一、PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白在K562细胞内的含量变化（论文文献综述）
王丽静[1]（2021）在《慢性髓细胞白血病中ABL1激酶通过磷酸化抑癌因子Smad4以抑制TGF-β信号通路的研究》文中研究指明TGF-β信号通路是广泛调控生物体生命活动最重要的信号通路之一。TGF-β可以通过促进p15、p21、p57等抑癌基因的表达以及下调c-Myc等原癌基因的表达,从而抑制细胞增殖,以维持细胞正常的增殖稳态。因而,在多种癌症中TGF-β信号通路被作为破坏的靶标以实现癌细胞的过度增殖。比如在白血病中,虽然白血病类型有很多,但TGF-β信号通路被普遍认为是受到抑制的。而且,多种实体瘤中TGF-β信号通路中的重要成员经常发生缺失或失活突变,但在白血病中,类似的现象却比较少见。那么白血病细胞是如何逃逸TGF-β信号通路监控的呢?本课题在慢性髓细胞白血病（CML）中进行了深入的探讨。CML是一种髓系造血细胞恶性增殖疾病,酪氨酸激酶活性异常激活的BCR-ABL1融合蛋白对于CML的发生发展起着至关重要的作用,存在于高达95%的CML病人中。通过酪氨酸激酶库的筛选,我们发现ABL激酶可以磷酸化TGF-β信号通路中的关键蛋白Smad4,并且这种磷酸化现象进一步在人源CML细胞系K562中有检测到。通过质谱以及点突变等实验,我们找到了 ABL激酶磷酸化Smad4的主要位点,分别为Y195,Y301以及Y322。在TGF-β信号通路响应良好的细胞系中过量表达ABL激酶会明显削弱TGF-β所诱导的CDK抑制因子的表达以及影响TGF-β对于细胞增殖的阻滞作用。相反,在CML细胞系K562中加入ABL激酶的抑制剂Gleevec会显着增强细胞对于TGF-β信号的响应,并且我们发现TGF-β的使用也会增强K562对于Gleevec药物的敏感度。我们进一步发现,Smad4被ABL激酶磷酸化后,会降低其与转录共激活因子β300的结合从而导致了TGF-β信号通路的正常转录受到影响。最后,为了确认ABL激酶通过磷酸化Smad4而影响TGF-β的功能性位点,我们在K562 Smad4敲除的细胞系中分别回补了 Smad4 Y195/301/322F以及Y195/301/322E的突变体。结果发现回补Smad4 Y195/301/322F的K562对于TGF-β信号通路的响应增强,并且对于Gleevec的敏感性也明显提高,而回补Smad4 Y195/301/322E的K562对于上述两方面的现象恰恰是相反的。并且该现象在白血病小鼠模型中也得到进一步的验证。我们的研究首次证实Smad4是ABL激酶的靶蛋白并且进一步阐明了 CML以及其靶向药物Gleevec新的分子机制,这些研究结果一方面为研究CML与TGF-β信号通路之间的联系提供了理论依据,另一方面也为将来CML的治疗以及Gleevec药物的应用提供科学指导。
王金霞[2]（2020）在《LncRNA119766-miR-124-3p-CRKL axis通过PI3K/AKT通路调控K562细胞恶性行为》文中研究表明背景:慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种血液系统恶性肿瘤,是因为骨髓中多能造血干细胞异常而引起的,以外周血与骨髓中粒细胞异常增多为主要病症。其主要特征是形成Ph染色体（即形成BCR-ABL融化基因）,此融合基因的编码产物是一种酪氨酸激酶,可以磷酸化底物蛋白的酪氨酸残基而使其被激活,发生信号级联反应,形成信号级联复合体,致使细胞功能异常,包括细胞增殖、迁移、侵袭能力增强,凋亡减弱,细胞分化能力受抑制等。CRKL是信号接头蛋白CRK家族成员之一,含有一个SH2和两个SH3结构域,呈现SH2-SH3-SH3结构形式。它可以通过SH2和SH3的结构域来招募多种信号分子,起到信号开关的作用,在CML的发生与发展中起着重要的作用。mi R-124-3p是一种高度保守的mi RNA,其2-8 nt是种子序列（即mi RNA识别元件）,可以反向互补结合靶标分子m RNA的3’端非翻译区（m RNA-3′-UTR）或者Lnc RNA中的互补序列,诱导其降解或着抑制m RNA翻译从而调控靶基因的表达。近年来有文章报道mi R-124-3p表达量下降与肿瘤发生发展有关,能够调控肿瘤生长、转移等。长链非编码RNA（Lnc RNA）是近年来的研究热点,其在转录调控,转录后加工,DNA损伤修复,染色质重组等多种生物学功能中发挥重要作用。大多数Lnc RNA分布在细胞核或者细胞质中,由于其分布不同作用方式也不尽相同。在胞质中的Lnc RNA主要的作用方式是作为竞争性内源RNA参与基因调控。竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）是一种新的调控肿瘤进展和转移的作用途径。其会涉及到lnc RNA,mi RNA和m RNA等分子。Lnc RNA与mi RNAs的反应原件（MREs）结合,通过“海绵”性竞争结合mi RNA,阻止其与m RNA结合,调控基因的表达,形成lnc RNA-mi RNA-m RNA对话调控机制。本组前期研究发现CRKL能够抑制K562细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并促进细胞分化。为了研究其发挥作用的分子机制,我们用基因芯片筛选了CRKL敲降后变化的Lnc RNA。将筛选到的下调明显的Lnc RNA119766作为研究的重点。Lnc RNA119766是一个长度为2173 bp的长链非编码RNA,位于人类7号染色体上,CRKL敲降后Lnc RNA119766下调明显,其可能在CRKL发挥生物学功能的过程中起到重要作用。文献报道,mi R-124-3p在CML中低表达,通过生物信息学预测分析发现mi R-124-3p对CRKL和Lnc RNA119766存在潜在的靶向负调控作用。Lnc RNA119766可能作为ce RNA通过“海绵”性竞争结合mi R-124-3p,阻止其与CRKL结合而调控其水平变化进而调控CML的发生发展。Lnc RNA119766/mi R-124-3p/CRKL axis在CML中的相互关系及作用机制未见报道。目的:1、检测CRKL、Lnc RNA119766、mi R-124-3p在CML患者临床样本中的表达水平;2、验证Lnc RNA119766-mi R-124-3p-CRKL网络调控关系;3、明确CRKL、mi R-124-3p对K562细胞体外增殖,迁移,侵袭等细胞恶性表型的影响;4、探讨Lnc RNA119766-mi R-124-3p-CRKL axis调节CML细胞恶性行为的作用机制。