果表明,血清中针对DEV及DHAV-3 VP1的特异性抗体在加强免疫后的7 d达到高峰,卵黄中,则在加强免疫后的14 d达到高峰;血清及卵黄中特异性抗体效价与免疫剂量呈剂量依赖性;免疫后产蛋鸭血清及卵黄中的抗DEV中和抗体的变化趋势与特异性性抗体的变化趋势相似,而针对DHAV-3的中和抗体效价很低;免疫后产蛋鸭外周血中CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞数目均有所增加,但CD8+T淋巴细胞增加幅度更高,免疫后7dCD4+与CD8+T淋巴细胞比例下降,免疫后14d持续下降,直至免疫后21 d接近正常水平。（2）雏鸭的免疫及攻毒以5 × 105 PFU的重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1单次免疫3日龄雏鸭,免疫后7 d进行DEV AV1222株强毒及DHAV-3强毒的攻毒,攻毒剂量为100LD50/只,逐日观察并记录雏鸭的临床症状及死亡情况,结果表明,DEV强毒攻毒组雏鸭在攻毒后2周,重组病毒及亲本毒免疫的雏鸭均出现2只死亡,而PBS对照组雏鸭全部死亡,表明DHAV-3 VP1基因的插入及DEV C-KCE US10基因的缺失,并不影响弱毒疫苗株DEV C-KCE为雏鸭提供免疫保护力以抵抗DEVAV1222株强毒的感染;而DHAV-3强毒攻毒组在攻毒后第4天,亲本毒及PBS对照组雏鸭即全部死亡,重组病毒免疫组余1只雏鸭,攻毒后第8天,重组病毒组雏鸭全部死亡,表明构建的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒不能够为雏鸭提供有效的保护力以抵抗DHAV-3强毒的感染。本研究为探讨DHAV-3感染雏鸭快速致死的机制及雏鸭抵抗DHAV-3感染的相关免疫应答机制提供科学的数据支撑,为构建表达DHAV-3 VP1重组病毒活载体疫苗提供理论依据和技术平台,同时,完善本实验室DEV的反向遗传操作平台,为进一步探讨重组DEV候选插入位点及US10蛋白的生物学功能奠定物质基础。
王玉龙[7]（2015）在《表达IBV主要结构蛋白重组DEV的构建及其免疫保护性评价》文中研究指明鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的鸡的高度接触性上呼吸道及泌尿生殖道疾病。该病在很多国家和地区流行,主要感染呼吸道和肾脏,各种年龄鸡都易感,常引起产蛋鸡产蛋量和蛋品质下降,给养禽业造成严重的经济损失。鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）,又称鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）,主要引起鸭、鹅及多种雁形目禽类产生急性、热性、败血性传染病,曾在多个国家和地区发生流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV是疱疹病毒科成员,其基因组中部分基因是病毒复制非必需基因,可作为非复制型疫苗载体构建表达外源基因的活载体疫苗。本研究在本研究室建立的鸭肠炎病毒重组技术平台基础上,以US10基因缺失表达EGFP的重组鸭肠炎病毒为亲本病毒,应用同源重组技术分别构建表达鸡传染性支气管炎病毒主要结构蛋白N、S和S1的3株重组鸭肠炎病毒。鉴别PCR、交叉PCR检测及测序结果表明,IBV N、S和S1基因分别正确插入鸭肠炎病毒基因组内,替换病毒US10基因。Western blot和间接免疫荧光结果表明,IBV N、S和S1蛋白均能够在重组病毒rDEV-N、rDEV-S和rDEV-S1中检测到表达,且随病毒的复制时间增加而表达量增加。对3株重组病毒的基本生物学特性进行研究,结果表明3株重组病毒的蚀斑形态和蚀斑大小与亲本病毒rDEV US10-EGFP和野生型病毒DEV Clone-03相似。与野生型病毒DEV Clone-03相比,重组病毒rDEV-N、rDEV-S和rDEV-S1的病毒滴度略有下降,与其亲本病毒rDEV-EGFP病毒滴度相近。复制动力学研究表明,3株重组病毒的复制趋势与亲本病毒和野生型病毒一致,在感染细胞后72h病毒滴度达到高峰,在感染后96h病毒滴度开始下降,说明重组病毒的复制能力与病毒基因组缺失的位点有关,而与插入的外源基因无关。分别将3株重组病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代至20代,重组病毒表现出良好的遗传稳定性,外源基因随病毒复制而稳定遗传并稳定表达。将获得的3株鸡传染性支气管炎重组鸭肠炎病毒免疫1月龄SPF鸡,于免疫后21d用IBV强毒株ck/CH/LDL/091022进行攻毒,同时设对照组。分别于免疫后1w、2w、3w、4w、5w检测免疫鸡抗体水平。在免疫后1w,rDEV-N免疫组有84%鸡只抗体阳转,rDEV-S和rDEV-S1免疫组有92%鸡只抗体阳转。免疫后第2w,各免疫组血清抗体有不同程度下降,rDEV-N免疫组76%抗体阳性率,rDEV-S免疫组抗体阳性率下降至52%,而rDEV-S1免疫组下降至28%。至免疫后第3w,各免疫组抗体水平均显着下降,rDEV-N免疫组40%抗体阳性率,rDEV-S免疫组抗体阳性率下降至16%,而rDEV-S1免疫组下降至8%。攻毒后各组鸡只具有不同程度发病,对照组发病率为80%,rDEV-N免疫组发病率30%,rDEV-S免疫组发病率20%,rDEV-S1免疫组发病率40%。攻毒后7d对照组鸡只开始死亡,直至攻毒后12天不再有鸡只死亡。对照组死亡率为40%,rDEV-N免疫组发病率30%,rDEV-S免疫组发病率10%,rDEV-S1免疫组发病率30%。于攻毒后5d,采集各组鸡只咽拭子,应用荧光定量RT-PCR检测各组鸡只呼吸道的排毒情况。对照组在攻毒后咽拭子排毒率为90%,rDEV-N免疫组攻毒后经呼吸道排毒率为20%,rDEV-S免疫组攻毒后呼吸道排毒率30%,rDEV-S1免疫组攻毒后呼吸道排毒率40%。分别于攻毒后5、10、15、20d进行抗体水平检测,从攻毒后抗体变化水平来看,各组鸡只抗体均有不同程度升高,说明攻毒成功,且攻毒后3个免疫组鸡只抗体水平均高于对照组。结果提示,重组病毒免疫后的鸡只具有抵抗病毒攻击的能力,与对照组相比,抗体水平上升较快,说明鸡只存在免疫记忆。从发病率、死亡率和攻毒后排毒情况来看,3株重组病毒均能够对鸡只提供免疫保护,但不能够提供完全保护,其中重组病毒rDEV-S免疫保护效果好于重组病毒rDEV-N和rDEV-S1。
张苗苗[8]（2014）在《表达新城疫病毒F和HN基因重组鸭肠炎病毒的构建》文中认为鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DEV）,又叫鸭瘟（Duck plague, DP）,是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）引起的鸭、鹅以及多种雁形目禽类产生的一种急性、热性和败血性传染病。该病曾在多个国家和地区流行,其传播迅速,发病率和死亡率高,是危害养鸭业的重要疫病之一。其传播媒介主要是水禽和候鸟,带毒数年之久,给该病的防控造成很大的困难。新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的急性、高度传染性和致死性的禽类疫病,对各国养禽业造成巨大经济损失。F和HN基因都能够诱导机体产生中和抗体,目前已经成为研究基因工程疫苗主要的两个靶基因。本研究以实验室构建的rDEV-US10-EGFP重组鸭肠炎病毒为基础,以新城疫病毒F基因为靶基因,构建携带F基因表达盒的转移载pUS10-TPA-F。然后,提取重组病毒rDEV-US10-EGFP基因组,将其与转移载体pUS10-TPA-F共转染单层鸡胚成纤维细胞。通过四轮蚀斑纯化,得到了表达F基因的rDEV-US10-F重组病毒。将重组病毒的US10区域测序,结果说明F基因成功插入到病毒US10内部。重组病毒rDEV-US10-F感染单层鸡胚成纤维细胞24小时后,间接免疫荧光试验说明F基因得到了表达；重组病毒rDEV-US10-F感染单层鸡胚成纤维细胞后,Western blot试验检测到了F基因的表达。测定重组病毒的生长曲线,重组病毒的滴度虽然有些降低,但总体趋势与DEV Clone-03亲本毒非常相似。rDEV-US10-F重组病毒在单层CEF上传代至15代,每五代进行PCR、间接免疫荧光和Western blot检测,并观察病毒蚀斑情况。结果表明,外源基因F能够在重组病毒中得到稳定遗传和表达,而且rDEV-US10-F重组病毒具有亲本毒株的基本特性,能够成为新城疫一鸭病毒性肠炎重组活载体疫苗候选毒。之后,我们还以NDV HN基因作为目的基因,成功构建携带新城疫HN基因的转移载体pUS10-TPA-HN。然后,提取重组病毒rDEV-US10-EGFP基因组,将其与转移载体pUS10-TPA-HN共转染单层鸡胚成纤维细胞。通过两轮蚀斑纯化,得到了表达新城疫HN基因的rDEV-US10-HN重组病毒。进PCR鉴定,结果表明HN基因成功插入到鸭肠炎病毒US10基因内部。
