一、绵羊高效繁殖的生物工程技术（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中指出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
种玉晴[2]（2021）在《绵羊产羔数性状的分子遗传机理研究》文中认为绵羊产羔数是育种的重要性状,它是提高产能和效益的关键指标。产羔数是微效多基因控制的复合数量性状,传统育种方法难以对产羔数实现高效的定向选育提高。本研究采用全基因组—基因通路—单基因的研究路线,通过全基因组选择信号检测挖掘绵羊产羔数候选基因,旨在解析绵羊多羔性状形成的分子遗传机理。以期为绵羊产羔数的高效选育提供候选基因或遗传标记,有助于绵羊产羔数的精准选育提高,对于绵羊产业的高效发展具有重要意义。本研究从400只经产湖羊母羊群体中挑选平均产羔数两尾分布的各20只湖羊,划分为单羔和多羔两个试验群体,进行全基因组重测序,通过全基因组选择信号检测筛选产羔数候选基因。结合转录组测序和选择作用分析解析BMP-BMPR-Smad信号通路基因以及ZP3基因在湖羊母羊性腺轴组织中的转录水平以及在物种间和绵羊种内的选择作用。基于蒙古系绵羊群体迁移过程中有效群体规模的变化及BMPR1B基因的FecB突变年龄的计算对FecB突变位点的选择作用进行深入分析。本研究的主要结果如下:（1）通过对单羔和多羔湖羊群体进行全基因组选择信号检测,筛选出了包括BMP2、BMP5、BMPR1B和ZP3基因等47个绵羊产羔数候选基因;（2）BMP2、BMP5、BMP6、BMP7、BMPR1A、BMPR1B、Smad1、Smad4和Smad5这9个基因在物种间受到纯化选择作用,而在绵羊这一枝中却检测到了正选择信号;（3）BMPR1B基因的FecB突变发生的时间约为五千年前。在距今约1600和1000年前,蒙古系绵羊群体发生了两次有效群体规模的骤减。Meta分析和回归分析结果表明FecB突变型等位基因频率与产羔数和纬度显着相关（p<0.05）。该突变位点在物种间受到纯化选择作用,而在绵羊群体中受到正选择作用;（4）本研究在ZP3基因中筛选到了一个非同义突变位点（rs401271989）,该位点的变异与湖羊的头胎产羔数显着相关（p<0.05）。本研究的主要结论如下:（1）绵羊的产羔数性状是由多基因控制的,本研究共统计识别出47个绵羊产羔数候选基因;（2）绵羊BMPR1B基因的FecB突变能显着影响产羔数,每个拷贝可增加0.4-0.5个产羔数。估算该突变发生在约五千年前,随着蒙古系绵羊群体从蒙古高原向长江流域迁徙,选择压力的松弛驱动FecB突变在群体中迅速扩散;（3）湖羊ZP3基因中的非同义突变位点（rs401271989）与头胎产羔数显着相关,可作为产羔数选育的分子标记。综上所述,BMPR1B和ZP3基因可作为绵羊产羔数性状的主效基因或候选基因用于基因选择或分子标记辅助选择,以提高多羔绵羊选种的准确性。
王明远[3]（2021）在《基于全基因组重测序筛选多胎萨福克羊高繁殖力相关基因的研究》文中提出目的:多胎萨福克羊是我国自主培育的优质多胎肉羊新品系,为探究其繁殖性状的分子机制,本研究利用全基因组重测序技术对多胎萨福克羊,及其父本品种萨福克羊和母本品种湖羊进行重测序,筛选繁殖性状相关基因,揭示育成种的遗传基础,为多胎肉羊新品种的选育提供依据。方法:（1）应用全基因组重测序技术对50只多胎萨福克羊、20只湖羊和20只萨福克羊进行重测序,利用群体固定指数（FST）和杂合度分析的方法进行全基因组选择信号检测,解析品种特异的繁殖相关基因。（2）应用FST和杂合度分析方法检测多胎萨福克羊多羔组和单羔组繁殖差异基因。（3）将筛选到的MTNR1A作为繁殖性状候选基因,采用PCR-RFLP方法分析MTNR1A基因在多胎萨福克羊群体中的多态性,利用最小二乘法分析基因SNPs和单倍型与绵羊产羔数的关系。结果:（1）获得5,245.855G原始数据和5,236.338G高质量基因组数据。筛选到多胎萨福克羊繁殖相关基因WNT10A、SENP2、WNT6等14个,多胎萨福克羊特异基因ARHGEF4、CATIP、CCDC115等23个。（2）从多胎萨福克羊多羔组和单羔组中筛选到ADAMTS5、CAB39L和MTNR1A等28个繁殖性状相关基因。（3）以MTNR1A基因为繁殖性状候选基因,检测到MTNR1A基因exon2存在SNP1（Chr 26.15,099,314,G735A）、SNP2（Chr 26.15,099,296,G753A）和SNP3（Chr 26.15,099,204,C845A）,3个SNPs在多胎萨福克羊中均存在三种基因型。关联分析表明,SNP1的GG基因型、SNP2的GG基因型与多胎萨福克羊产羔数显着相关（P<0.05）,单倍型H1与产羔数极显着相关（P<0.01）。结论:（1）筛选出多胎萨福克羊特异的23个基因和87个SNPs。（2）筛选出多胎萨福克羊28个与繁殖性状相关基因和180个SNPs。（3）MTNR1A基因SNP1和SNP2位点GG基因型、单倍型H1可以作为多胎萨福克羊高繁殖力辅助选择的标记。
张云峰[4]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中认为绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
吴艳芳[5]（2021）在《MSTN基因敲除和FecB基因突变滩羊扩繁试验》文中研究说明滩羊是我国宁夏自治区及其周边省区的特色地方品种。滩羊裘皮洁白美观,肉质鲜美且无膻味,因此滩羊产业具有广阔的市场前景。然而滩羊存在体格较小、生长发育较迟缓、繁殖性能低等缺点,影响了滩羊养殖场（户）的养殖经济效益和滩羊产业发展。提高滩羊繁殖效率,培育体型大、生长发育快、繁殖性能高等典型肉羊特征的肉用滩羊新品系是促进滩羊产业发展的关键所在。肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）是阻碍肌肉生长发育的调控因子,其在骨骼肌中的表达能够抑制肌肉的生长发育。FecB（fecundity booroola,FecB）基因是控制绵羊产羔性状的主效基因,其关键位点的突变可增加排卵数和产羔数。论文作者所在团队利用基因编辑技术（CRISPR-Cas9）获得了MSTN基因敲除滩羊公羊和母羊个体;利用荧光定量PCR技术在滩羊自然群体中,鉴定筛选出了FecB基因突变滩羊公羊和母羊个体。为迅速扩大MSTN基因敲除滩羊和FecB基因突变滩羊个体数量,为育成繁殖性能高、生长发育快的滩羊新品提供更多的育种材料。本试验以MSTN基因敲除滩羊公羊与MSTN基因敲除滩羊母羊或普通母羊,以及FecB基因突变的滩羊公羊与FecB基因突变滩羊母羊或普通母羊为对象,采用对自然发情或同期发情母羊人工授精的技术措施扩大MSTN基因敲除、FecB基因突变滩羊群体数量。并在羔羊出生后15日龄起使用羔羊颗粒料进行羔羊培育,定期进行称重和测量体尺,并对所有成活羔羊进行基因检测。试验内容和获得的结果如下:（1）以4只MSTN基因敲除滩羊公羊和330只普通滩羊母羊为试验对象,每天利用试情公羊对母羊群早、晚各试情一次,318只发情母羊分别于发情后12h和24h采用阴道底部输精法进行人工授精,返情母羊再进行人工授精,共计进行3个情期的人工授精。以产羔母羊数为准计算妊娠母羊数,共有220只母羊妊娠,产羔233只,母羊妊娠率为69.18%,产羔率110.95%;对15日龄存活的205只羔羊颈静脉采血后,利用Sanger测序技术检测后代羔羊MSTN基因序列,测序结果显示后代中72只羔羊为MSTN基因敲除阳性个体,后代阳性比率为35.12%;60日龄羔羊存活195只,60日龄羔羊成活率为83.69%;周岁以内体重监测结果显示,所有后代体重平稳增长,MSTN基因敲除阳性后代体重在各生长阶段均显着高于阴性个体（p<0.05）。（2）以4只MSTN基因敲除滩羊公羊、12只MSTN基因敲除滩羊母羊、5只FecB基因突变公羊、52只FecB基因突变母羊和526只普通滩羊母羊为试验对象,采用以下4种扩繁组合:（1）3只MSTN基因敲除公羊与12只MSTN基因敲除母羊;（2）4只MSTN基因敲除公羊与268普通母羊;（3）5只FecB基因突变公羊与52只FecB基因突变母羊;（4）5只FecB基因突变公羊与258只普通母羊,展开扩繁试验。采用两次PG法或NRID+PMSG+PG法对母羊进行同期发情或通过公羊试情选出自然发情母羊,分别于母羊发情后12 h和24 h采用阴道底部输精法进行人工授精,返情母羊再进行人工授精,共计三个情期。以产羔母羊数为准计算妊娠母羊数,共410只母羊妊娠,产羔455只,母羊妊娠率为69.97%,产羔率110.98%。60日龄羔羊存活351只,60日龄羔羊成活率为77.14%。对存活羔羊颈静脉采血后,利用Sanger测序技术检测后代羔羊MSTN基因序列、利用荧光定量PCR技术检测后代羔羊FecB基因序列,第1组中（11只MSTN基因敲除母羊发情并配种）8只母羊妊娠,产羔10只,母羊妊娠率为72.72%,产羔率125.00%;60日龄5只羔羊存活,其中3只羔羊为FecB基因突变且MSTN基因敲除个体（基因型用“MB”表示）,2只羔羊为MSTN基因敲除杂合体（基因型用“M-”表示）。第2组中（267普通母羊发情并配种）187只母羊妊娠,产羔201只,母羊妊娠率为70.04%,产羔率107.49%;60日龄163只羔羊存活,其中12只羔羊为FecB基因突变且MSTN基因敲除个体,70只羔羊为MSTN基因敲除杂合体,15只羔羊为FecB基因突变杂合体（基因型用“B-”表示）,66只羔羊为普通羊（基因型用“--”表示）。第3组中（51只FecB基因突变母羊发情并配种）36只母羊妊娠,产羔54只,母羊妊娠率为70.59%,产羔率150.00%;60日龄44只羔羊存活,其中22只羔羊为FecB基因突变纯合体（基因型用“BB”表示）,22只羔羊为FecB基因突变杂合体。第4组中（257只普通母羊发情并配种）179只母羊妊娠,产羔190只,母羊妊娠率为69.65%,产羔率106.14%;60日龄139只羔羊存活,其中125只羔羊为FecB基因突变杂合体,14只羔羊为普通羊。根据后代基因型将后代分为M-（72只）、MB（15只）、--（80只）、B-（162只）、和BB（22只）组,一岁以内体重监测结果显示,所有后代体重平稳增长,MSTN基因敲除杂合体（M-组）后代的体重在各生长阶段显着高于其他组后代,FecB基因突变纯合体（BB组）后代的体重在各阶段均显着低于其他组（p<0.05）。通过扩繁试验,共获得了556只成活滩羊后代,其中MSTN基因敲除滩羊139只、FecB基因突变滩羊184只,MSTN基因敲除且FecB基因突变滩羊15只,为育成一个繁殖性能高、生长发育快的滩羊新品提供了育种材料。试验结果表明,MSTN基因敲除公羊与MSTN基因敲除母羊、普通母羊繁殖,能够获得增重更快的MSTN基因敲除滩羊后代;与FecB基因突变公羊繁殖,FecB基因突变母羊比普通母羊具有更高的繁殖效率,获得的FecB基因突变纯合体后代具有相对较小的出生重和较慢的体重增长速度;当基因编辑滩羊群体达到一定规模时,可采用常规扩繁技术扩大基因编辑滩羊群体数量。