方法:1、基因芯片检测CRKL下调K562细胞中差异表达的Lnc RNA;2、q RT-PCR检测CRKL、Lnc RNA119766、mi R-124-3p在CML患者临床样本中的表达情况,并分析三者的相关性;3、q RT-PCR和Western blotting（WB）检测mi R-124-3p对CRKL、Lnc RNA119766表达水平变化的影响;4、构建双萤光素野生型psi CHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT、psi CHECK2-Lnc RNA119766-WT及突变型psi CHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT、psi CHECK2-Lnc RNA119766-MUT重组表达载体,双萤光素酶报告实验验证mi R-124-3p对CRKL-3′-UTR、Lnc RNA119766的靶向结合;5、RNA免疫共沉淀（RIP）法检测AGO2抗体富集的细胞内mi R-124-3p和Lnc RNA119766的水平,验证mi R-124-3p对Lnc RNA119766的靶向负调控作用;6、瞬时转染PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-CRKL、PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro于K562细胞中,q RT-PCR和WB检测CRKL的表达,并检测CRKL表达变化对mi R-124-3p、Lnc RNA119766表达水平变化的影响;7、瞬时转染PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-Lnc RNA119766和PCDH-EF1-MCST2A-Puro至K562细胞中,q RT-PCR检测Lnc RNA119766表达水平及Lnc RNA119766过表达对mi R-124-3p、CRKL m RNA表达水平变化的影响;WB检测Lnc RNA119766过表达对CRKL蛋白表达水平变化的影响;8、将si Lnc RNA119766以及阴性对照si NC分别瞬时转染至K562细胞中,q RT-PCR检测Lnc RNA119766的表达水平及Lnc RNA119766下调对mi R-124-3p、CRKL m RNA表达水平变化的影响;WB检测Lnc RNA119766下调对CRKL蛋白表达水平变化的影响;9、CCK-8检测mi R-124-3p,CRKL对K562细胞增殖能力的影响;10、Transwell实验检测mi R-124-3p,CRKL对K562细胞迁移,侵袭能力的影响;12、Rescue实验验证CRKL上调是否反转mi R-124-3p对K562细胞迁移的抑制作用;13、WB检测CRKL、Lnc RNA119766、mi R-124-3p对PI3K/AKT通路分子表达变化的影响;14、蛋白免疫共沉淀（Co-IP）研究CRKL与PI3K直接相互作用关系;15、PI3K特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路后,WB检测CRKL、Lnc RNA119766、mi R-124-3p对PI3K/AKT通路分子表达变化的影响;Transwell检测CRKL、Lnc RNA119766、mi R-124-3p表达水平改变引起的K562细胞迁移能力的变化。结果:1、通过基因芯片结果筛选,CRKL敲降后有111个Lnc RNA表达下调（Fold change<0.5）,288个Lnc RNA表达上调（Fold change>1.5）;2、与正常人相比,CRKL、Lnc RNA119766在CML患者样本中表达水平升高,mi R-124-3p表达水平降低;CRKL与Lnc RNA119766表达水平呈正相关,与mi R-124-3p呈负相关,且Lnc RNA119766与mi R-124-3p表达水平呈负相关;3、mi R-124-3p上调促进CRKL m RNA、蛋白及Lnc RNA119766表达水平,mi R-124-3p下调抑制CRKL m RNA、蛋白及Lnc RNA119766表达水平;4、双萤光素酶报告实验检测发现:与对照组相比,mi R-124-3p mimic与psi CHECK-2-CRKL-3-UTR-WT/WT1/WT2共转染后使萤火虫萤光素酶酶活性与海肾萤光素酶的酶活性比值下降,当将两个结合位点突变后,mi R-124-3p对相对双萤光素酶活性没有抑制效果,说明mi R-124-3p靶向结合CRKL-3′-UTR的两个结合位点调控CRKL,CRKL是mi R-124-3p的直接靶基因。同时mi R-124-3p与psi CHECK2-Lnc RNA119766-WT、psi CHECK2-Lnc RNA119766-WT3共转染后使相对萤光素酶活性比值下降,将结合位点突变后,双萤光素酶相对活性相对于对照组没有变化;mi R-124-3p与WT1、WT2、MUT1、MUT1共转染后相对双萤光素酶活性不受影响。说明Lnc RNA119766是mi R-124-3p的直接靶基因,mi R-124-3p主要直接靶向Lnc RNA119766第三个结合位点抑制Lnc RNA119766的表达;5、RIP结果显示:相对于Ig G抗体组,mi R-124-3p和Lnc RNA119766在AGO 2抗体组的表达明显升高,mi R-124-3p能够靶向调控Lnc RNA119766;6、瞬转获得CRKL过表达的细胞株,CRKL上调促进Lnc RNA119766表达,抑制mi R-124-3p表达;CRKL下调抑制Lnc RNA119766表达,促进mi R-124-3p表达;7、瞬转获得Lnc RNA119766过表达的细胞株,Lnc RNA119766上调促进CRKL表达,抑制mi R-124-3p表达;Lnc RNA119766下调抑制CRKL表达,促进mi R-124-3p表达;8、CCK-8结果表明:CRKL上调促进K562细胞增殖能力;mi R-124-3p上调抑制K562细胞增殖能力,mi R-124-3p下调促进K562细胞增殖能力;9、Transwell结果表明:CRKL上调促进K562细胞的迁移,侵袭能力;mi R-124-3p上调抑制K562细胞体外迁移,侵袭能力,mi R-124-3p下调促进K562细胞体外迁移,侵袭能力;10、Rescue实验结果显示:相对于mi R-124-3p mimic组,mi R-124-3p+PCDHCRKL组CRKL的水平升高,细胞迁移能力增强;而相对于PCDH-CRKL组,mi R-124-3p+PCDH-CRKL组CRKL的水平降低,细胞迁移能力减弱;外源性的PCDH-CRKL质粒中没有3′-UTR,mi R-124-3p无法对外源性导入的CRKL起作用,只能够抑制内源性CRKL的表达,因此CRKL表达上调会逆转mi R-124-3p对K562细胞迁移能力的抑制。进一步说明mi R-124-3p是通过靶向负调控CRKL的表达从而发挥其生物学功能;11、Co-IP结果表明:CRKL与PI3K直接结合。12、CRKL、Lnc RNA119766、mi R-124-3p能够影响PI3K/AKT信号通路。CRKL、Lnc RNA119766下调和mi R-124-3p上调均抑制PI3K、p-AKT的表达,CRKL、Lnc RNA119766上调和mi R-124-3p下调均促进PI3K、p-AKT的表达;13、PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路后,mi R-124-3p、CRKL、Lnc RNA119766对PI3K/AKT通路的促进作用被抑制;且CRKL、Lnc RNA119766上调、mi R-124-3p下调对K562细胞迁移能力的促进作用被抑制。说明Lnc RNA119766-mi R-124-3p-CRKL axis通过PI3K/AKT通路调控K562细胞的迁移能力。结论:1、相较于正常人,CRKL、Lnc RNA119766在CML患者样本中表达水平升高,mi R-124-3p表达水平降低;CRKL与Lnc RNA119766呈正相关,与mi R-124-3p呈负相关,且Lnc RNA119766与mi R-124-3p呈负相关;三者在临床样本水平符合ce RNA调控关系;2、CRKL、mi R-124-3p、Lnc RNA119766三者在K562细胞中存在ce RNA调控关系;3、CRKL、mi R-124-3p能够影响K562细胞恶性行为;4、Lnc RNA119766-mi R-124-3p-CRKL axis通过调控PI3K/AKT信号通路影响K562细胞的恶性行为;