杨承槐[9]（2014）在《鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性》文中认为鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是鸭、鹅及其它雁形目禽类的一种急性、接触性传染病,其特征是血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变,死亡率高,造成重大经济损失。该病的病原为鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）,又称为鸭瘟病毒,属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭疱疹病毒1型。本研究利用鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF）,将我国鸭肠炎病毒强毒参考株（DEV CSC）进行连续传代致弱,分析了强、弱毒株的全基因组序列特征以及致弱毒株的生物学特性,以期揭示DEV在体外传代致弱的分子基础；构建出DEV gE和gI基因的缺失毒株,分析了gE和gI基因对病毒毒力的影响,旨在为揭示DEV的分子致病机理奠定基础以及为开发DEV基因缺失疫苗提供科学依据。利用454测序平台,对DEV CSC进行了全基因组序列测定。结果表明,DEV CSC基因组全长162,131bp,共78个ORF,编码76个蛋白。全基因组比较发现,DEV CSC与2000年四川分离的DEV CHv株同源性高达99.99%,只有21个核苷酸替换（15个非同义和6个同义）和52个核苷酸缺失或插入,除了在UL41中有3个核苷酸连续插入外,其余核苷酸缺失或插入均在非编码区内；大部分非同义突变（10/15）位于基因组的5’末端。DEV CSC与2005年德国分离的DEV2085株的同源性为98.92%,主要差异是DEV2085株的UL区的5’端连续缺失1,170bp。与DEV CSC相比,鸡胚传代致弱株DEV K p63基因组短4,040bp,在UL区的5’端利3’端分别缺失3,513bp和528bp;76个ORF中有63个ORF的核苷酸序列完全一致,2个ORF（UL56和US10）在C端有移框变异,UL2连续缺失176个氨基酸。将DEV CSC经CEF连续传80代,进行全基因组序列测定,分析了基因组和生物学特性的变化。结果表明,前4代无明显细胞病变,第5代出现少量蚀斑样细胞病变,随代次增加,出现细胞病变时间提前；第25代蚀斑面积显着减小（p<0.01）,随后蚀斑面积稳定,各代次间无明显差异；第80代毒（DEV p80）基因组全长为160,328bp。与亲本病毒DEV CSC基因组相比,DEV p80基因组的145,818-147,618nt连续缺失共1,801bp,导致US7（gI）基因3’端和US8（gE）基因5’端缺失,此外,还有12个点突变,其中8个位于预测的ORF内,导致LORF4、UL51、UL9、UL7、UL4和US3共6个蛋白存在单个氨基酸变异。经临床症状、体温、病毒血症、泄殖腔排毒、大体病变、组织学病变、免疫组化和荧光定量PCR检测,比较了传代前后DEV致病性的差异,结果显示,DEV p80接种鸭未出现体温明显升高或临床症状,对消化道和淋巴器官无明显病理学损伤,消化道和淋巴器官中病毒拷贝数明显下降,表明DEV p80对鸭无致病性。攻毒保护试验结果表明,DEV p80具有良好的免疫原性,鸭免疫后5d,即可100%抵抗致死性强毒的攻击。gI和gE基因是疱疹病毒重要的毒力决定因子。为了证实gI和gE基因对DEV毒力的影响,以DEV CSC为亲本病毒,应用同源重组技术,构建出一株缺失145,818～147,618nt的重组病毒DEV-△US78-GFP,并比较了重组病毒及其亲本病毒的体内体外生物学特性。结果表明,重组病毒DEV-△US78-GFP在DEF中产生的蚀斑明显小于亲本病毒（p<0.001）：一步生长曲线也有所不同,DEV-△US78-GFP在细胞和上清中病毒含量峰值均为亲本病毒1/80左右,且到达峰值的时间分别延迟了24h和36h；重组病毒DEV-AUS78-GFP接种4周龄鸭,未出现明显的临床症状和大体病变。这些结果表明,gI利/或gE对DEV在细胞间传播和细胞中的复制有重要影响,是DEV重要的毒力决定因子。综上所述,本研究完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株的全基因组序列测定与分析；发现DEV经鸡胚成纤维细胞连续传代可导致gI和gE基因的缺失,失去对鸭的致病力,并具有良好的免疫原性；构建了缺失gI和gE基因的DEV突变株,经体内、体外试验证实,与其他疱疹病毒一样,DEV gI和／或gE基因对病毒在细胞间传播和毒力具有重要影响。本研究结果为DEV的分子致病机理以及基因缺失疫苗开发提供了科学依据。
李冰[10]（2012）在《表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建》文中提出鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE）是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类感染的一种急性、热性、接触性传染病。其主要特点是流行广泛，传播迅速，发病率及死亡率高，给养鸭业造成巨大经济损失。水禽和候鸟是本病传播媒介，且带毒达数年之久，给本病的防控带来困难。禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起禽类感染的烈性传染病。水禽和候鸟不仅是流感病毒的易感宿主，而且是禽流感病毒巨大的贮存库，其在H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）的传播和生态演变中发挥着重要的作用。HA基因是禽流感病毒的重要毒力基因，HA具有诱导机体产生中和抗体的能力，产生免疫保护作用，是研究基因工程疫苗的首选靶基因。本研究以鸭肠炎病毒DEV Clone-03株为亲本病毒，以胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因为外源基因插入位点，构建TK缺失重组鸭肠炎病毒。将本实验室构建的转移载体pTK-EGFP与DEV Clone-03基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），经蚀斑筛选、纯化，获得了一株表达绿色荧光蛋白的TK缺失重组鸭肠炎病毒TK-rDEV-EGFP。将重组区域进行序列测定，结果表明，EGFP表达盒插入鸭肠炎病毒TK基因内部。对重组病毒的生长曲线进行测定，并与亲本毒株DEV Clone-03进行比较，结果显示，重组病毒滴度略有下降，但二者生长曲线基本相似。将重组病毒TK-rDEV-EGFP在CEF细胞上连续传代至25代，每五代进行PCR检测及蚀斑观察，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白稳定表达，说明TK基因是病毒复制非必需基因，能够携带外源基因稳定表达，重组病毒的遗传稳定性较好。在成功构建重组鸭肠炎病毒TK-rDEV-EGFP的基础上，以H5N1亚型AIV HA基因为靶基因，构建携带HA基因表达盒的转移载体pTK-HA。以TK-rDEV-EGFP为亲本毒株，将转移载体pTK-HA与亲本病毒TK-rDEV-EGFP基因组共转染CEF，反向蚀斑筛选，获得表达HA基因的重组病毒TK-rDEV-HA。对病毒基因组重组区域进行序列测定，结果表明，HA基因插入DEV基因组中TK基因内部。应用间接免疫荧光（IFA）和Western blot方法检测重组病毒中HA基因表达情况，IFA检测，在TK-rDEV-HA感染CEF6h后即可检测到HA基因的表达，随着感染时间延长，HA表达量增加；Western blot方法检测，TK-rDEV-HA感染CEF48h后才可以检测到HA基因的表达，这可能是由于IFA较Western blot方法灵敏所致。生长曲线结果表明，重组病毒TK-rDEV-HA与其亲本病毒DEV Clone-03比较，重组病毒TK-rDEV-HA滴度稍有下降。将重组病毒TK-rDEV-HA在CEF上连续传代至25代，每五代进行PCR和Western blot检测，并结合蚀斑观察。结果表明，HA基因遗传稳定，表达稳定，重组病毒TK-rDEV-HA保持了亲本毒株的基本特性，可以作为鸭病毒性肠炎-禽流感重组活载体疫苗的候选毒株。