吴飞[6]（2021）在《Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究》文中研究指明寄生性线虫能在动物群体中造成相当高的发病率和死亡率,其中,捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是世界范围内具有重大经济意义的小型反刍动物寄生性线虫之一,无论是在发展中国家还是发达国家其流行率均居高不下。该虫感染后引起的捻转血矛线虫病（haemonchosis）能够造成宿主生长发育障碍、生产力低下,严重时亦可导致死亡,极大地威胁了反刍动物的健康,另外,高昂的防治费用也制约了畜牧业的可持续发展。虽然,目前仍有数种广谱抗蠕虫药物单独或联合用药对捻转血矛线虫感染有较好的治疗效果,但长期过度依赖这些药物使得不同地区的捻转血矛线虫对抗蠕虫药物产生了不同程度的耐药性,这将导致可用的药物越来越少。另外,由于缺乏可投入生产的疫苗,使得目前寄生性蠕虫的防控形势极为严峻。因此,寻找新的关键药物靶位及疫苗候选基因,开发无污染、无残留的新型药物和研制安全、高效的疫苗是目前线虫病防治的重要研究方向。丝氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitors,SPIs）在寄生性线虫寄生阶段高表达,是其长期与宿主相互作用的进化表现,可抑制宿主丝氨酸蛋白酶从而保障自身生存需要和逃避宿主的杀伤机制。明确SPIs在寄生虫-宿主交互过程中的作用,能为寄生虫病的防治提供新的方向。本研究从课题组前期的蛋白质组学数据中筛选出一种在捻转血矛线虫L4期高表达的SPI,扩增获得了Hc-spi-i8a和Hcspi-i8b两个剪切体,并对其表达特性进行分析;通过血液凝固和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）实验研究Hc-SPI-I8A的功能;利用酵母双杂交、Co IP、GST pull-down和共定位技术筛选并验证Hc-SPI-I8A与绵羊含TSP1结构域蛋白（Ovis aries TSP1-containing protein,Oa TSP1CP）间的互作关系,初步分析Hc-SPI-I8A发挥抗凝血功能的机制;结合泛素化、p65入核和点突变等实验初步明确Hc-SPI-I8调控RACK1/IKKs/NF-κB/TNF-α通路的机制。研究结果为深入研究捻转血矛线虫抗凝血和抑制宿主免疫反应的机制奠定了坚实的理论基础和现实依据,同时也为新型疫苗和药物的研发提供了新的靶标。1.捻转血矛线虫Hc-spi-i8基因表达特性分析为分析捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子Hc-spi-i8的表达特性,本研究通过Blast获得Hc-spi-i8的CDS序列,结合信号肽与结构域预测以及同源性与进化树分析结果,推测Hc-SPI-I8可能发挥的功能;利用真核转染技术在HEK293T细胞中对其信号肽活性进行初步验证;通过荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR）检测该基因在不同发育阶段虫体内的转录特征;使用免疫荧光组织化学（immunohistofluorescence,IHF）呈现Hc-SPII8在虫体中的定位。结果显示,Hc-spi-i8具有两个剪切体,分别为Hc-spi-i8a和Hc-spi-i8b,两者均有一个N端的信号肽,前者在C端还有一个与吸血性寄生虫（如钩虫）高度相似的TIL结构域;两者在捻转血矛线虫寄生阶段的转录水平均显着高于自由生活阶段,且Hc-SPI-I8主要表达于虫体肠道、性腺和皮下组织,说明Hc-SPI-I8可能具有抑制宿主血液凝固的功能,为后续实验指明了研究方向。2.Hc-SPI-I8A抑制宿主凝血及其作用机制为明确Hc-SPI-I8抗凝血功能及其分子机制,本研究通过绵羊全血抗凝血实验验证其功能;截断表达Hc-SPI-I8蛋白,探究TIL结构域对Hc-SPI-I8抗凝血功能的重要性;通过酵母双杂交实验筛选羊全血中可能与Hc-SPI-I8存在相互作用的凝血相关因子;经过昆虫杆状病毒表达系统表达Hc-SPI-I8的互作蛋白Oa TSP1CP,并分析其在Hc-SPI-I8发挥抗凝血功能中的作用;利用c DNA末端快速扩增技术（rapid amplification of c DNA ends,RACE）扩增Oa TSP1CP、绵羊主要凝血因子（II、VII、X和XI）。结果显示,Hc-SPI-I8A能通过TIL结构域影响外源性和内源性途经;Hc-SPI-I8可与四种绵羊血液中的蛋白结合,其中Oa TSP1CP可能参与凝血途经且特异性结合Hc-SPI-I8A进而帮助后者干扰外源性凝血途经;RACE获得了Oa TSP1CP和绵羊凝血因子的CDS全长。综合上述结果,本研究初步解析了Hc-SPI-I8A影响外源性凝血途经的机制,为全面揭示Hc-SPI-I8A抑制血液凝固的机制奠定坚实的基础。3.Hc-SPI-I8抑制宿主TNF-α型炎症反应及其分子机制为明确Hc-SPI-I8是否能通过与Oa RACK1互作而调控NF-κB活性进而抑制TNF-α型炎症反应,本研究验证了Hc-SPI-I8、RACK1和MKRN1间的互作关系并分析RACK1与两者结合的区域;利用进化树分析和p65入核实验验证RACK1/IKKs/NF-κB通路在不同物种间的保守性;经多种实验确定Hc-SPI-I8和MKRN1对NF-κB活性的影响;明确Hc-SPI-I8和MKRN1是否通过RACK1影响NF-κB活性;经过泛素化实验确定MKRN1和Hc-SPI-I8对RACK1泛素化以及MKRN1对Hc-SPI-I8泛素化的影响,进而阐明两者及RACK1泛素化对RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应的影响。结果表明,Hc-SPII8、RACK1和MKRN1能够两两结合且RACK1结合Hc-SPI-I8和MKRN1的位置相同;RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守且Hc-SPI-I8和MKRN1能通过RACK1影响NF-κB活性;MKRN1能促进RACK1和Hc-SPI-I8泛素化,Hc-SPII8能够抑制RACK1泛素化,且两者均影响RACK1 K183和K185位点的泛素化,而这两个位点的泛素化影响了RACK1在RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应中的作用。综合上述结果表明,Hc-SPI-I8可能够通过抑制MKRN1对RACK1的泛素化进而抑制TNF-α型炎症反应,研究结果能为后续更深入探究Hc-SPI-I8抑制TNF-α型炎症反应的分子机制奠定基础。综上所述,本研究从捻转血矛线虫蛋白质组学中筛选到一种在寄生阶段显着高表达的TIL型SPI,其主要表达于肠道、性腺和皮下组织;Hc-SPI-I8A依赖TIL结构域干扰宿主外源性和内源性凝血途经且与Oa TSP1CP互作有关;MKRN1、RACK1和Hc-SPI-I8间两两互相结合且MKRN1和Hc-SPI-I8结合RACK1相同的区域,RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守,且MKRN1和Hc-SPI-I8通过作用于RACK1的两个关键泛素化位点进而影响其在RACK1/IKKs/NF-κB通路中的功能。研究结果不仅进一步揭示了捻转血矛线虫抑制宿主凝血和炎症反应的机制,也为捻转血矛线虫新型药物开发和疫苗研制提供了新的靶位点。