康志杰,闫金松,崔嵩,李国辉,黄斯勇,梁亮,尹郸丹,梁英民[3]（2014）在《PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响》文中认为目的研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域（actin-binding domain,ABD）蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域（protein transduction domain,PTD）将蛋白转入白血病细胞内,应用Western blot与免疫荧光法确定蛋白是否进入白血病细胞,然后分别应用流式细胞仪及MTT法检测融合蛋白对白血病细胞凋亡及增殖的影响。结果成功构建PTD-ABD融合表达载体,获得高纯度PTD-ABD融合蛋白。同时构建PTD表达载体并获得高纯度表达蛋白。将PTD、PTD-ABD蛋白与白血病细胞K562、HL60共培养,Western blot与免疫荧光法确定PTD、PTD-ABD蛋白成功进入细胞内。与阴性对照比较,PTD-ABD蛋白能显着抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的凋亡具有明显的促进作用,差异具有统计学意义（P<0.05）,但对K562细胞的增殖及凋亡无影响（P>0.05）;PTD蛋白对K562、HL60细胞的增殖及凋亡无影响,与阴性对照比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论PTD转导的ABD蛋白抑制HL60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。
彭智[4]（2011）在《腺病毒介导的SH2-DED融合肽抑制CML细胞增殖和诱导凋亡的效应研究》文中研究表明慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）以持续表达具有强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL癌蛋白为重要特征。有研究证实BCR-ABL融合蛋白的第177位酪氨酸（Y177p）自身磷酸化后，结合接头蛋白（Growth receptor bound protein2, Grb2）的SH2结构域，是最终异常激活BCR-ABL下游RAS-MAPK、PI3K-AKT信号途径，导致细胞恶性转化的关键因素。而死亡效应结构域（death effector domain,DED）在启动caspase8前体蛋白寡聚化而激活caspase8、最终导致细胞凋亡中发挥了重要作用。所以我们推测：通过外源性转导SH2-DED（SD）融合蛋白来竞争性抑制BCR-ABL Y177p与Grb2的结合，同时激活caspase8诱导细胞凋亡，可成为CML治疗的新切入点。本课题拟通过基因重组技术，将Grb2的SH2结构域与FADD的DED结构域基因融合表达，选用新近报道的用于基因治疗的腺病毒Ad5F35新型载体系统，以高表达BCR-ABL融合蛋白的CML细胞株K562细胞和KU812细胞为体外模型，探讨融合蛋白SD-HA能否通过竞争结合BCR-ABL的第177位酪氨酸磷酸化位点，调控与其相关的下游信号分子活性，进而对CML细胞生长、增殖、凋亡的影响及其具体作用机制。旨在探索一种新的CML分子靶向治疗策略。采用的实验方法如下：1.重组腺病毒质粒Ad5F35-SD-HA（便于后期免疫学检测引入HA标签）和突变对照Ad5F35-SmD-HA的构建、鉴定、包装和制备高滴度病毒；荧光显微镜筛选腺病毒Ad5F35-SD-HA、Ad5F35-SmD-HA对CML细胞的感染条件及流式细胞仪分析确定感染效率；免疫细胞化学染色和激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在CML细胞内表达的亚细胞定位情况；RT-PCR及Western blot进一步分析目的蛋白SD-HA、SmD-HA在各种CML细胞内的mRNA转录水平和蛋白表达。为进一步探讨融合蛋白治疗肽SD-HA对CML的治疗作用奠定实验基础。2.通过克隆形成实验, MTT及流式细胞术检测细胞周期，观察重组腺病毒Ad5F35-SD-HA介导的融合蛋白SD-HA转导对CML细胞的特异性抑制增殖效应。通过瑞氏染色观察细胞形态及流式细胞仪检测细胞凋亡，分析重组腺病毒Ad5F35-SD-HA介导的融合蛋白SD-HA表达对CML细胞促凋亡的生物学效应。3.进一步分析融合蛋白SD-HA对CML细胞抑增殖、促凋亡效应的具体作用机制。Western blot结合免疫共沉淀技术分析融合蛋白SD-HA与BCR-ABL的第177位酪氨酸磷酸化位点Y177p的相互作用，及其对BCR-ABL下游信号途径Ras-MAPK、PI3K-Akt的影响；Westernblot分析融合蛋白SD-HA对细胞膜受体死亡途径caspase级联反应的影响。通过以上实验，获得如下结果和结论：1.构建、鉴定了腺病毒Ad5F35-SD-HA、Ad5F35-SmD-HA的重组表达质粒，并将腺病毒包装、扩增，验证了其在CML细胞中的高感染率，实现了目的基因和蛋白的有效表达，明确融合蛋白SD-HA，SmD-HA在靶细胞的胞浆定位特性，为进一步研究目的蛋白SD-HA的生物学功能奠定了基础。2.验证了重组腺病毒Ad5F35-SD-HA感染CML细胞后能特异性降低CML细胞的克隆形成能力，阻滞CML细胞周期由G0/G1期向S期推进等抑制细胞的增殖效应。通过细胞形态学观察腺病毒Ad5F35-SD-HA感染CML细胞后，细胞出现空泡，核聚集和碎裂，FCM检测结果显示与对照组比较其早期凋亡细胞明显增多（p﹤0.05）等细胞凋亡的效应。3.证实了病毒载体表达SD-HA融合肽对CML细胞抑增殖和促凋亡的机制，是分别通过SH2结构域与Grb2竞争性结合BCR-ABL Y177磷酸化位点，抑制RAS和PI3K增殖信号途径；通过DED域与caspases8前体DED结构域结合而寡聚化，激活caspases8诱导的细胞凋亡信号来实现的。