二、一株带有显性免疫抑制能力的鸭肠炎病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一株带有显性免疫抑制能力的鸭肠炎病毒（论文提纲范文）
（1）鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡传染性喉气管炎及鸡传染性喉气管炎病毒概述 |
| 1.1.1 鸡传染性喉气管炎病毒的发现及分类 |
| 1.1.2 鸡传染性喉气管炎流行病学 |
| 1.1.3 鸡传染性喉气管炎病毒的粒子特点及理化特性 |
| 1.1.4 鸡传染性喉气管炎的诊断与防控措施 |
| 1.2 鸡传染性喉气管炎病毒的分子生物学特征及研究进展 |
| 1.2.1 鸡传染性喉气管炎病毒基因组结构及特征 |
| 1.2.2 鸡传染性喉气管炎病毒与致病力及复制相关的主要基因 |
| 1.2.3 鸡传染性喉气管炎病毒的复制机制及细胞间的传播机制 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术概述 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统介绍 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9系统的分类及作用机制 |
| 1.3.3 全基因组文库CRISPR/Cas9筛选 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 2 试验一三株传染性喉气管炎病毒的生长特性及致病性研究 |
| 2.1 主要材料 |
| 2.1.1 毒株、鸡胚、细胞及试验动物来源 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 三株ILTV毒价的测定 |
| 2.2.2 三株ILTV生长趋势的比较 |
| 2.2.3 三株ILTV致病性试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 三株ILTV毒价测定 |
| 2.3.2 生长趋势比较 |
| 2.3.3 感染鸡临床症状 |
| 2.3.4 抗体检测 |
| 2.3.5 三株ILTV qPCR组织脏器分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 试验二三株传染性喉气管炎病毒基因组序列的测定与分析 |
| 3.1 主要材料 |
| 3.1.1 毒株、鸡胚、细胞及试验动物来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ILTV的扩增 |
| 3.2.2 ILTV的纯化 |
| 3.2.3 ILTV的基因组DNA提取 |
| 3.2.4 ILTV全基因组高通量测序 |
| 3.2.5 基因组结构注释 |
| 3.2.6 三株ILTV全基因组及蛋白的进化与比较分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 三株ILTV病毒纯化后病毒基因组DNA电泳图 |
| 3.3.2 ILTV全基因组高通量测序 |
| 3.3.3 三株ILTV基因组结构注释 |
| 3.3.4 三株ILTV全基因组及相关蛋白系统进化树分析 |
| 3.3.5 三株ILTV重要蛋白的比较分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 试验三利用CRISPR/Cas9敲除技术筛选对ILTV复制相关的宿主因子 |
| 4.1 主要材料 |
| 4.1.1 毒株、菌株及细胞来源 |
| 4.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的构建 |
| 4.2.2 鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库质粒的提取 |
| 4.2.3 鸡全基因组CRISPR/Cas9慢病毒的包装 |
| 4.2.4 鸡全基因组CRISPR/Cas9LMH细胞文库的构建 |
| 4.2.5 ILTV感染阳性细胞 |
| 4.2.6 LMH细胞基因组DNA的提取 |
| 4.2.7 引物设计 |
| 4.2.8 PCR产物胶回收 |
| 4.2.9 高通量测序 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡全基因组CRISPR/Cas9建库结果 |
| 4.3.2 慢病毒感染效率 |
| 4.3.3 嘌呤霉素筛选靶细胞 |
| 4.3.4 ILTV病毒筛选靶细胞 |
| 4.3.5 sgRNA扩增结果 |
| 4.3.6 高通量测序结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 试验四与宿主蛋白SPCS3相互作用的ILTV相关病毒蛋白的分析 |
| 5.1 主要材料 |
| 5.1.1 主要毒株、菌株及细胞来源 |
| 5.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 SPCS3多克隆抗体的制备 |
| 5.2.2 ILTV在截短细胞系与正常细胞上生长差异的确定 |
| 5.2.3 ILTV蛋白的构建与表达 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SPCS3蛋白截短细胞系验证 |
| 5.3.2 ILTV在1-14细胞和LMH细胞生长差异 |
| 5.3.3 LMH与SPCS3蛋白截短细胞系转染效率比较 |
| 5.3.4 ILTV蛋白表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 试验五SPCS3蛋白截短表达对其它α疱疹病毒复制的影响 |
| 6.1 主要材料 |
| 6.1.1 毒株、菌株及细胞来源 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 DEV和HSV-1在LMH及1-14细胞上的毒价滴定 |
| 6.2.2 DEV和HSV-1在LMH细胞与1-14细胞上生长差异的确定 |
| 6.2.3 DEV和HSV-1的病毒蛋白gL(UL1)蛋白在LMH细胞与1-14细胞表达差异的确定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 DEV及HSV-1的毒价结果 |
| 6.3.2 DEV及HSV-1在LMH及1-14细胞上生长差异比较结果 |
| 6.3.3 DEV及HSV-1的gL蛋白在LMH及1-14细胞上表达差异比较 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 全文讨论 |
| 8 全文结论 |
| 9 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）H7N9亚型禽流感病毒的进化监测及关键生物表型的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒的基本特征 |
| 1.2 禽流感HA蛋白的糖基化修饰 |
| 1.3 H7N9 亚型禽流感概述 |
| 1.3.1 H7N9 亚型禽流感的起源与进化 |
| 1.3.2 H7N9 亚型禽流感的对家禽和哺乳动物致病性以及传播性 |
| 1.4 影响H7N9 关键生物表型的因素 |
| 1.4.1 宿主适应性 |
| 1.4.2 致病性 |
| 1.4.3 受体结合特性 |
| 1.4.4 传播性 |
| 1.4.5 耐药性 |
| 1.4.6 抗原性 |
| 1.5 H7N9 亚型禽流感的防控 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 H7N9 亚型禽流感病毒的遗传演化 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 实验主要试剂及仪器 |