岳畅[7]（2020）在《辽宁绒山羊高繁候选基因SNP及其调控非编码RNA的表达分析》文中认为繁殖性状在山羊育种中具有很高的经济价值,增加母羊的产羔数对于提高养羊业的生产效益具有重要意义。母羊的多羔基因是决定绒山羊繁殖性状的关键因素,而产羔数是一个受微效多基因控制的数量性状,其遗传力仅为0.1左右,难以通过传统的育种手段来快速提高。因此,寻找与山羊产羔数性状相关的基因和分子标记一直都是育种学家关注的焦点。本研究旨在将GDF9、BMPR-IB、FecB和ESR作为候选靶基因,分析其与潜在靶分子间的网络调控揭示它们在辽宁绒山羊卵巢组织繁殖过程中的潜在调控机制,对筛选出的高繁殖力基因的非编码RNA进行生物学分析,进而探究非编码RNA在山羊卵巢中对产羔率的影响;同时对辽宁绒山羊的GDF9、BMPR-IB、FecB和ESR基因做PCR-Seq多态性检测,通过序列比对寻找潜在的SNP,分析辽宁绒山羊GDF9、BMPR-IB、FecB和ESR基因多态性对产羔数及产绒性能的影响。获得的结果如下:1.高繁候选基因非编码RNA荧光定量PCR检测结果:本研究通过对辽宁绒山羊卵巢组织中的非编码RNA进行荧光定量PCR检测。结果显示,有14个mi RNAs均在辽宁绒山羊三胎卵巢组织中表达量低,双胎中的表达量相对较高,mir-93三胎相对表达量最低。构建了调控产羔数的ceRNA网络,得到了circ RNA-mi R34c-ESR和MSTRG.3853.4-mi R484-GDF9调控关系网,可能分别对辽宁绒山羊产羔数起正/负调控作用。2.高繁候选基因的多态性与产羔数及产绒性状的结果分析:本研究在辽宁绒山羊群体中,在GDF9、BMPR-IB、FecB和ESR基因的3′UTR区检测到多态性,共发现8个单核苷酸多态性（SNPs）位点,其中5个为有效SNPs位点（C47T、C94T、C299T、C463T和T575G）。基因型鉴定分析表明,在辽宁绒山羊群体中CC和GG基因型是双羔优势基因型;CCGG和GGCC单倍型组合是双羔优势单倍型组合;FecB C94T和ESR C463T位点的CC基因型是双羔优势基因型,对辽宁绒山羊产羔数有显着影响（P<0.01）,且C等位基因与产羔数呈正相关;因此,推测FecB C94T和ESR C463T是影响辽宁绒山羊产羔数的主要SNPs。产绒性状对比分析发现,FecB C94T位点TT基因型个体平均产绒量最高,绒细最佳;BMPR-IB C47T位点CT基因型个体自然绒长最高,ESR T575G位点GT基因型个体净绒率最高;C463T位点的CC基因型对绒细有显着影响（P<0.01）。
武赟[8]（2020）在《湖羊ZFY基因干扰载体及外泌体介导对性别控制的影响》文中指出动物的很多经济性状都受到性别的限制,比如产奶、产蛋性状等,再如产肉等性能对于不同的性别,动物的表现也不同,这时就需要对动物的性别来进行控制,随着生物工程领域的快速发展,人们逐渐摸索出一些动物的性别控制方法。通过性别控制技术,可以极大地提升经济效益,减少不必要的成本浪费如饲料成本,并且可以加快动物的育种进程。湖羊母羊具有繁殖率高,母性好,四季发情的特点,且其多产双羔,可利用该特性来与其他品种优良的公羊杂交获得大量后代,故对于湖羊,我们更期望产出后代为雌性。所以本试验利用了RNAi技术对湖羊Zfy基因进行干扰沉默,从而控制后代性别。目的:本试验拟通过睾丸注射Zfy基因外泌体干扰载体,观察湖羊后代性别比例,探究外泌体作为Zfy基因干扰片段的载体的可行性,为性别控制方法提供一个新的选择方法。方法:（1）无菌采取湖羊血样,用试剂盒法提取、提纯外泌体。（2）构建5种湖羊Zfy基因外泌体干扰载体,分组进行细胞水平的干扰试验,通过q RT-PCR检测Zfy基因m RNA表达量变化。（3）使用细胞水平试验效果最好的C组进行睾丸注射,设对照组注射p LL3.7-C,待母羊产羔后统计分析后代性别比例。结果:（1）在细胞水平试验中,有两组外泌体干扰载体显着地抑制了Zfy基因的表达,最好的效果表达水平降低了32.6%。（2）试验组母羔率为56.6%,对照组为68.6%,试验组显着低于对照组;试验组母羔平均初生重为2.81±1.153 kg,公羔为3.01±1.021 kg,对照组母羔平均初生重为2.81±1.247 kg,公羔为3.00±1.174 kg,两组差异不显着。结论:成功构建了湖羊Zfy基因干扰载体,对Zfy基因产生了显着干扰效果,但在动物水平进行干扰试验却没有取得预期结果,分析其原因:1.外泌体载体包封率有限且本身不能进行复制导致注射睾丸的有效剂量较小;2.由于外泌体保存不当影响最终结果。
王真[9]（2020）在《陕北白绒山羊MMAF相关基因遗传变异的挖掘及其与产羔数关联研究》文中研究说明陕北白绒山羊是一种优良的绒肉兼用型山羊品种,但其繁殖性能亟待提高,故利用分子标记辅助选择（MAS）方法对其繁殖性状的遗传改良具有重要意义。作为山羊繁殖相关候选基因,精子鞭毛多发形态异常（MMAF）相关基因包括DNAH1、QRICH2、CFAP43、CFAP44、CFAP69、CCDC39和AKAP4。本研究首先利用现代分子遗传学和分子生物学技术挖掘MMAF相关个基因INDEL位点,并将其与陕北白绒山羊大群体母本产羔数进行遗传效应分析;再分析显着相关基因的CNV位点,并探究它们与产羔性状的相关性;最后,在确定INDEL和CNV位点均能影响山羊产羔数的MMAF相关基因基础上,进一步探究此基因关键位点的SNP突变与产羔数的关系。本研究期望找到与产羔数相关的分子标记,从而为通过MAS提高其繁殖性状提供有效DNA标记和科学资料。1.山羊MMAF相关基因的INDEL挖掘及其与产羔数的关联分析考虑到INDEL检测技术的快速性、简便性与可操作性,同时,也发现MMAF相关基因INDEL多态方面的研究较少,故本研究首先挖掘了山羊MMAF相关基因的INDEL突变,并将其与1025只陕北白绒山羊第一胎产羔数进行关联分析。结果发现DNAH1基因P1（rs636295440）和P3位点（rs662697370）存在多态性,QRICH2基因的P4位点（rs651821102）存在多态,CFAP43基因的P20位点（rs644941577）存在多态,CFAP69基因的P4（rs646423399）、P6（rs654691768）和P7（rs658907780）位点存在多态。进一步将以上7个INDEL突变位点与陕北白绒山羊关联分析,发现DNAH1-P1（rs636295440）和CFAP43-P20（rs644941577）位点能显着影响产羔数（P<0.05）,但这两个位点不存在强连锁关系,说明这两个突变均可作为山羊产羔数性状遗传选育的有效分子标记。2.山羊MMAF相关的DNAH1基因CNV挖掘及其与产羔数的关联分析基于以上MMAF相关基因INDEL突变位点的显着性研究结果,根据Animal Omics Database数据库,发现只有山羊DNAH1基因存在3个外显子CNV,CFAP43基因不存在外显子CNV突变,因此,本研究进一步探究了DNAH1基因的3个外显子区域CNV与318只陕北白绒山羊产羔数的相关性,期望为山羊繁殖性状的遗传选育提供理论依据。本研究利用q PCR方法对DNAH1基因3个外显子区CNV突变鉴定,发现这3个突变位点均存在多态,即缺失（Loss）型、中间（Medium）型和获得（Gain）型。在CNV1（NC＿030829.1:g:48593201-48595200）,CNV2（NC＿030829.1:g:48603601-48605200）和CNV3（NC＿030829.1:g:48617201-48618800）突变中,Gain基因型相比较Medium和Loss基因型均具有最高的产羔数（P<0.01）。提示位于DNAH1基因外显子区域的CNV1（NC＿030829.1:g:48593201-48595200）,CNV2（NC＿030829.1:g:48603601-48605200）和CNV3（NC＿030829.1:g:48617201-48618800）突变均可作为山羊产羔数性状的有效分子标记。3.山羊MMAF相关的DNAH1基因SNP挖掘及其与产羔数的关联分析基于以上的INDEL和CNV突变的显着性研究结果,并且考虑到SNP检测方法较为复杂,耗时较长等方面,本研究最后检测DNAH1基因的SNP突变,并分析这些SNP突变与327只陕北白绒山羊母本产羔数的关联情况。根据DNAH1基因上游启动子附近预测的转录因子发现,上游存在10个SNP突变可能能差异结合C/EBPα、TBP、PR等多个与繁殖性状相关的转录因子,故本研究利用DNA测序方法挖掘DNAH1基因启动子附近的10个SNP突变并将其与陕北白绒山羊的产羔数进行关联分析。结果发现SNP1（rs665366227）、SNP3（rs638339874）、SNP4（rs653533484）、SNP5（rs646237158）、SNP7（rs640739292）、SNP9（rs656018411）和SNP10（rs644545438）位点均存在多态。根据关联分析结果,结果表明:SNP1（rs665366227）、SNP5（rs646237158）和SNP7（rs640739292）位点与陕北白绒山羊产羔数显着相关,这3个位点的野生型具有较高的产羔数,同时发现DNAH1基因的SNP1（rs665366227）、SNP5（rs646237158）、SNP7（rs640739292）和SNP10（rs644545438）位点属于强连锁关系（r2>0.33）。这些结果提示:DNAH1具有丰富的遗传多态性,并可能通过连锁关系发挥影响产羔数性状的作用,可用于山羊产羔数性状的分子育种选育中。4.山羊MMAF相关基因关键突变组合基因型与山羊产羔数的关联分析产羔性状是一种复杂的数量性状,涉及到多个基因和基因座。因此,分析多个基因座对产羔数的连锁不平衡关系以及联合效应较为重要。本研究探索了MMAF相关基因的分子多态与山羊产羔数的关系,共发现8个多态位点与陕北白绒山羊产羔数显着或极显着相关,其中位于DNAH1基因内的DNAH1-SNP1（rs665366227）、DNAH1-SNP5（rs646237158）、DNAH1-SNP7（rs640739292）、DNAH1-P1（rs636295440）、DNAH1-CNV1（NC＿030829.1:g:48593201-48595200）、DNAH1-CNV2（NC＿030829.1:g:48603601-48605200）和DNAH1-CNV3（NC＿030829.1:g:48617201-48618800）位点均能显着影响山羊产羔数（P<0.05）;位于CFAP43基因内的CFAP43-P20（rs644941577）位点能显着影响山羊产羔数（P<0.05）。在CNV与SNP突变位点与产羔数的组合效应分析中,结果发现共有18种组合基因型可用于关联分析,组合基因型11（Medium-Medium-Medium-AA-TT-CC）、16（Medium-Gain-Gain-AA-TT-CC）和17（Gain-Gain-Medium-AA-TT-CC）具有最高的产羔数,它们与组合基因型1（Loss-Loss-Loss-AA-TT-CC）和2（Loss-Loss-Loss-AG-TA-CT）均差异极显着（P<0.01）。通过连锁不平衡分析发现,只有位于DNAH1基因内的DNAH1-SNP1（rs665366227）,DNAH1-SNP5（rs646237158）和DNAH1-SNP7（rs640739292）处于强连锁不平衡状态。结果说明以上8个位点可用于陕北白绒山羊繁殖性状的遗传选育。