姚娜[5]（2009）在《Grb2的RNA干扰对K562细胞侵袭和迁移能力的影响》文中提出【目的】慢性髓细胞性白血病（chronic myelognous leukemia,CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病,以融合蛋白bcr-abl的出现为主要遗传系特征。慢性白血病急性发作是以大量白血病细胞从骨髓释放入外周血并浸润各种组织为主要特征,恶性肿瘤的转移所导致的多脏器功能衰竭是患者死亡的重要因素[1],防止肿瘤转移是肿瘤治疗的关键之一。生长因子受体连接蛋白-2（the growth factor receptor -bound protein-2,,Grb2）与许多癌症关系密切,在慢性粒细胞白血病中,Grb2直接或通过SHC分子与bcr-abl融合蛋白结合,激活RAS信号通路,导致造血细胞恶性转化,其相关信号转导通路的阻断在CML治疗中具有重要意义。本研究探讨Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响并分析可能的影响因素,以期为肿瘤浸润转移的基因治疗提供新的思路。【方法】1、构建针对Grb2基因的siRNA的原核表达载体根据GenBank中Grb2的序列设计4对互补的siRNA寡核苷酸链,将正、负DNA单链退火后分别与pSilencer4.1-CMV原核表达载体相连,并转化大肠杆菌TOP10,挑取氨苄青霉素抗性菌落并扩增培养,经快速小量制备质粒及核酸测序鉴定,证实pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体构建成功。2、稳定转染K562细胞以脂质体介导法将pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体转染人慢性髓细胞性白血病细胞K562,应用潮霉素筛选稳定表达siRNA的细胞克隆,通过Western blot和RT-PCR技术,检测在转染了含有Grb2 siRNA重组质粒的K562细胞（K562/pSilence-4.1CMV-Grb2）、转染空载体组细胞（K562/ pSilence-4.1CMV）和未转染组细胞（K562）中Grb2的表达情况。3、细胞迁移和侵袭能力检测应用体外迁移和侵袭能力实验测定上述各组细胞的迁移和侵袭能力。【结果】成功构建了pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体,该重组质粒可通过脂质体介导转染人慢性髓细胞性白血病细胞K562,获得稳定表达siRNA原核载体的细胞株K562 /pSilence -4.1CMV -Grb2/405、K562/pSilence-4.1CMV-Grb2 /541及K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/215;通过Western blot和RT-PCR检测可见K562 /pSilence-4.1CMV-Grb2/405细胞较K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/541、K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/215、K562/pSilence-4.1CMV和K562细胞Grb2蛋白和核酸的表达水平显着降低;侵袭迁移实验表明,K562/pSilence4.1CMV-Grb2/405与K562/pSilence-4.1CMV和K562细胞相比,细胞迁移和侵袭能力均下降。【结论】RNAi原核表达载体pSilence-4.1CMV-Grb2可以通过脂质体稳定转染入人慢性髓细胞性白血病细胞K562中,pSilence-4.1CMV-Grb2/405可有效抑制K562细胞Grb2蛋白和核酸的表达,并显着降低K562细胞迁移和侵袭能力,为进一步研究以Grb2为靶点的抗肿瘤治疗奠定了基础。
康志杰[6]（2008）在《ABD蛋白的表达及对K562，HL60细胞的作用研究》文中认为研究背景慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）是发生于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤,1845年Craigie[1]和Bennet [2]在爱丁堡发现。在1960年,Nowell和Hunger-ford首先在费城发现CML病人具有获得性的染色体异常,将这个异常的染色体命名为费城染色体（Philadelphia,Ph[3, 4]）。1973年,Rowley发现它是9号和22号染色体长臂间交互易位的结果,即t（9,22） （q34;ql1）[ 5]。1983年以后,证实了9号染色体上c-abl与22号染色体上bcr基因交互易位,在22号染色体上形成了BCR—ABL融合基因,编码BCR—ABL融合蛋白,表达P190,P210,P230融合蛋白,具有很强的酪氨酸激酶活性,可使一系列信号蛋白发生持续性的磷酸化,导致白血病的发生[6]。CML病人经历慢性期、加速期、急变期三个阶段,各自的中位数时间分别为3～4年;6～9个月;3～6个月[7]。目前,CML的治疗方法主要有化疗、干扰素治疗、STi571（甲磺酸伊马替尼）、干细胞移植等。传统的化疗手段虽能改善症状,缓解病情,但不能阻止疾病的转化,不能从根本上消除恶性克隆;干扰素治疗血液学缓解率70～80%,存活期延长72个月;异基因骨髓移植（allo-BMT）是目前最有希望治愈慢粒的方法,但有30%～35%患者移植后出现与移植物抗宿主病（GVHD）相关的致命性并发症,另外,患者本身的年龄要求以及不到1/3的患者可找到配型相一致的同胞骨髓供者等因素限制了其临床应用;自体骨髓移植（ABMT）相关并发症发生率较低,不受年龄限制,但缺乏有效的体外骨髓净化措施以预防残留白血病细胞导致的复发。STi571是一种bcr-abl融合蛋白酪氨酸激酶抑制剂,STi571单独或者联合干扰素治疗有效的CML患者,血液学缓解率可以达到90%,已经肯定能延长CML患者生存期,这为CML的靶向治疗开辟了一个新的领域,但是STi571的耐药性问题至今无法解决。目前,众多的临床及实验研究表明,bcr-abl融合基因及其表达产物bcr-abl融合蛋白是慢性粒细胞性白血病治疗上的特异性靶位[8, 9]。随着对bcr-abl癌蛋白的结构和功能的不断研究,人们逐渐认识到在不同的结构域水平对该蛋白的结构和功能进行干预,同样也可以抑制bcr-abl蛋白酪氨酸激酶的活性,这也提示人们继续探索更好的慢粒的治疗方法。ABD（肌动蛋白结合域,actin binding domain）区是bcr-abl融合蛋白上C末端的一个结构域[10],研究表明,ABD在BCR/ABL PTK介导的白血病生成中起重要作用[11-13],白血病的发生依赖于碳末端的ABD存在,ABD变异可以降低体外肿瘤细胞的生存活力[11],而在体内则延迟肿瘤的发病时间,因此如果能够有效调控ABD区,就有可能控制bcr-abl融合蛋白的转化活性,从而达到治疗CML的目的。本实验通过分子生物学方法得到ABD片断,进行融合表达,对ABD的功能进行研究,从而为白血病的靶向治疗奠定新的分子基础。实验目的体外获得bcr-abl融合基因的ABD区结构域,进行原核表达,并将融合表达蛋白作用于白血病细胞系,进一步探讨其对白血病的细胞周期和增殖的影响,为探索CML新的药物作用靶点和新的治疗药物奠定了基础。实验方法根据GenBank中人ABD结构域基因的碱基序列,按照引物设计原则,针对ABD基因设计引物。以带有人类慢性粒细胞白血病bcr-abl基因全长的PGD210质粒[14]为模板,应用PCR技术扩增出ABD基因的编码序列,测序结果证实与GenBank中完全一致;将ABD基因的插入到融合有PTD（蛋白转导结构域,protein tansductong domain）基因片段的原核表达载体pET32a中,以获得PTD-ABD融合基因。将构建重组原核表达载体pET32a-PTD-ABD转化感受态细胞大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,改变诱导条件,使目的蛋白PTD-ABD在上清中有较大量表达。大量诱导细菌,用次氮基三乙酸镍琼脂糖（Ni-NTA agarose）亲和层析珠对可溶性目的蛋白进行纯化。将目的蛋白PTD-ABD与K562细胞和Hela,HL60细胞共培养,用免疫荧光和Western blot的方法观察和验证目的蛋白的跨膜转运情况;用光学显微镜和细胞计数研究细胞形态和生长曲线的变化; MTT、流式细胞仪技术研究PTD-ABD融合蛋白对K562细胞和HL60细胞的增殖和凋亡的作用。实验结果ABD结构域基因被有效的扩增,DNA序列分析表明所构建的PTD -ABD融合基因的表达质粒与预期设计相同,ABD、PTD、PTD-ABD融合蛋白得到正确的表达。且PTD-ABD目的蛋白成功导入K562细胞和HL60中,能显着抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的增殖具有明显的抑制作用。实验讨论本研究成功地构建了原核表达载体pET32a-PTD-ABD,并顺利表达PTD-ABD融合蛋白于上清中。在功能实验中,研究了目的蛋白对K562,HL60细胞的作用。这一实验结果为下一步研究目的蛋白的作用机制,以及为探索CML新的治疗药物和新的药物作用靶点奠定了基础。