| 2.1.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.1.3 病毒株 |
| 2.1.4 病毒RNA的提取以及RT-PCR |
| 2.1.5 序列测定 |
| 2.1.6 序列和进化树分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 关键氨基酸分析 |
| 2.2.2 HA基因的遗传演化 |
| 2.2.3 NA基因的遗传演化 |
| 2.2.4 内部基因的遗传演化 |
| 2.2.5 基因型划分 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 H7N9 亚型禽流感病毒对家禽和小鼠的致病性 |
| 3.1 试验材料和方法 |
| 3.1.1 试验毒株 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 病毒的纯化以及鸡胚半数感染量(EID_(50))测定 |
| 3.1.4 家禽感染试验 |
| 3.1.5 小鼠感染试验 |
| 3.1.6 小鼠半数致死量(MLD_(50))的测定 |
| 3.1.7 试验操作条件 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 H7N9 亚型禽流感病毒对鸭的感染性 |
| 3.2.2 H7N9 亚型禽流感病毒对鸡的感染性 |
| 3.2.3 H7N9 亚型禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 H7N9 亚型禽流感病毒的受体结合特性分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 病毒株 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.1.3 病毒纯化浓缩 |
| 4.1.4 固相结合ELISA试验 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 H7N9 亚型禽流感病毒的抗原性 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 病毒株 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 血清制备 |
| 5.1.4 交叉血凝抑制实验 |
| 5.1.5 抗原性差异分析 |
| 5.1.6 免疫攻毒保护实验 |
| 5.1.7 试验操作条件 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 H7N9 亚型禽流感病毒抗原性变异的分子机制 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 病毒及质粒 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 引物 |
| 6.1.4 重组pBD质粒构建 |
| 6.1.5 病毒拯救 |
| 6.1.6 HA-HI试验 |
| 6.1.7 Western Blot试验 |
| 6.1.8 HA蛋白的3D结构分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 IM19与SD098在HA1 上氨基酸差异分析 |
| 6.2.2 点突变病毒的抗原性分析 |
| 6.2.3 糖基化影响病毒的抗原性 |
| 6.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 提出问题 |
| 1.2 选题背景和意义 |
| 1.3 文献综述 |
| 1.3.1 HBW-SPF鸭概述 |
| 1.3.2 间充质干细胞概述 |
| 1.3.3 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.3.4 鸭病毒性肝炎概述 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 第二章 鸭胚肝间充质干细胞的建立与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭胚肝源细胞的分离及传代培养 |
| 2.2.2 表面标记分子RT-PCR检测 |
| 2.2.3 诱导分化及鉴定 |
| 2.2.4 致瘤性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鸭胚肝来源干细胞的分离及传代 |
| 2.3.2 表面标记分子RT-PCR检测结果 |
| 2.3.3 诱导分化及鉴定结果 |
| 2.3.4 致瘤性检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 DEV C-KCE株在DULMSC中的生物学特性检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 DEV在4种Du LMSC上的连续传代 |
| 3.2.2 细胞病变观察 |
| 3.2.3 UL2基因的PCR检测 |
| 3.2.4 细胞切片电镜观察 |
| 3.2.5 DEV在4个Du LMSC细胞株上的一步生长曲线的绘制 |
| 3.2.6 DEV在4个Du LMSC细胞株上病毒滴度的比较 |
| 3.2.7 DEV在 CEF细胞上连续传代病毒滴度的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 细胞病变观察 |
| 3.3.2 UL2基因的PCR检测 |
| 3.3.3 细胞切片电镜观察 |
| 3.3.4 DEV在4个Du LMSC细胞株上的一步生长曲线 |
| 3.3.5 DEV在4个Du LMSC细胞株上的病毒滴度 |
| 3.3.6 DEV在 Du LMSC与 CEF细胞上病毒滴度的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 DHAV弱毒在DULMSC/4 上的增殖特性 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、毒株 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 DHAV-1与DHAV-3在Du LMSC/4 上的接种与传代 |
| 4.2.2 细胞病变观察 |
| 4.2.3 病毒基因的PCR检测 |
| 4.2.4 DHAV-1和DHAV-3在Du LMSC/4 上增殖情况检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 细胞病变观察 |
| 4.3.2 病毒基因PCR检测 |
| 4.3.3 标准曲线的绘制 |
| 4.3.4 DHAV-1和DHAV-3在Du LMSC/4 上增殖情况检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 DEV感染DULMSC/4对MHC I类分子的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、毒株和实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 B1、B2、B3、B4鸭UAA基因完整编码区序列的测定 |
| 5.2.2 免疫原的制备 |
| 5.2.3 鸭MHCI类分子特异性单抗的制备 |
| 5.2.4 DEV感染对MHC I类分子的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 B1、B2、B3、B4鸭UAA基因完整编码区序列的扩增 |
| 5.3.2 p ET-UAAα2α3 原核表达重组质粒的构建 |
| 5.3.3 诱导表达及纯化条件的优化 |
| 5.3.4 单抗细胞的筛选 |
| 5.3.5 腹水的亚型鉴定 |
| 5.3.6 G1的特异性分析结果 |
| 5.3.7 Du LMSC/4 表面MHC I流式细胞术检测方法的建立 |
| 5.3.8 DEV感染对细胞表面MHC I类分子表达的影响 |