葛文霞[10]（2020）在《绵羊TMR颗粒饲料加工工艺及应用效果研究》文中进行了进一步梳理目的:本论文研究应对极端气候条件下,适用于妊娠母羊的全混合日粮（Total Mixed Diet,TMR）颗粒饲料加工技术及应用效果,旨在提高放牧绵羊抵御灾害的能力。方法:论文通过不同精粗比对TMR颗粒饲料品质及应用效果两部分进行研究。第一部分:以TMR颗粒饲料为对象,研究饲料中不同的精粗饲料比对TMR颗粒饲料成型品质的影响。试验设计采用双因子多水平试验设计,因子A为饲料精粗比,水平分别为50:50、40:60、30:70,因子B为玉米秸秆与苜蓿干草比,水平分别为1:2、1:1、2:1,共9个试验组,按照TMR颗粒饲料生产工艺流程生产TMR颗粒饲料,比较不同精粗比和粗饲料组成对TMR颗粒饲料感官性质、含粉率、粉化率、硬度、容重、密度、长度和直径等物理指标的影响,综合评定TMR颗粒饲料的品质,确定适宜的精粗比。试验筛选出A1B1组TMR颗粒饲料,作为对照组,在饲料中分别添加不同水平的VE（20IU/kg、40 IU/kg、60 IU/kg）、VC（250 mg/kg、500 mg/kg、750 mg/kg）和乙氧喹（100mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg）,按照TMR颗粒饲料生产工艺进行生产,室温下贮存,分别于生产后0 d、15 d、30 d、60 d、90 d、120 d,测定饲料中·O2-自由基活力、H2O2含量、·OH自由基活力、总抗氧化能力,研究不同时间点,不同种类不同水平抗氧化剂对TMR颗粒饲料的抗氧化能力,确定适宜的抗氧化剂的种类和添加量。以A1B1组TMR颗粒饲料为基础饲料,在饲料中分别添加不同水平的柠檬酸、乳酸钙和延胡索酸,按照TMR颗粒饲料生产工艺进行生产,室温下贮存,分别于生产后0 d,15 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d,测定环境温湿度变化、饲料中水分、感官变化、霉菌总数和霉菌分布情况,确定适宜的防霉剂的种类和添加量。第二部分:用第一部分生产的TMR颗粒饲料进行饲喂试验,观察妊娠母羊采食行为和反刍行为、进行消化代谢试验和体外发酵试验、测定妊娠母羊血液中生化指标,评定TMR颗粒饲料的使用效果。结果:（1）随着饲料中精饲料比例的降低,粗饲料比例的增加,TMR颗粒饲料的感官品质下降、颗粒含粉率和粉化率显着增加（P<0.05）、硬度显着降低（P<0.05）、容重和密度显着降低（P<0.05）、颗粒长度显着增加（P<0.05）,对颗粒直径没有显着影响（P>0.05）;不同的粗饲料组成比例（因子B）对TMR颗粒饲料成型品质影响不显着（P>0.05）;不同的精粗比与粗饲料的组成的交互作用对TMR颗粒容重和密度有显着影响（P<0.05）。（2）在贮存期0～120 d内,各氧化剂添加组可以有效清除饲料氧化过程中产生H2O2、·OH、·O2-,提高饲料的总抗氧化能力。饲料中添加不同水平的VC、VE和乙氧喹,各组饲料的抗氧化能力和清除自由基的能力随着浓度的增加而增加,随时时间的推迟而减弱。在贮存期初始阶段15 d,30 d,60 d,各组抗氧化能力差异不显着（P>0.05）;贮存前期和贮存中期不同剂量的抗氧剂的抗氧化效果产生差异,到了后期,又趋于接近,差异不显着（P>0.05）。（3）贮存期间,贮藏室温度变化范围在16.5℃～28℃,室内平均温度为22.02℃,相对湿度在33%～75%,平均相对湿度在46.04%。在贮存期的15 d,饲料中水分出现下降,到30 d开始回升,各组间饲料水分的变化差异不显着（P>0.05）;在60～150 d之间,对照组饲料中的水分显着高于各试验组,差异显着（P<0.05）。在0～90 d期间,各组饲料外观保持良好颗粒饲料感官性状,无霉变。在贮存期120 d,对照组饲料表现出隐约霉变,其他各组饲料外观情况良好。在贮存期150d时,对照组饲料出现轻度发霉,各试验验组外观良好。15～120 d,对照组饲料中的霉菌数量多于各防霉剂组,差异不显着（P>0.05）;120～150 d时,对照组饲料中的霉菌数量极显着高于各防霉剂组（P<0.01）,各防霉剂组之间差异不显着（P>0.05）。经PCR-DGGE分析,发现各饲料中主要存在的与饲料卫生有关的霉菌有:镰刀菌,曲霉菌和青霉菌。（4）不同精粗比影响母羊的采食量,精粗比为50:50时显着高于精粗比40:60组和30:70组,干物质采食量分别提高了14.76%和19.13%（P<0.05）;TMR经制粒后可以缩短妊娠母羊采食时间,提供采食速度;高比例的精饲料,可提高妊娠母羊的饮水次数和排便次数;不同处理的饲料,对妊娠母羊的运动和休息时间没有显着影响（P>0.05）;饲喂TMR颗粒饲料对妊娠母羊的反刍行为的影响,差异不显着（P>0.05）;不同精粗比对TMR颗粒饲料中CP和CF的消化率有显着影响（P<0.05）,对钙磷消化率影响不显着（P>0.05）。（5）体外发酵2～8 h,培养液中的产气量、NH3-N浓度、MCP浓度、VFA浓度快速上升,p H值、乙酸/丙酸值随之下降,8～12 h变化速度变缓,24 h到达峰值;随着饲料中精饲料比例的提高,瘤胃液中p H值、乙酸/丙酸值随之降低,培养液中的产气量、NH3-N浓度、MCP浓度、VFA随着升高。（6）给妊娠母羊饲喂经颗粒化处理的TMR,饲料中苜蓿干草比例越高,母羊血清中的TP、ALP、BUN、Cre含量越高。不同精粗比和不同的玉米秸秆:苜蓿干草比对妊娠母羊血清中的Blu、TG、Ca、P没有显着影响（P>0.05）,保证母羊营养需求的前提下,可维持血清中的Blu、TG、Ca、P浓度的平衡。结论:当饲料精粗比在50:50～30:70的范围内,精饲料比例越高越有利于TMR颗粒饲料的成型;相同精粗比的条件下,增加玉米秸秆比例降低苜蓿干草比例,颗粒容重和长度随之下降。饲料中添加不同水平VC、VE、乙氧喹,可提高饲料的抗氧化能力。添加不同水平的柠檬酸、乳酸钙、延胡索酸,可以有效抑制霉菌的生长和繁殖,延长饲料保存期。饲喂TMR颗粒饲料可以保证妊娠母羊健康,生理生化指标正常,改善饲料适口性,提高干物质采食量和消化率。
二、绵羊高效繁殖的生物工程技术（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绵羊高效繁殖的生物工程技术（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）绵羊产羔数性状的分子遗传机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究问题的由来 |
| 2 绵羊产羔数性状的研究进展 |
| 2.1 绵羊的产羔数性状 |
| 2.2 绵羊产羔数性状主效基因的研究进展 |
| 2.2.1 BMPR1B基因 |
| 2.2.2 BMP15基因 |
| 2.2.3 GDF9基因 |
| 3 全基因组重测序和选择信号检测 |
| 3.1 高通量测序技术的发展 |
| 3.2 全基因组重测序技术的在畜牧领域的应用 |
| 3.3 全基因组选择信号检测 |
| 3.3.1 基于等位基因频率谱的方法 |
| 3.3.2 基于连锁不平衡的方法 |
| 3.3.3 基于群体分化的方法 |
| 3.3.4 各类选择信号检验方法的适用范围 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 绵羊产羔数候选基因的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验湖羊群体选择与产羔数资料记录收集 |
| 1.1.2 血液样本采集 |
| 1.1.3 本试验所用仪器设备 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要化学试剂的配置 |
| 1.1.6 本试验中所用主要分子生物学网站与软件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 DNA提取与质量检测 |
| 1.2.2 DNA文库构建与测序 |
| 1.2.3 全基因组遗传变异分析 |
| 1.2.4 全基因组选择信号检验 |
| 2 结果 |
| 2.1 单羔和多羔组湖羊群体产羔数分布情况 |
| 2.2 湖羊全基因组测序结果 |
| 2.2.1 DNA样品质量与浓度 |
| 2.2.2 重测序数据质量统计 |
| 2.3 全基因组选择信号检测结果 |
| 2.3.1 全基因组选择信号扫描 |
| 2.3.2 通路富集 |