阴继凯[7]（2007）在《以Src家族同源结构域为抗肿瘤治疗靶位点的研究》文中研究表明研究背景和目标:近年来,随着生命科学研究的飞速进展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调节、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。为抗癌药物的研制提供了新的契机。研究表明大多数肿瘤的发生、发展及转移均与多种酪氨酸激酶的过表达有着密切的关系。然而,不论是正常的基因还是癌基因编码的蛋白酪氨酸激酶在与下游蛋白相互作用时都需要共同的结构单元-Src家族同源结构域2和3（Src homology domain,SH2&SH3）。两者通过介导酪氨酸激酶与含有磷酸化酪氨酸序列的蛋白分子相互作用从而参与许多重要的细胞信号转导过程。正是由于SH2和SH3介导的蛋白结合在多种酪氨酸激酶始动的细胞增殖信号中发挥着重要作用,因此Src家族同源结构域正逐渐成为新的抗肿瘤治疗靶位点。基于相关研究背景,我们将PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白应用于荷肝癌HepG-2肿瘤裸鼠的治疗性研究,探讨该蛋白对肝癌HepG-2肿瘤生长的体内抑制作用以及对裸鼠生存期的影响。以相似的蛋白构建原则构建含有Grb2-SH2的原核表达载体,表达并纯化含有TAT48-60（GRKKRRQRRRPPQ）序列的His-PTD-Grb2-SH2融合蛋白。将His-PTD-Grb2-SH2融合蛋白应用于体外功能实验初步探讨其生物学活性。从而为以Src家族同源结构域作为抗肿瘤靶位点的研究提供新的实验依据。研究方法:我们选择Balb/C裸鼠通过肢体单侧皮下分别接种1×106 HepG-2细胞构建裸鼠荷肝癌HepG-2肿瘤模型,然后将PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白采用局部注射的方式干预肿瘤生长并影响裸鼠的生存时间。另一方面我们采用PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白设计原理,构建融合蛋白表达载体,将编码Grb2-SH2结构域的cDNA导入pET-16b-PTD原核表达载体,表达并纯化同时含有蛋白转导结构域和Grb2-SH2结构域的融合蛋白--His-PTD-Grb2-SH2,经Western-blot鉴定后将该融合蛋白用于初步的体外实验研究。通过免疫荧光方法鉴定His-PTD-Grb2-SH2融合蛋白是否能够顺利通过细胞膜,光镜观察该蛋白对于细胞的形态学影响,MTT（噻唑蓝）法测定细胞生长曲线和细胞生长抑制率进一步研究该蛋白在体外对于细胞的增殖的影响。研究结果:在对荷肝癌细胞系HepG-2肿瘤裸鼠的治疗性研究中,PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白表现出显着的抗肿瘤效应。该蛋白能够明显抑制肿瘤生长,实验组肿瘤体积明显小于对照组,在生存时间上该蛋白的应用明显有益于荷瘤裸鼠的生存期延长。在以SH2结构域为靶位点的研究中,通过基因重组技术我们成功构建,经过酶切鉴定及测序结果证实获得含有Grb2-SH2结构域的原核表达载体。经过表达、纯化及Western-blot鉴定,我们得到了一种全新的融合蛋白His-PTD-Grb2-SH2。体外研究表明,该蛋白能够顺利通过乳腺癌SKBR-3细胞和胃癌SGC-7901细胞的生物膜结构分布在胞浆及细胞核内,MTT（噻唑蓝）法测定细胞生长曲线和细胞生长抑制率进一步证明该蛋白在体外对于两种肿瘤细胞的增殖有着明显的抑制作用。结论:以Src家族同源结构域作为抗肿瘤靶位点的研究中,我们采取全新思路,通过直接将SH2和SH3结构域导入细胞内竞争结合相应的底物位点从而干扰细胞信号转导途径获得成功。在体内研究中PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长并延长荷瘤裸鼠的生存期。His-PTD-Grb2-SH2在体外研究中也表现出穿膜特性及肿瘤生长抑制作用。这些研究为深入探讨以Src家族同源结构域作为抗肿瘤靶位点的研究提供了新的实验证据。
叶韵斌[8]（2007）在《Grb2抑制剂peptidimer-c抗K562细胞的实验研究》文中提出Grb2分子是细胞内一个重要的连接蛋白,在细胞内信号传递中起重要作用,尤其介导由生长因子诱发的Ras活化,并启动了MAPK通路上的系列磷酸化反应,参与细胞生长和分化的调控。一些肿瘤的恶性生长总伴随着Grb2蛋白表达的增加,Grb2分子SH3的突变可抑制Grb2的信号传递功能,从而影响肿瘤细胞的生长、增殖,及其恶性化。Cussac等设计并合成了可与Grb2-SH3特异性结合的二聚肽peptidimer-c,能阻断Grb2与下游分子的连接。本研究以Bcr-abl阳性表达的K562细胞为对象,观察peptidimer-c对K562细胞生长和增殖的影响,探讨其可能的作用机制。一、peptidimer-c的合成、鉴定应用N端基团保护的Fmoc化学,固相合成针对Grb2-SH3的二聚肽peptidimer,载体肽penetratin以及含有载体肽的二聚肽peptidimer-c,用C18层析柱纯化合成的肽,高压液相色谱技术（HPLC）分析肽的纯度,质谱法分析肽的结构,应用pull-down实验,观察peptidimer与K562细胞裂解物中Grb2分子的结合。结果显示,所合成的肽纯度高,HPLC图谱上只见一样品峰而无其它杂峰,质谱分析显示,所合成的化合物与设计的肽是一致的,peptidimer-c的分子量为4794.0,penetratin分子量为2246.7。为了观察peptidimer与K562细胞中Grb2的结合,将合成的peptidimer和penetratin分别结合于琼脂糖凝胶微球（CNBr-Sepharose）上,并与K562细胞裂解液共孵育,Western blot结果显示,peptidimer可与K562细胞中的Grb2分子特异性结合,而penetratin不与Grb2结合。二、peptidimer-c对K562细胞生长增殖的影响在慢性粒细胞白血病中,Bcr-abl可激活胞内多条信号传导通路,维持细胞存活和增生,以及相应的生物学功能。Grb2介导的Ras-MAPK是其主要的信号途径,并与细胞生长的调控息息相关。本部分应用苔盼兰拒染法,观察不同浓度peptidimer-c,作用不同时间对K562增殖的影响,应用克隆形成法观察peptidimer-c对K562细胞生长的影响,通过WST-1法了解peptidimer-c对K562的细胞毒作用,并与Gleevec作比较,分析二者对K562细胞作用的差异。