| 5.3.9 DEV感染对MHC I类分子转录的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1 H7N9流感病毒的流行现状 |
| 1.1 流行现状 |
| 1.2 基本结构 |
| 2 流感疫苗的研究进展 |
| 2.1 流感病毒疫苗的研究现状 |
| 2.2 通用型流感病毒疫苗的研究 |
| 3 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 3.1 流感VLP疫苗的制备 |
| 3.2 VLP表达系统 |
| 3.3 流感病毒样颗粒疫苗的研究进展及前景 |
| 参考文献 第二章 基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、质粒、菌株和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 鸡胚和实验动物 |
| 1.5 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 疫苗的制备 |
| 2.8 攻毒用病毒的准备 |
| 2.9 疫苗免疫实验 |
| 2.10 攻毒保护实验 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 3.4 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.5 H7N9 VLP的HA滴度测定 |
| 3.6 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.7 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 第三章 基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株、细胞、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 鸡胚和实验动物 |
| 1.4 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 VLP疫苗的制备 |
| 2.8 疫苗免疫实验 |
| 2.9 攻毒保护实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.4 H7N9 VLP的滴度测定 |
| 3.5 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.6 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 全文总结 致谢 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）HPAIV H7N9/AAca减毒活疫苗在哺乳动物模型上的免疫保护力评价及其与细菌的协同致死作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 Summary 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.1 H7N9流感病毒人感染概况 |
| 1.1.1 H7N9流感病毒的流行区域 |
| 1.1.2 H7N9人类感染病例 |
| 1.2 H7N9流感病毒的遗传特点和进化 |
| 1.2.1 H7N9流感病毒基因多样性 |
| 1.2.2 HA基因 |
| 1.2.3 NA基因 |
| 1.2.4 内部基因 |
| 1.2.5 基因突变 |
| 1.3 H7N9流感病毒的病毒学研究现状 |
| 1.3.1 H7N9流感病毒对人的致病力 |
| 1.3.2 H7N9流感病毒在动物模型上的研究 |
| 1.3.3 受体结合特异性 |
| 1.4 HPAI H7N9病毒研究进展 |
| 1.4.1 2017年HPAI H7N9病毒在中国家禽群体中的流行情况 |
| 1.4.2 HPAI H7N9病毒的进化分析 |
| 1.4.3 HPAI H7N9病毒致病力提升 |
| 1.4.3.1 HPAI H7N9病毒对小鼠的致病力 |
| 1.4.3.2 高致病性H7N9和H7N2流感病毒对鸭的致病力 |
| 1.4.4 H7N9流感病毒对人类威胁增大 |
| 1.4.4.1 感染哺乳动物后H7N9流感病毒易获得突变 |
| 1.4.4.2 高致病H7N9流感病毒获得突变后对人类威胁增大 |
| 1.5 H7N9流感病毒的预防控制 |
| 1.5.1 人H7N9流感防控 |
| 1.5.2 禽H7N9流感防控 |
| 1.5.3 H5/H7双价灭活疫苗保护效力 |
| 1.5.4 疫苗保护策略 |
| 1.6 讨论 第二章 H7N9/AAca减毒活疫苗阻止H7N9流感病毒复制的免疫保护评估 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 疫苗 |
| 2.1.2 病毒 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 小鼠试验 |
| 2.1.5.1 CK/S1220、CK/SD008-PB2/627K和CK/SD057病毒的小鼠半数致死量及半数感染量测定 |
| 2.1.5.2 H7N9/AAca疫苗对小鼠免疫保护力 |
| 2.1.7 受体结合试验 |
| 2.1.8 病毒滴定 |
| 2.1.9 抗体水平检测 |
| 2.1.10 统计分析 |
| 2.1.11 实验设施和道德声明 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CK/S1220、CK/SD008-PB2/627K和CK/SD057病毒对小鼠半数致死量和半数感染量测定 |
| 2.2.2 2013AH/1病毒与CK/S1220、CK/SD008-PB2/627K和CK/SD057病毒间的遗传和抗原差异 |
| 2.2.3 H7N9/AAca疫苗保护小鼠低抗CK/S1220、CK/SD008-PB2/627K和CK/SD057病毒的免疫效力 |
| 2.2.4 CK/S1220和CK/S008-PB2/627K病毒具有不同的受体结合特性 |
| 2.3 讨论 第三章 H7N9/AAca减毒活疫苗阻止HPAI H7N9病毒传播的免疫保护评估 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 疫苗和病毒 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 豚鼠传播试验设施 |
| 3.1.4 CK/S1220和CK/SD008-PB2/627K病毒在豚鼠上的复制和传播试验 |
| 3.1.5 H7N9/AAca疫苗阻止CK/SD008-PB2/627K病毒在豚鼠间传播试验 |
| 3.1.6 病毒滴定 |
| 3.1.7 抗体检测 |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HPAI H7N9病毒CK/S008-PB2/627K通过飞沫在豚鼠间高效传播 |
| 3.2.2 H7N9/AAca疫苗阻止CK/S008-PB2/627K在豚鼠间传播 |
| 3.3 讨论 第四章 细菌与H7N9流感病毒协同致死作用的研究 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.2 病毒 |
| 4.1.3 试验动物及试验环境 |
| 4.1.4 试剂 |
| 4.1.5 AH/1和GP/S1421病毒对小鼠致死剂量的测定 |
| 4.1.6 AH/1和GP/S1421感染小鼠其下呼吸道细菌的计数和分离 |
| 4.1.7 细菌的DNA提取和鉴定 |
| 4.1.8 细菌与AH/1流感病毒在小鼠模型上的共感染试验 |
| 4.1.9 病毒滴定 |
| 4.1.10 荧光染色 |
| 4.1.11 实验设施和道德声明 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 AH/1 H7N9流感病毒可导致C57BL/6小鼠死亡 |
| 4.2.2 AH/1感染小鼠下呼吸道发生细菌感染 |
| 4.2.3 从AH/1感染的小鼠下呼吸道中分离出五种细菌 |
| 4.2.4 AH/1病毒和细菌共感染促进小鼠发病和死亡 |
| 4.2.5 链球菌与AH/1流感病毒的协同作用受感染顺序的影响 |