| 2.3.3 正选择基因鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 全基因组选择信号检测策略 |
| 3.2 多羔候选基因的筛选 |
| 4 小结 |
| 第三章 BMP-BMPR-Smad通路基因在湖羊下丘脑、垂体和卵巢中的转录水平研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验羊选择 |
| 1.1.2 组织样本采集 |
| 1.1.3 本试验所用仪器设备 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 本试验中所用主要分子生物学网站与软件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 1.2.2 cDNA的合成及质量检测 |
| 1.2.3 转录组测序与数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 湖羊BMP家族基因在下丘脑-垂体-卵巢中转录水平的变化 |
| 2.2 湖羊BMPR家族基因在下丘脑-垂体-卵巢中转录水平的变化 |
| 2.3 湖羊Smad家族基因在下丘脑-垂体-卵巢中转录水平的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 绵羊BMP-BMPR-Smad通路基因选择作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 40个物种的BMP-BMPR-Smad通路基因的编码区序列 |
| 1.1.2 蒙古系绵羊重测序数据 |
| 1.1.3 本试验中所用主要分子生物学网站与软件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 物种间BMP-BMPR-Smad通路基因选择信号检测 |
| 1.2.2 绵羊群体间BMP-BMPR-Smad通路基因选择信号检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 BMP-BMPR-Smad通路基因在物种间的选择信号 |
| 2.2 BMP-BMPR-Smad通路基因在蒙古羊群体间的选择信号 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 绵羊BMPR1B基因FecB突变对产羔数的遗传效应及其选择作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验绵羊群体选择与产羔数资料记录收集 |
| 1.1.2 本试验所用仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要化学试剂的配置 |
| 1.1.5 本试验中所用主要分子生物学网站与软件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BMPR1B基因正选择位点注释及连锁不平衡检验 |
| 1.2.2 BMPR1B基因Fec B突变位点及其相邻微卫星位点多态性检测 |
| 1.2.3 Fec B突变对绵羊产羔数效应的Meta分析 |
| 1.2.4 Fec B突变年龄估算 |
| 1.2.5 蒙古系绵羊有效群体含量估计 |
| 1.2.6 蛋白质理化性质和三维结构预测 |
| 2 结果 |
| 2.1 BMPR1B基因正选择位点鉴定 |
| 2.2 FecB突变位点在蒙古系绵羊群体中的分布 |
| 2.3 FecB突变位点对绵羊产羔数的遗传效应 |
| 2.3.1 纳入文献统计 |
| 2.3.2 异质性检验结果 |
| 2.3.3 发表偏倚检验结果 |
| 2.3.4 FecB突变位点对绵羊产羔数的遗传效应统计 |
| 2.4 FecB突变对BMPR1B蛋白理化性质和三维结构的影响 |
| 2.5 BMPR1B基因FecB突变选择作用 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊BMPR1B基因FecB突变对产羔数的遗传效应 |
| 3.2 绵羊BMPR1B基因FecB突变的起源及其选择作用 |
| 4 小结 |
| 第六章 绵羊ZP3基因对产羔数的遗传效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验羊群体选择与产羔数资料记录收集 |
| 1.1.2 湖羊血液样本采集 |
| 1.1.3 本试验所用仪器设备 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要化学试剂的配置 |
| 1.1.6 本试验中所用主要分子生物学网站与软件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 湖羊ZP3 基因多态性检测 |
| 1.2.2 数据统计与性状关联分析 |
| 1.2.3 蛋白理化性质和三维结构预测 |
| 1.2.4 ZP3基因在0-180日龄阶段湖羊下丘脑、垂体和卵巢中的转录水平检测 |
| 1.2.5 ZP3基因选择信号检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 湖羊ZP3基因外显子区域SNPs检测结果 |
| 2.2 湖羊ZP3基因多态性对产羔数遗传效应 |
| 2.3 rs401271989位点变异对ZP3蛋白理化性质及三维结构的影响 |
| 2.4 湖羊ZP3基因在下丘脑、垂体和卵巢组织中的转录水平研究 |
| 2.5 ZP3 基因选择信号 |
| 2.5.1 物种间ZP3基因选择信号 |
| 2.5.2 绵羊群体间ZP3基因选择信号 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 第八章 本研究主要创新点与下一步研究方向 |
| 1 本研究主要创新点 |
| 2 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表2-1 |
| 附表2-2 |
| 附表3-1 |
| 附表4-1 |
| 附表4-2 |
| 附表4-3 |
| 附表4-4 |
| 附表4-5 |
| 附表4-6 |
| 附表4-7 |
| 附表4-8 |
| 附表4-9 |
| 附表4-10 |
| 附图4-1 |
| 附图4-2 |
| 附图4-3 |
| 附图4-4 |
| 附图4-5 |
| 附图4-6 |
| 附图4-7 |
| 附图4-8 |
| 附图4-9 |
| 附图4-10 |
| 附图4-11 |
| 附图4-12 |
| 附图4-13 |
| 附图4-14 |
| 附表5-1 |
| 附图5-1 |
| 附表6-1 |
| 附图6-1 |
| 在读期间发表论文和申请专利 |
| 致谢 |
（3）基于全基因组重测序筛选多胎萨福克羊高繁殖力相关基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英语缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.研究目的及意义 |
| 2.国内外研究进展 |
| 2.1 绵羊起源驯化 |
| 2.2 研究中涉及的绵羊品种(系)介绍 |
| 2.3 多胎基因研究进展 |
| 2.4 DNA测序技术及其发展 |
| 2.5 全基因组重测序的测序技术及其发展 |
| 2.6 全基因组水平的选择信号分析及其检测方法 |
| 2.7 全基因组重测序的在绵羊研究中应用 |
| 3.研究内容与技术路线 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 品种间重测序分析挖掘多胎萨福克羊繁殖相关基因 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验样本采集 |
| 1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.3 生物信息学网站 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因组DNA的提取和质检 |
| 2.2 DNA文库构建及测序 |
| 2.3 测序质量评估和数据过滤 |
| 2.4 测序数据比对到参考基因组 |
| 2.5 遗传变异的检测、鉴定、过滤和注释 |
| 2.6 群体遗传学分析 |
| 2.7 全基因组选择信号分析 |
| 2.8 选择区域内基因的注释、GO富集和KEGG通路分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 样本基因组DNA的质量检测 |
| 3.2 测序质量分布检测 |
| 3.3 比对参考基因组的分析结果 |
| 3.4 全基因组变异注释检测统计 |
| 3.5 三个绵羊群体的遗传结构分析 |
| 3.6 选择信号分析 |
| 3.7 选择区域内基因的注释与功能富集 |
| 4.讨论 |
| 4.1 本研究的思路和试验方法构建 |
| 4.2 多胎萨福克羊候选基因的筛选 |
| 5.小结 |
| 试验二 品系内重测序分析挖掘多胎萨福克羊繁殖相关基因 |
| 1 材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 全基因组变异注释检测统计 |
| 3.2 选择信号分析 |
| 3.3 GO富集与KEGG通路分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 试验方法构建 |