进一步,通过克隆形成实验,探讨peptidimer-c与常用的CML治疗药物Gleevec,羟基脲,及阿糖胞苷联合应用,对K562克隆形成的影响,应用金式公式计算q值,并根据q值的大小,制定两种药物的合并效应。苔盼兰计数法结果提示,peptidimer-c可明显抑制K562细胞的生长,且在加药后短时间内（3-6h）即有明显作用。peptidimer-c对K562的生长增殖的抑制呈浓度依赖型,而非时间依赖型。单用载体penetratin,未见明显的增殖抑制。而Gleevec则在加药24h后才出现明显的生长增殖抑制,其作用方式既表现为浓度依赖性,亦表现时间依赖性。peptidimer-c与Gleevec对K562均有细胞毒作用,且Gleeve的细胞毒作用远大于peptidimer-c。WST-1检测结果显示,peptidimer-c杀伤K562细胞的半致死剂量为（17.85±2.10）μM,而Gleevec的半致死剂量为（0.25±0.05）μM。在甲基纤维素半固体培养体系中,K562细胞的克隆形成受peptidimer-c抑制,并随着peptidimer-c浓度的增加克隆数逐渐减低,在浓度达到2μM以上时,即有显着性抑制。几种化合物对K562克隆形成抑制的半致死剂量为:peptidimer-c（3.90±0.86）μM,Gleevec（0.03±0.02）μM,羟基脲（15.00±7.07）μM,阿糖胞苷（0.014±0.012）μM。peptidimer-c分别与Gleevec,阿糖胞苷,羟基脲联合应用时,对K562克隆形成抑制均表现为相加作用或协同作用,其中1.5μM peptidimer-c与0.05μM Gleevec联合应用,表现协同作用,1.5μM peptidimer-c与0.006μM阿糖胞苷或0.01μM阿糖胞苷联用,也显示协同抑制效应。提示peptidimer-c可与其它类型的药物合用,以提高抗肿瘤的综合效应。三、peptidimer-c诱导K562细胞的凋亡细胞生长的抑制总是伴随着细胞的死亡,包括坏死和凋亡。本部分应用免疫印迹技术,观察peptidimer-c对K562细胞主要信号分子的影响;通过光镜和透射电镜形态观察,TUNEL法,流式细胞术检测亚二倍体形成、annexin V/PI比例、Caspase-3和Fas的表达水平,探讨peptidimer-c诱导K562细胞死亡的方式和可能的机制。结果表明,用peptidimer-c处理K562细胞后3-6h,细胞就发生明显形态学改变,细胞涨大,进而出现皱缩,并进入死亡阶段,透射电镜观察提示,经peptidimer-c处理,细胞形态改变,核内异染色质增多,边集现象明显,出现典型的凋亡特征。胞内内质网,线粒体结构改变。随着peptidimer-c浓度增加,坏死细胞比例加大。Annexin V/P测定结果也证实,中低浓度peptidimer-c主要诱导K562细胞凋亡,高浓度（27μM）的peptidimer-c在诱导凋亡的同时,直接导致细胞坏死。peptidimer-c的作用可使K562细胞Caspase-3的比例显着增加,提示其通过Caspase-3途径促进K562细胞凋亡,但peptidimer-c并不增加K562细胞死亡受体Fas以及Bcl-2的表达,可以确定,Fas-FasL系统不是peptidimer-c诱导K562细胞的凋亡途径,也与Bcl-2相关途径无关。peptidimer-c通过影响MAPK、PI3K、STAT5信号通路而抑制细胞生长、增殖。四、peptidimer-c对K562细胞周期的改变细胞生长的调节是通过细胞周期的调控得以实现的。本部分应用碘化丙啶一步插入DNA定量荧光染色法,检测peptidimer-c作用后,K562细胞周期各时项的比例,应用免疫印迹法（Western blot）和免疫细胞化学染色法观察K562细胞周期素Cyclin A, Cyclin B,以及周期素依赖性激酶Cdk2,p-Cdk2,,Cdk1, p-Cdk1的表达,探讨peptidimer-c对K562细胞周期的影响及其机制。结果显示,随着peptidimer-c浓度的增加,K562细胞的S期比例明显上升,同时,G0/G1期比例以及G2/M期比例下降,将2细胞阻滞于S期,而Penetratin不改变K562细胞周期。Gleevec亦可使K562细胞周期比例发生改变,但却使细胞阻滞于G0/G1期。Western blot检测结果提示,随着peptidimer-c浓度加大,K562细胞的Cyclin A水平被显着抑制,同时P-Cdk2表达水平亦降低,而CyclinB,Cdk1以及p-Cdk1的表达均未改变。免疫细胞化学染色结果亦显示,peptidimer-c可明显降低K562细胞CyclinA的表达;对Cdk2的抑制不明显,但却使Cdk2分子在细胞核内的分布发生变化,呈现不均一分布,并向核的一边浓聚。以上结果说明,peptidimer-c通过下调细胞内S期相关蛋白CyclinA和p-Cdk2的表达而使K562细胞阻滞于S期,抑制了细胞周期进程。五、peptidimer-c对K562细胞基因表达谱的影响基因芯片法技术通过同时对细胞或个体内的大量基因表达的平行分析,实现从整体上分析细胞表达状况的信息。本部分采用美国Affimetrix公司的人类U133 Plus3.0基因表达谱芯片,探讨经peptidimer-c作用后K562细胞基因表达谱的改变,并用RT-PCR方法对部分有显着差异的基因进行验证。结果显示,应用人类U133 plus 3.0基因表达谱芯片检测经peptidimer-c处理后K562细胞,发现有455个上调表达的基因,以及74个下调表达基因,涉及细胞凋亡,血管生成,细胞周期,信号转导,细胞趋化,蛋白合成、蛋白折叠,转录因子,以及一些功能不明的基因等等。RT-PCR检测结果与基因表达谱芯片检测结果吻合。凋亡相关基因分析表明,petidimer-c可能通过上调TNF及其受体家族成员,和JUN家族,启动K562细胞凋亡;通过抑制热休克蛋白导致细胞死亡。细胞周期相关基因分析表明,petidimer-c可能通过上调细胞周期抑制因子P21、低氧诱导基因95（Hi95, sestrin2）等改变细胞周期进程。
叶盛开[9]（2005）在《OD蛋白的表达及对K562细胞的作用》文中研究指明研究背景 慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病,占成人白血病的20%以上,年发病率约为10万分子1。常见的临床表现为乏力、体重减轻、出汗、腹部异常包块形成、脾脏增大等。慢粒的一个典型的细胞遗传学特征就是至少有95%的患者具有Ph染色体,其分子基础是由位于9号染色体q34的c-abl基因与位于22号染色体q11的bcr基因相互易位,形成BCR-ABL融合基因t（9;22）（q34;q11）,其编码的bcr-abl融合蛋白（p210）具有增强的酪氨酸激酶活性,是引起慢粒发病的主要致病因素。 目前,CML的治疗方法主要有化疗、干扰素治疗、STi571（甲磺酸伊马替尼）、干细胞移植等。传统的化疗手段虽能改善症状,缓解病情,但不能阻止疾病的转化,不能从根本上消除恶性克隆;干扰素治疗血液学缓解率70～80%,存活期延长72个月;STi571是一种bcr-abl融合蛋白酪氨酸激酶抑制剂,STi571单独或者联合干扰素治疗有效的CML患者,血液学缓解率可以达到90%,但是STi571也有其潜在的严重副作用（出血）和耐药性问题,而且不能肯定能够治愈CML或者确实延长CML患者生存期。异基因骨髓移植（allo-BMT）是目前最有希望治愈慢粒的方法,但有30%～35%患者移植后出现与移植物抗宿主病（GVHD）相关的致命性并发症,另外,患者本身的年龄要求以及不到1/3的患者可找到配型相一致的同胞骨髓供者等因素限制了其临床应用;自体骨髓移植（ABMT）相关并发症发生率较低,不受年龄限制,但缺乏有效的体外骨髓净化措施