| 4.2.6 链球菌与H7N9病毒协同致病过程中无唾液酸受体参与的相互作用 |
| 4.3 讨论 全文结论 参考文献 致谢 作者简介 |
（6）鸭甲肝病毒3型广东分离株致病性及表达其VP1基因重组鸭肠炎病毒免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 英文摘要 1 引言 |
| 1.1 鸭病毒性肝炎的概述 |
| 1.1.1 鸭肝炎的流行病学特点 |
| 1.1.2 鸭肝炎的临床症状及病理变化 |
| 1.1.3 鸭病毒性肝炎的诊断 |
| 1.1.4 鸭肝炎疫苗的研究进展 |
| 1.1.5 鸭肝炎卵黄抗体及高免血清的研究进展 |
| 1.1.6 展望 |
| 1.2 鸭甲肝病毒的研究进展 |
| 1.2.1 鸭甲肝病毒的分类 |
| 1.2.2 病原学特征 |
| 1.2.3 鸭肝炎病毒基因组结构与功能 |
| 1.2.4 鸭肝炎病毒的复制 |
| 1.3 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 病理损伤及病理变化 |
| 1.3.4 诊断 |
| 1.3.5 鸭病毒性肠炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 鸭肠炎病毒研究进展 |
| 1.4.1 鸭肠炎病毒的生物学特性 |
| 1.4.2 致病机制 |
| 1.4.3 鸭肠炎病毒的复制 |
| 1.4.4 鸭肠炎病毒的分子生物学特性 |
| 1.4.5 鸭肠炎病毒US10基因的研究进展 |
| 1.5 重组DEV活载体疫苗的研究进展 |
| 1.6 Cre/LoxP重组系统的概述 |
| 1.6.1 Cre/LoxP重组的产生及其特性 |
| 1.6.2 Cre/LoxP重组系统在重组病毒研究中的应用 |
| 1.7 病毒感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.7.1 DHAV感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.7.2 DEV感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.7.3 其他病原感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 1.8 本研究的目的与意义 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 毒株、菌株、抗体及载体等 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 鸭甲肝病毒3型致病性的研究 |
| 2.2.2 DHAV-3感染雏鸭肝脏的转录组分析 |
| 2.2.3 雏鸭感染DHAV-3天然免疫应答相关分子的检测 |
| 2.2.4 DHAV-3全基因的克隆 |
| 2.2.5 DHAV-3 VP1基因的克隆及其抗原优势区的鉴定 |
| 2.2.6 重组病毒转移载体的构建 |
| 2.2.7 含筛选标记gpt的重组病毒的筛选、纯化及鉴定 |
| 2.2.8 不含筛选标记gpt的重组病毒的筛选及纯化 |
| 2.2.9 重组病毒rDEV-AUs10-3-VP1的鉴定 |
| 2.2.10 重组病毒生物学特性的基本研究 |
| 2.2.11 免疫及效果评价 3 结果与分析 |
| 3.1 DHAV-3的致病性研究 |
| 3.1.1 DHAV-3致死鸭胚及雏鸭临床症状的观察 |
| 3.1.2 感染DHAV-3雏鸭肝脏中病毒的RT-PCR鉴定 |
| 3.1.3 DHAV-3致死鸭胚肝脏及雏鸭各组织病理组织切片观察 |
| 3.1.4 病毒粒子形态的观察 |
| 3.1.5 DHAV-3的冻干 |
| 3.1.6 DHAV-3的毒力鉴定 |
| 3.2 转录组测序分析雏鸭感染DHAV-3后差异基因的表达 |
| 3.2.1 差异表达基因的筛选 |
| 3.2.2 差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.2.3 差异表达基因的KEGG富集分析 |
| 3.2.4 差异表达基因的RT-qPCR验证 |
| 3.3 DHAV-3感染鸭的天然免疫应答的研究 |
| 3.3.1 DHAV-3致死雏鸭各组织内病毒载量检测 |
| 3.3.2 雏鸭感染DHAV-3后肝脏及脾脏病毒载量检测 |
| 3.3.3 雏鸭感染DHAV-3后肝脏及脾脏病理切片观察 |
| 3.3.4 雏鸭感染DHAV-3后肝脏及脾脏免疫相关分子的检测 |
| 3.4 DHAV-3全基因的克隆及序列分析 |
| 3.4.1 DHAV-3全基因的克隆及鉴定 |
| 3.4.2 DHAV-3序列的同源性比对及系统进化树分析 |
| 3.5 DHAV-3 VP1基因的克隆及其抗原优势区的鉴定 |
| 3.5.1 DHAV-3 VP1基因的PCR扩增及其克隆载体的构建 |
| 3.5.2 DHAV-3 VP1分段截短表达 |
| 3.5.3 DHAV-3 VP1抗原优势区的鉴定 |
| 3.6 重组病毒转移载体的构建 |
| 3.6.1 筛选标记gpt-loxP表达盒的构建 |
| 3.6.2 VP1表达盒的构建 |
| 3.6.3 重组病毒转移载体的构建 |
| 3.7 不含筛选标记gpt的重组病毒的筛选及鉴定 |
| 3.7.1 含筛选标记gpt重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.7.2 Cre基因的克隆及其真核表达载体的构建 |
| 3.7.3 不含筛选标记gpt重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1的PCR鉴定 |
| 3.7.4 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1的RT-PCR鉴定 |
| 3.7.5 Western blot检测rDEV-△Us10-3-VP1中VP1蛋白的表达 |
| 3.7.6 rDEV-△Us10-3-VP1的VP1基因表达产物的IFA检测 |
| 3.8 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1基本生物学特性研究 |
| 3.8.1 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1中VP1基因遗传稳定性分析 |
| 3.8.2 重组病毒与亲本病毒蚀斑直径大小的比较 |
| 3.8.3 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1的电镜观察 |
| 3.8.4 重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1生长曲线的绘制 |
| 3.9 免疫及效果评价 |
| 3.9.1 安全性试验 |
| 3.9.2 重组病毒免疫产蛋鸭及雏鸭后特异性抗体IgG的检测 |
| 3.9.3 中和抗体效价的测定 |
| 3.9.4 免疫血清中DHAV-3 VP1特异性抗体的Western blot鉴定 |
| 3.9.5 免疫鸭外周血淋巴细胞中CD4~+及CD8~+T淋巴细胞的检测 |
| 3.9.6 攻毒保护性试验 4 讨论 |
| 4.1 雏鸭感染DHAV-3的转录组测序 |
| 4.2 雏鸭感染DHAV-3的天然免疫应答 |
| 4.2.1 TLR7、RIG-1及MDA5的转录 |
| 4.2.2 IL-1β、IL-2及IL-6的转录 |
| 4.2.3 IFNs及ISGs的转录 |
| 4.3 DHAV-3 VP1抗原优势区的初步筛选 |
| 4.4 表达DHAV-3 VP1基因重组鸭肠炎病毒的构建 |
| 4.4.1 外源基因的选择 |
| 4.4.2 病毒载体的选择 |
| 4.4.3 US10基因作为插入位点 |
| 4.5 重组病毒的构建及筛选方法的选择 |
| 4.5.1 重组病毒的构建 |
| 4.5.2 重组病毒筛选方法的选择 |
| 4.6 DHAV-3 VP1基因在体外细胞内的表达 |
| 4.7 动物试验结果分析 |
| 4.7.1 免疫产蛋鸭血清及卵黄中的抗体检测 |
| 4.7.2 免疫产蛋鸭CD4~+T细胞与CD8~+T细胞的检测 |