| 4.2 基于选择信号分析的多胎萨福克羊产羔等表型性状基因的筛选 |
| 5.小结 |
| 试验三 MTNR1A基因多态性及其与产羔数关联分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 样品采集及DNA提取 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 基因分型 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MTNR1A基因SNP初步验证 |
| 3.2 MTNR1A基因突变区域的PCR扩增 |
| 3.3 MTNR1A基因的PCR-RFLP检测 |
| 3.4 绵羊MTNR1A基因的多态性分析 |
| 3.5 多胎萨福克羊MTNR1A基因SNPs与产羔数的相关性分析 |
| 3.6 多胎萨福克羊MTNR1A基因单倍型与产羔数的相关性分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 褪黑素受体1A基因(MTNR1A)对繁殖的调节作用 |
| 4.2 MTNR1A基因多态性与绵羊产羔数关系 |
| 5.小结 |
| 第三章 全文总结 |
| 第四章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表1 多胎萨福克羊相对于湖羊和萨福克羊筛选到的差异候选基因 |
| 附表2 多胎萨福克羊特异基因变异信息 |
| 附表3 多胎萨福克羊品系内筛选基因变异信息 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（4）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）MSTN基因敲除和FecB基因突变滩羊扩繁试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 第一章 宁夏滩羊繁殖生产与基因编辑育种技术概述 |
| 1.1 滩羊介绍 |
| 1.1.1 滩羊品种 |
| 1.1.2 滩羊产品 |
| 1.1.3 滩羊的繁殖 |
| 1.1.4 滩羊的饲养管理 |
| 1.1.5 滩羊产业发展现状 |
| 1.2 绵羊繁殖技术 |
| 1.2.1 绵羊卵泡发育模式 |
| 1.2.2 同期发情与诱导发情技术 |
| 1.2.3 人工授精/定时输精技术 |
| 1.2.4 两年三胎繁殖体系 |
| 1.3 基因编辑技术与育种应用 |
| 1.3.1 CRISPR-Cas9基因编辑技术系统 |
| 1.3.2 肌肉生长抑制素基因(MSTN基因) |
| 1.3.3 FecB基因 |
| 1.3.4 基因编辑技术应用 |
| 1.4 试验目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 MSTN基因敲除公羊与普通母羊扩繁试验 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据统计与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 母羊发情分类与诱导发情 |
| 2.2.2 母羊妊娠、产羔及羔羊成活情况 |
| 2.2.3 羔羊基因检测 |
| 2.2.4 羔羊后代生长发育监测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 MSTN基因敲除和FecB基因突变滩羊扩繁试验 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 数据统计与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 母羊同期发情 |
| 3.2.2 母羊妊娠、产羔及羔羊成活 |
| 3.2.3 羔羊基因检测 |
| 3.2.4 后代生长发育监测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫与捻转血矛线虫病 |
| 1 捻转血矛线虫 |
| 1.1 形态特征 |
| 1.2 生活史 |
| 2 捻转血矛线虫病 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 症状与危害 |
| 2.3 诊断 |
| 2.4 预防与控制 |
| 3 本章小结 |
| 第二章 寄生性线虫与宿主相互作用 |
| 1 寄生性线虫的致病性 |
| 1.1 病理损伤 |
| 1.2 营养掠夺 |
| 1.3 免疫调节与免疫逃避 |
| 2 宿主对GINs感染的应答 |
| 2.1 固有免疫应答 |
| 2.2 获得性免疫应答 |
| 2.3 免疫应答的结果 |
| 3 本章小结 |
| 第三章 胃肠道寄生线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 1 丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
| 2 GINs中主要的SPIs |
| 2.1 Serpin型 SPIs |
| 2.2 Kazal型 SPIs |
| 2.3 Kunitz型 SPIs |
| 2.4 α-巨球蛋白 |
| 2.5 TIL型 SPIs |
| 3 SPIs在 GINs中的功能 |
| 3.1 调控自身丝氨酸蛋白酶活性 |
| 3.2 调控宿主丝氨酸蛋白酶 |
| 4 本章小结 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 捻转血矛线虫Hc-spi-i8 基因生物学特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-spi-i8 基因的扩增及序列分析 |
| 2.2 Hc-SPI-I8 的生物信息学分析 |
| 2.3 Hc-SPI-I8在293T细胞中的定位 |
| 2.4 原核表达与多克隆抗体制备 |
| 2.5 Hc-SPI-I8 的表达特性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 Hc-SPI-I8A抑制宿主凝血及其作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-SPI-I8A具有抗凝血功能 |
| 2.2 Hc-SPI-I8A抗凝血功能是TIL依赖的 |
| 2.3 Hc-SPI-I8A互作蛋白的筛选与验证 |
| 2.4 OaTSP1CP参与了绵羊血液凝固抑制过程 |
| 2.5 OaTSP1CP及内源性途径关键凝血因子的CDS扩增 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 Hc-SPI-I8 抑制宿主TNF-α型炎症反应及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-SPI-I8与Oa RACK1/Oa MKRN1 间的互作验证 |
| 2.2 RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守 |
| 2.3 Hc-SPI-I8和MKRN1 通过RACK1 影响NF-κB活性 |
| 2.4 Hc-SPI-I8和MKRN1 能影响RACK1 泛素化 |
| 2.5 RACK1 泛素化影响其功能 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 Ⅰ 常用溶液配制 |
| 附录 Ⅱ 引物序列 |
| 附录 Ⅲ 绵羊成纤维细胞OAR-L1 高效转染方法的探索 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光质粒表达鉴定 |
| 2.2 PEI、Lipo2000和CF2 转染OAR-L1 细胞的效果比较 |
| 2.3 慢病毒侵染OAR-L1 细胞的效果 |
| 2.4 储存条件和时间对慢病毒侵染效果的影响 |
| 2.5 不同方式包装慢病毒共侵染效果比较 |
| 2.6 融合Oa RACK1 对慢病毒共侵染OAR-L1 细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（7）辽宁绒山羊高繁候选基因SNP及其调控非编码RNA的表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 影响绒山羊繁殖性状的因素 |
| 1.1.1 品种和遗传因素 |
| 1.1.2 环境因素 |
| 1.1.3 营养因素 |
| 1.1.4 其他因素 |
| 1.2 高繁殖力候选基因的研究进展 |
| 1.2.1 GDF9基因 |
| 1.2.2 BMPR-IB基因 |
| 1.2.3 FecB基因 |
| 1.2.4 ESR基因 |
| 1.3 竞争性内源RNA(ceRNA)对繁殖性状的调控作用 |
| 1.4 单核苷酸多态性(SNP) |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 高繁殖力候选基因调控非编码RNA的表达分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 试验仪器和主要试剂 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 cDNA构建和高通量测序文库 |