杨帆[10]（2004）在《1. 慢性粒细胞性白血病融合基因bcr/abl第一外显子条件性基因打靶的实验研究 2. RNA干扰在哺乳动物细胞中的初步应用性研究》文中研究表明9号和22号染色体相互易位形成融合基因bcr／abl，是慢性粒细胞性白血病（CML）的主要发病机制。bcr／abl所编码的融合蛋白p210BCR/ABL具有异常增高的酪氨酸激酶活性，与白细胞的恶性转化密切相关。研究发现，bcr／abl融合基因中bcr基因第一外显子（即bcr／abl的第一外显子bE1）所编码的肽段为激活原癌蛋白c—ABL的酪氨酸激酶活性所必需。本课题拟利用定点打靶系统Cre／loxP系统作用原理，通过同源重组将loxP序列引入CML细胞系K562基因组的bE1两侧，并通过调控Cre酶的表达调控细胞内bE1基因的敲除过程，观察bE1敲除后K562细胞在生长、转移及致癌性等方面的变化，从而为深入阐明CML的发病机理、演变过程、改善治疗方案及估计预后提供有力的理论依据。 我们首先通过四方面的实验全面分析和检验了我们所采用的基因打靶体系的有效性：1)利用染色体检查和核型分析检测了K562细胞内染色体的数目和特点，同时采用原位荧光杂交（FISH）测定了细胞内bcr／abl融合基因的拷贝数和分布情况。染色体检查和核型分析结果显示，K562细胞核内有67～69条染色体，其中22条染色体有2～3条，未见典型的Ph′。而FISH结果却表明，K652细胞虽然没有Ph′，但却有三对或多对bcr／abl或abl／bcr融合基因，无论是bcr、abl还是二者产生的融合基因都存在过度扩增现象。结果表明，K562可以作为针对bcr／abl的基因打靶的靶细胞；不过由于bcr／abl过度扩增，可能需要多次打靶才能观察到打靶的效果。2)应用Tet—on系统的作用原理，分别构建了调控蛋白的表达载体pIREShyg2-rtTA及Cre酶表达载体pTREneo-Cre（含有Tet反应元件TRE），将这两种载体联合转染后，以不同浓度强力霉素（Dox）诱导Cre酶的表达，Western blot检测结果显示：Dox可通过激活调控蛋白rtTA，显着诱导细胞中Cre酶的表达，Cre表达水平与Dox浓度呈正相关。这一结果说明我们建立了可调控型Cre酶的表达体系，为下一步对基因打靶进行调控打下了基础。3)将不同剂量的K562细胞通过尾静脉注射到NOD／SCID小鼠体内，观察尾静脉注射K562细胞对小鼠存活的影响，并对死亡小鼠的内脏进行病检。结果显示，静脉注射1×106～107K562细胞后，除1×106注射的小鼠外，其余剂量组小鼠均发生急性白血病并在13～49天内死亡，小鼠存活时间与注射细胞剂量之间呈明显的负相关关系；死亡小鼠极度消瘦，内脏病检可见肿瘤细胞浸润，有三只小鼠大脑组织中亦可见到肿瘤细胞浸润，这是静脉注射K562细胞导致中枢神经系统白血病的首例报道。上述结果表明NOD／SCID小鼠可作为尾静脉注射K562诱发白血病的良好模型。4)利用PCR分别扩增bE1序列、紧邻其上游、下游的内含子序列以及Abl基因第
二、PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白在K562细胞内的含量变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白在K562细胞内的含量变化（论文提纲范文）
（1）慢性髓细胞白血病中ABL1激酶通过磷酸化抑癌因子Smad4以抑制TGF-β信号通路的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 TGF-β信号通路概述 |
| 1.2 TGF-β信号通路在白血病中的研究现状介绍 |
| 1.3 ABL1蛋白激酶研究进展 |
| 1.4 总结 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ABL1激酶抑制TGF-β信号通路 |
| 3.2 ABL1激酶抑制剂Gleevec回复CML细胞中TGF-β信号通路活性 |
| 3.3 ABL1激酶磷酸化Smad4及其位点解析 |
| 3.4 Smad4磷酸化介导了ABL1激酶对TGF-β信号通路的抑制 |
| 3.5 ABL1激酶抑制TGF-β信号通路的分子机制研究 |
| 3.6 ABL1激酶磷酸化Smad4促进CML白血病细胞生长 |
| 3.7 ABL1激酶磷酸化Smad4抑制TGF-β信号通路的工作模型 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）LncRNA119766-miR-124-3p-CRKL axis通过PI3K/AKT通路调控K562细胞恶性行为（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 1.CML 病人样本和细胞系 |
| 2.主要仪器及试剂 |
| 二.方法 |
| 1.从骨髓样本中提取单个核细胞的过程 |
| 2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物设计与合成 |
| 3.单个核细胞中的RNA相对定量分析 |
| 4.细胞复苏与培养 |
| 5.构建 psiCHECK-2-LncRNA119766、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR 野生型和突变型双萤光素酶重组载体 |
| 6.双萤光素酶报告实验 |
| 7.获得CRKL表达上调的K562细胞株 |
| 8.获得LncRNA119766表达上调和下调的K562细胞株 |
| 9.瞬时转染 NCmimic、miR-124-3pmimic、NCinhibitor、miR-124-3pinhibitor至 K562 细胞 |
| 10.免疫共沉淀(Co-IP)研究CRKL和 PI3K之间的相互作用 |
| 11.RNA-蛋白免疫共沉淀(RIP) |
| 12.功能实验 |
| 13.统计学分析 |
| 结果 |
| 一、CRKL、LNCRNA119766、MIR-124-3P在 CML样本中的表达及三者相关性分析 |
| 1.CRKL在 CML样本中高表达 |
| 2.基因芯片筛选CRKL下调K562 细胞中差异表达的Lnc RNA |
| 3.Lnc RNA119766在CML样本中高表达 |
| 4.mi R-124-3p在 CML样本中低表达 |
| 5.CRKL、Lnc RNA119766、mi R-124-3p在 CML样本中的相关性分析 |
| 二、CRKL、LNCRNA119766、MIR-124-3P在 K562 细胞中的相互关系 |
| 1.miR-124-3p 表达变化对 CRKL、LncRNA119766 的影响 |
| 2.CRKL表达变化对mi R-124-3p、Lnc RNA119766 的影响 |
| 3.Lnc RNA119766 表达变化对CRKL、mi R-124-3p的影响 |
| 三、MIR-124-3P靶向结合CRKL-3′-UTR、LNCRNA119766 |
| 1.生物信息学预测结果 |
| 2.双萤光素酶报告实验 |
| 3.RIP实验 |
| 四、CRKL、MIR-124-3P对 K562 细胞生物学行为的影响 |
| 1.CRKL上调促进K562细胞增殖能力 |
| 2.CRKL上调促进K562细胞迁移、侵袭能力 |