| 4.7.3 攻毒保护性试验 5 结论 致谢 参考文献 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）表达IBV主要结构蛋白重组DEV的构建及其免疫保护性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 外文缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1 传染性支气管炎 |
| 1.1 传染性支气管炎概述 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒分子生物学 |
| 1.3 传染性支气管炎流行病学 |
| 2 鸭病毒性肠炎 |
| 2.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 2.2 鸭肠炎病毒分子生物学 |
| 2.3 鸭肠炎病毒疫苗载体研究进展 |
| 3 传染性支气管炎新型基因工程疫苗 |
| 第二章 表达IBV N基因重组DEV的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与细胞 |
| 1.1.2 质粒与菌种 |
| 1.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 转移载体的构建 |
| 1.2.1.1 IBV N基因的扩增与克隆 |
| 1.2.1.2 p U10-TPA-N转移载体的构建 |
| 1.2.2 转移载体质粒的大量制备 |
| 1.2.3 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.2.4 病毒基因组的提取 |
| 1.2.5 重组病毒的构建 |
| 1.2.6 重组病毒的筛选 |
| 1.2.7 重组病毒的鉴定 |
| 1.2.8 重组病毒的生物学特性 |
| 1.2.8.1 重组病毒的滴度 |
| 1.2.8.2 重组病毒的复制动力学 |
| 1.2.8.3 重组病毒遗传稳定性 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒p T-N的鉴定 |
| 2.2 p U10-TPA-N转移载体的构建 |
| 2.3 重组病毒蚀斑筛选 |
| 2.4 重组病毒r DEV US10-N PCR鉴定 |
| 2.5 重组病毒r DEV US10-N间接免疫荧光鉴定 |
| 2.6 重组病毒r DEV US10-N Western blot鉴定 |
| 2.7 重组病毒r DEV US10-N生长曲线测定 |
| 2.8 重组病毒r DEV US10-N遗传稳定性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 表达IBV S基因重组DEV的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 病毒与细胞 |
| 1.1.2 质粒与菌种 |
| 1.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 转移载体的构建 |
| 1.2.1.1 IBV S基因的扩增与克隆 |
| 1.2.1.2 p U10-TPA-S转移载体的构建 |
| 1.2.2 转移载体质粒的大量制备 |
| 1.2.3 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.2.4 病毒基因组的提取 |
| 1.2.5 重组病毒的构建 |
| 1.2.6 重组病毒的筛选 |
| 1.2.7 重组病毒的鉴定 |
| 1.2.8 重组病毒的生物学特性 |
| 1.2.8.1 重组病毒的滴度 |
| 1.2.8.2 重组病毒的复制动力学 |
| 1.2.8.3 重组病毒遗传稳定性 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒p T-S的鉴定 |
| 2.2 p U10-TPA-S转移载体的构建 |
| 2.3 重组病毒蚀斑筛选 |
| 2.4 重组病毒r DEV US10-S PCR鉴定 |
| 2.5 重组病毒r DEV US10-S间接免疫荧光鉴定 |
| 2.6 重组病毒r DEV US10-S Western blot鉴定 |
| 2.7 重组病毒r DEV US10-S生长曲线测定 |
| 2.8 重组病毒r DEV US10-S遗传稳定性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 表达IBV S1基因重组DEV的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与细胞 |
| 1.1.2 质粒与菌种 |
| 1.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 转移载体的构建 |
| 1.2.1.1 IBV S1基因的扩增与克隆 |
| 1.2.1.2 p U10-TPA-S1转移载体的构建 |
| 1.2.2 转移载体质粒的大量制备 |
| 1.2.3 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.2.4 病毒基因组的提取 |
| 1.2.5 重组病毒的构建 |
| 1.2.6 重组病毒的筛选 |
| 1.2.7 重组病毒的鉴定 |
| 1.2.8 重组病毒的生物学特性 |
| 1.2.8.1 重组病毒的滴度 |
| 1.2.8.2 重组病毒的复制动力学 |
| 1.2.8.3 重组病毒遗传稳定性 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒p T-S1的鉴定 |
| 2.2 p U10-TPA-S1转移载体的构建 |
| 2.3 重组病毒r DEV US10-S1蚀斑筛选 |
| 2.4 重组病毒r DEV US10-S1 PCR鉴定 |
| 2.5 重组病毒r DEV US10-S1间接免疫荧光鉴定 |
| 2.6 重组病毒r DEV US10-S1 Western blot鉴定 |
| 2.7 重组病毒r DEV US10-S1生长曲线测定 |
| 2.8 重组病毒r DEV US10-S1遗传稳定性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 重组疫苗免疫保护效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与细胞 |
| 1.1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 IBV重组鸭肠炎疫苗的制备 |
| 1.2.2 重组疫苗免疫保护性 |
| 1.2.3 IBV抗体滴度检测 |
| 1.2.4 荧光定量RT-PCR检测攻毒后排毒 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 IBV重组鸭肠炎病毒活载体疫苗的制备 |
| 2.2 重组疫苗免疫SPF鸡后的抗体反应 |
| 2.3 重组疫苗的攻毒保护情况 |
| 2.3.1 发病率及死亡率 |
| 2.3.2 攻毒后排毒情况 |
| 2.3.3 攻毒后抗体水平变化 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（8）表达新城疫病毒F和HN基因重组鸭肠炎病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.1.1 病原学特性 |
| 1.1.2 鸭病毒性肠炎的流行病学 |
| 1.2 鸭病毒性肠炎分子生物学研究进展 |
| 1.3 鸭肠炎病毒的检测方法 |
| 1.4 鸭病毒性肠炎的防治 |
| 1.5 鸭肠炎病毒作为疫苗载体的研究进展 |
| 1.6 新城疫概况 |
| 1.6.1 新城疫病毒的基因组结构及主要蛋白 |
| 1.6.2 新城疫疫苗研究 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 表达新城疫病毒F基因重组鸭肠炎病毒的构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 质粒和菌种 |
| 2.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pUS10-TPA-F转移载体的构建思路 |