| 2.1.4 ceRNA网络建设与生物信息学分析 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.1.6 总RNA提取、检测及反转录 |
| 2.1.7 荧光定量PCR检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 MiRNA-mRNA/ Circ RNA-mi RNA/ Lnc RNA-mi RNA相互作用的预测 |
| 2.2.2 GDF9、BMPR-IB、FecB和 ESR基因的网络构建 |
| 2.2.3 RNA电泳检测结果 |
| 2.2.4 非编码RNA荧光定量PCR结果 |
| 2.2.5 荧光定量结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 高繁殖力候选基因的多态性与繁殖性状的关联分析 |
| 引言 |
| 3.1 试验材料和方法 |
| 3.1.1 试验仪器和主要试剂 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 DNA提取 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 产物扩增 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 GDF9、BMPR-IB、FecB和 ESR基因多态性鉴定 |
| 3.2.2 基因分型 |
| 3.2.3 GDF9、BMPR-IB、FecB和 ESR基因多态性 |
| 3.2.4 产绒性能相关分析 |
| 3.2.5 SNP位点的基因型与母羊产羔数相关分析 |
| 3.2.6 基因替代效应 |
| 3.2.7 ESR基因2个SNP位点的基因聚合 |
| 3.2.8 ESR单倍型组合与产绒性能的相关分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）湖羊ZFY基因干扰载体及外泌体介导对性别控制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.研究目的及意义 |
| 2.性别控制技术 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 Zfy基因与性别控制 |
| 2.3 性别控制途径 |
| 3.RNA干扰 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 原理 |
| 3.3 构建和应用 |
| 4.外泌体 |
| 4.1 外泌体概述 |
| 4.2 外泌体调节生物功能的作用及机理 |
| 4.3 外泌体载药的类型和途径 |
| 5.总结与展望 |
| 6.研究内容与技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 湖羊Zfy基因外泌体干扰载体的构建及细胞水平检测 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.3 siRNA表达载体的选择 |
| 1.4 siRNA序列的设计 |
| 1.5 双链siRNA的合成 |
| 1.6 siRNA重组表达载体的构建 |
| 1.6.1 外泌体的提取纯化 |
| 1.6.2 外泌体透射电镜观察 |
| 1.6.3 外泌体的载药 |
| 1.7 细胞水平试验 |
| 1.7.1 溶液的配制 |
| 1.7.2 培养湖羊睾丸生精细胞 |
| 1.7.3 细胞水平的干扰效果检测 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 siRNA序列设计 |
| 2.2 外泌体透射电镜观察结果 |
| 2.3 Zfy基因mRNA表达水平检测结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 试验二 湖羊体内干扰试验 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 后代性别比例 |
| 2.2 后代初生重 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（9）陕北白绒山羊MMAF相关基因遗传变异的挖掘及其与产羔数关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 陕北白绒山羊产羔数性状分子育种现状 |
| 1.2 分子育种的研究进展 |
| 1.2.1 分子育种的含义及意义 |
| 1.2.2 分子育种的分类 |
| 1.2.3 分子育种在家畜中的应用 |
| 1.3 分子育种与SNP研究进展 |
| 1.3.1 SNP的概述 |
| 1.3.2 SNP的检测方法 |
| 1.3.3 SNP在畜禽中的应用 |
| 1.4 分子育种与INDEL研究进展 |
| 1.4.1 INDEL的定义 |
| 1.4.2 INDEL的检测方法 |
| 1.4.3 INDEL在畜禽中的应用 |
| 1.5 分子育种与CNV研究进展 |
| 1.5.1 CNV的概述 |
| 1.5.2 CNV的形成过程 |
| 1.5.3 CNV在畜禽中的应用 |
| 1.6 MMAF相关基因研究进展 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 山羊MMAF相关基因的INDEL挖掘及其与产羔数的关联分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 基因组DNA提取 |
| 2.1.3 INDEL突变查找及引物设计 |
| 2.1.4 PCR扩增程序及体系 |
| 2.1.5 琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定分型 |
| 2.1.6 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 MMAF相关基因的INDEL位点的检测 |
| 2.2.2 MMAF相关基因INDEL位点的频率统计分析 |
| 2.2.3 MMAF相关基因INDEL位点与山羊产羔数的关联分析 |
| 2.2.4 MMAF相关基因INDEL突变的连锁不平衡分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 山羊DNAH1 基因的CNV挖掘及其与产羔数的关联分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料准备 |
| 3.1.2 基因组DNA提取方法 |
| 3.1.3 引物设计 |
| 3.1.4 实时荧光定量 |
| 3.1.5 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 qPCR引物检测 |
| 3.2.2 DNAH1基因拷贝数变异在陕北白绒山羊的频率分布 |
| 3.2.3 DNAH1 基因3个CNV变异与产羔数的关联分析 |
| 3.2.4 DNAH1 基因外显子CNVs突变的连锁不平衡分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 山羊DNAH1 基因的SNP挖掘及其与产羔数的关联分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 基因组DNA提取 |
| 4.1.3 转录因子预测及引物设计 |
| 4.1.4 目的片段Sanger测序 |
| 4.1.5 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 琼脂糖结果检测目的片段 |
| 4.2.2 Sanger测序鉴定启动子SNP突变 |
| 4.2.3 DNAH1 基因SNP突变在山羊群体的频率分布 |
| 4.2.4 DNAH1 基因SNP突变差异结合的转录因子 |
| 4.2.5 DNAH1 基因SNP突变与山羊产羔数关联分析 |
| 4.2.6 DNAH1 基因SNP突变的连锁不平衡分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 山羊MMAF相关基因关键突变位点与山羊产羔数的组合效应分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 MMAF相关基因的组合基因型频率分布 |
| 5.1.2 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MMAF相关基因关键突变位点的连锁不平衡分析 |
| 5.2.2 MMAF相关基因突变位点的组合基因型频率分析 |
| 5.2.3 MMAF相关基因突变位点与产羔数的组合效应关联分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 试验结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）绵羊TMR颗粒饲料加工工艺及应用效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 我国及新疆养羊业发展的现状及趋势 |
| 2.2 我国羊饲养模式的研究现状及发展趋势 |
| 2.3 羊用TMR颗粒饲料的研究进展 |
| 2.4 羊用TMR颗粒饲料加工贮藏技术研究进展 |
| 2.5 羊用TMR颗粒饲料的使用 |