| 2.2.2 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2.4 转移载体的大量制备 |
| 2.2.5 鸭肠炎病毒基因组的提取 |
| 2.2.6 病毒基因组与转移载体共转染 |
| 2.2.7 重组病毒的筛选与鉴定 |
| 2.2.8 重组病毒复制动力学的测定 |
| 2.2.9 重组病毒的遗传稳定性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 pUS10-TPA-F转移载体的鉴定 |
| 2.3.2 重组病毒的纯化和鉴定结果 |
| 2.3.3 生长曲线测定结果 |
| 2.3.4 遗传稳定性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 新城疫病毒F基因 |
| 2.4.2 重组鸭肠炎病毒的研究 |
| 2.4.3 重组病毒的筛选与鉴定 |
| 第三章 表达新城疫病毒HN基因重组鸭肠炎病毒的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒和细胞 |
| 3.1.2 质粒和菌种 |
| 3.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 pUS10-TPA-HN转移载体的构建思路 |
| 3.2.2 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 3.2.3 转移载体的大量制备 |
| 3.2.4 病毒基因组与转移载体共转染 |
| 3.2.5 重组病毒的筛选和鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pUS10-TPA-HN转移载体的鉴定 |
| 3.3.2 重组病毒的纯化和鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 新城疫病毒HN蛋白 |
| 3.4.2 重组病毒的筛选和鉴定 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 文章发表情况 |
（9）鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 1.3 研究内容和技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定与分析 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸭肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代及基因组变异分析 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸭肠炎病毒传代致弱毒株的致病性与免疫原性分析 |
| 摘要 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 鸭肠炎病毒gE和gI基因缺失株的构建与致病性分析 |
| 摘要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 创新点 |
| 第八章 文献综述 |
| 8.1 历史 |
| 8.2 病原学 |
| 8.3 分子生物学 |
| 8.4 流行病学 |
| 8.5 病理学 |
| 8.6 诊断 |
| 8.7 预防和控制 |
| 8.8 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸭病毒性肠炎概述 |
| 1.1.1 病原及流行病学 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.2 鸭肠炎病毒基因组研究概况 |
| 1.3 鸭肠炎病毒疫苗概况 |
| 1.4 水禽禽流感流行现状 |
| 1.5 重组病毒构建策略 |
| 1.5.1 重组病毒的构建原则 |
| 1.5.2 重组病毒的构建方法 |
| 1.6 疱疹病毒作为疫苗载体的研究 |
| 1.7 研究的目的及意义 |
| 第二章 表达绿色荧光蛋白的 TK 缺失重组鸭肠炎病毒的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 转移载体的构建思路 |
| 2.2.2 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2.3 鸭肠炎病毒蚀斑滴度测定（PFU） |
| 2.2.4 转移载体质粒的大量制备 |
| 2.2.5 鸭肠炎病毒基因组的提取 |
| 2.2.6 病毒基因组与转移载体的共转染 |
| 2.2.7 重组病毒的筛选及鉴定 |
| 2.2.8 重组病毒的生长曲线测定 |
| 2.2.9 重组病毒遗传稳定性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组病毒蚀斑筛选结果 |
| 2.3.2 重组病毒鉴定结果 |
| 2.3.3 重组病毒生长曲线测定结果 |
| 2.3.4 重组病毒遗传稳定性鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 表达 H5N1 亚型禽流感病毒 HA 基因重组鸭肠炎病毒的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒与细胞 |
| 3.1.2 质粒与菌种 |
| 3.1.3 酶类及主要生化试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 转移载体的构建 |
| 3.2.2 重组病毒的筛选及鉴定 |
| 3.2.3 重组病毒的蚀斑纯化 |
| 3.2.4 重组病毒的鉴定 |
| 3.2.5 重组病毒生长曲线测定 |
| 3.2.6 重组病毒的遗传稳定性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pTK-HA 转移载体的鉴定结果 |
| 3.3.2 重组病毒的纯化与鉴定结果 |
| 3.3.3 生长曲线测定结果 |
| 3.3.4 遗传稳定性鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 禽流感病毒 HA 基因 |
| 3.4.2 鸭肠炎病毒载体研究进展 |
| 3.4.3 重组病毒的筛选与鉴定 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 文章发表情况 |
四、一株带有显性免疫抑制能力的鸭肠炎病毒（论文参考文献）
- [1]鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究[D]. 吴咪. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [2]H7N9亚型禽流感病毒的进化监测及关键生物表型的分子机制研究[D]. 尹馨. 中国农业科学院, 2021(01)
- [3]MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立及应用[D]. 佟相慧. 中国农业科学院, 2020(01)
- [4]基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究[D]. 李如梦. 扬州大学, 2020(04)
- [5]HPAIV H7N9/AAca减毒活疫苗在哺乳动物模型上的免疫保护力评价及其与细菌的协同致死作用研究[D]. 杨雯昱. 甘肃农业大学, 2019
- [6]鸭甲肝病毒3型广东分离株致病性及表达其VP1基因重组鸭肠炎病毒免疫效果的研究[D]. 张雪莲. 东北农业大学, 2017(01)
- [7]表达IBV主要结构蛋白重组DEV的构建及其免疫保护性评价[D]. 王玉龙. 甘肃农业大学, 2015(04)
- [8]表达新城疫病毒F和HN基因重组鸭肠炎病毒的构建[D]. 张苗苗. 中国农业科学院, 2014(11)
- [9]鸭肠炎病毒及其致弱毒株基因组的分子特征和生物学特性[D]. 杨承槐. 中国农业大学, 2014(08)
- [10]表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建[D]. 李冰. 中国农业科学院, 2012(10)