| 2.6 TMR颗粒饲料在极端气候情况下的应用 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 第一部分 精粗饲料比例对TMR颗粒饲料成型工艺影响的研究 |
| 试验一 不同精粗饲料比例对TMR颗粒饲料成型品质影响的研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 TMR颗粒饲料的生产工艺 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 测定项目 |
| 1.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同精粗比对TMR颗粒饲料感官性状的影响 |
| 2.2 不同精粗比对TMR颗粒饲料物理指标的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同精粗比对TMR颗粒饲料感官性状的影响 |
| 3.2 不同精粗比对TMR颗粒饲料含粉率和粉化率的影响 |
| 3.3 不同精粗比对TMR颗粒饲料硬度的影响 |
| 3.4 不同精粗比对TMR颗粒饲料容重和密度的影响 |
| 3.5 不同精粗比对TMR颗粒饲料长度和直径的影响 |
| 4 小结 |
| 试验二 不同水平VE、VC和乙氧喹抗氧化效果对比研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验仪器与设备 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 样品的采集 |
| 1.5 氧化活性指标的测定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 VC对饲料抗氧化能力的影响 |
| 2.2 VE对饲料抗氧化能力的影响 |
| 2.3 乙氧喹对饲料抗氧化能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 氧化与抗氧化剂 |
| 3.2 VC对饲料抗氧化能力的影响 |
| 3.3 VE对饲料抗氧化能力的影响 |
| 3.4 乙氧喹对饲料抗氧化能力的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 不同水平防霉剂对TMR颗粒饲料贮存效果的影响研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要试剂及配制方法 |
| 1.4 试验设计 |
| 1.5 样品的保存与采集 |
| 1.6 测定指标及方法 |
| 1.7 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 贮藏室温湿度变化 |
| 2.2 贮存期间水分的变化 |
| 2.3 贮存期间饲料霉变情况 |
| 2.4 贮存期间饲料中霉菌数量的变化 |
| 2.5 饲料中霉菌菌群分布情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 环境对饲料防霉效果的影响 |
| 3.2 贮存期内饲料水分的变化 |
| 3.3 贮存期内饲料感官的变化 |
| 3.4 贮存期内霉菌的变化 |
| 3.5 饲料中霉菌菌群分布情况 |
| 4 小结 |
| 第二部分 TMR颗粒饲料饲养效果研究 |
| 试验四 TMR颗粒饲料对妊娠母羊采食行为、反刍行为和表观消化率的影响研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验地点 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 饲养管理 |
| 1.5 测定的指标 |
| 1.6 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同处理TMR颗粒饲料对妊娠母羊采食行为的影响 |
| 2.2 不同处理TMR颗粒饲料对妊娠母羊反刍行为影响 |
| 2.3 不同处理TMR颗粒饲料对妊娠母羊表观消化率的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同处理TMR颗粒饲料对妊娠母羊采食行为的影响 |
| 3.2 不同处理TMR颗粒饲料对妊娠母羊反刍行为的影响 |
| 3.3 不同处理TMR颗粒饲料对妊娠母羊表观消化率的影响 |
| 4 小结 |
| 试验五 不同处理TMR颗粒饲料对绵羊瘤胃体外发酵的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 供体动物与瘤胃液的采集 |
| 1.3 人工瘤胃培养系统 |
| 1.4 试验设计 |
| 1.5 测定指标及方法 |
| 1.6 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中p H的影响 |
| 2.2 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中产气量的影响 |
| 2.3 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中NH_3-N的影响 |
| 2.4 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中MCP的影响 |
| 2.5 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中VFA的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中p H值的影响 |
| 3.2 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中产气量的影响 |
| 3.3 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中NH_3-N的影响 |
| 3.4 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中MCP的影响 |
| 3.5 不同处理TMR颗粒饲料对体外瘤胃发酵液中VFA的影响 |
| 4 小结 |
| 试验六 不同处理TMR颗粒饲料对妊娠母羊血液生化指标的影响研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 饲养管理 |
| 1.5 血样的采集 |
| 1.6 测定指标 |
| 1.7 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血清总蛋白的影响 |
| 2.2 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血清白蛋白的影响 |
| 2.3 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血清尿素氮和肌酐的影响 |
| 2.4 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血糖的影响 |
| 2.5 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血清甘油三酯的影响 |
| 2.6 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血钙和的血磷影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊的蛋白质代谢的影响 |
| 3.2 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血糖的影响 |
| 3.3 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血清甘油三酯的影响 |
| 3.4 不同处理的TMR颗粒饲料对妊娠母羊血钙和血磷的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 结论 |
| 第四章 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
四、绵羊高效繁殖的生物工程技术（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]绵羊产羔数性状的分子遗传机理研究[D]. 种玉晴. 华中农业大学, 2021
- [3]基于全基因组重测序筛选多胎萨福克羊高繁殖力相关基因的研究[D]. 王明远. 石河子大学, 2021(02)
- [4]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [5]MSTN基因敲除和FecB基因突变滩羊扩繁试验[D]. 吴艳芳. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究[D]. 吴飞. 浙江大学, 2021
- [7]辽宁绒山羊高繁候选基因SNP及其调控非编码RNA的表达分析[D]. 岳畅. 沈阳农业大学, 2020(05)
- [8]湖羊ZFY基因干扰载体及外泌体介导对性别控制的影响[D]. 武赟. 石河子大学, 2020(01)
- [9]陕北白绒山羊MMAF相关基因遗传变异的挖掘及其与产羔数关联研究[D]. 王真. 西北农林科技大学, 2020(04)
- [10]绵羊TMR颗粒饲料加工工艺及应用效果研究[D]. 葛文霞. 石河子大学, 2020