| 3.miR-124-3p上/下调抑制/促进K562细胞增殖能力 |
| 4.miR-124-3p上/下调抑制/促进 K562 细胞迁移、侵袭能力 |
| 五、MIR-124-3P靶向作用于CRKL调控K562 细胞生物学行为 |
| 六、CRKL/MIR-124-3P/LNCRNA119766 AXIS通过抑制PI3K/AKT通路调控K562细胞恶行行为 |
| 1.CRKL与 PI3K直接相互作用 |
| 2.CRKL/mi R-124-3p/Lnc RNA119766对PI3K/AKT通路分子表达的影响 |
| 3.阻断 PI3K/AKT 通路,对 CRKL/miR-124-3p/LncRNA119766 调控 K562 细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ceRNA 与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1. 1 材料和试剂 |
| 1. 2 主要仪器 |
| 1. 3 方法 |
| 1. 4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2. 1p ET32a-ABD、p ET32a-PTD、p ET32a-PTD-ABD、p ET32a-ABD-PTD表达载体构建成功 |
| 2. 2获得p ET32a-ABD、p ET32a-PTD、p ET32a-PTD-ABD可溶性融合蛋白 |
| 2. 3 Western blot及免疫荧光法检测融合蛋白的表达 |
| 2. 4p ET32a-PTD-ABD融合蛋白对K562、HL60 细胞增殖的影响 |
| 2. 5 p ET32a-PTD-ABD融合蛋白能够促进HL60 细胞的凋亡 |
| 3 讨论 |
（4）腺病毒介导的SH2-DED融合肽抑制CML细胞增殖和诱导凋亡的效应研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 重组腺病毒 Ad5F35-SD-HA 及突变对照体 Ad5F35-SmD-HA 的构建、重组、包装、鉴定及其感染活性验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组腺病毒 Ad5F35-SD-HA对 BCR-ABL 阳性 CML细胞的特异性抑增殖和促凋亡的效应观察 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 重组腺病毒 Ad5F35-SD-HA对BCR-ABL 阳性 CML细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本课题的创新之处 |
| 本课题的不足之处与后续研究 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的研究成果及发表学术论文目录 |
（5）Grb2的RNA干扰对K562细胞侵袭和迁移能力的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分针对Grb2 的RNA 干扰原核表达载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分Grb2 表达受抑制的K562 细胞克隆的筛选与鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分Grb2 的抑制对K562 细胞侵袭和迁移能力的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（6）ABD蛋白的表达及对K562，HL60细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 PET32A-ABD、PET32A-PTD、PET32A-PTD-ABD、PET32A-ABD-PTD 表达载体的构建和鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 主要溶液及其配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 表达质粒pET32a-ABD 的构建 |
| 2.2 表达质粒pET32a-PTD 的构建 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ABD 的扩增 |
| 3.2 表达质粒pET32a-ABD 的构建 |
| 3.3 表达质粒pET32a-PTD 的构建 |
| 3.4 重组质粒pET32a- PTD-ABD 和pET32a - ABD - PTD 的构建 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PET32A-ABD、PET32A-PTD、PET32A-PTD-ABD、PET32A-ABD-PTD 融合表达质粒的蛋白表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 主要溶液及其配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 pET32a-PTD ，pET32a-ABD，pET32a-PTD-ABD 和pET32a-ABD-PTD 融合蛋白的原核表达和纯化 |
| 2.2 蛋白质定量分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 pET32a-ABD、pET32a-PTD、pET32a-PTD-ABD、pET32a-ABD-PTD 融合蛋白的原核表达和纯化 |
| 3.2 纯化蛋白pET32a-ABD、pET32a-PTD、pET32a-PTD-ABD 的定量分析 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 PET32A-PTD、PET32A-PTD-ABD 融合蛋白跨膜转运的检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 主要溶液及其配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 Western blotting |
| 2.3 直接免疫荧光检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Western blotting |
| 3.2 直接免疫荧光检测 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 PET32A-PTD-ABD 融合蛋白对K562,HL60 细胞的功能研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要药品试剂 |
| 1.3 主要溶液及其配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 pET32a-PTD-ABD 融合蛋白对K562,HL60 细胞的影响测定 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 pET32a-PTD-ABD 融合蛋白对K562,HL60 细胞生长曲线的影响 |
| 3.2 pET32a-PTD-ABD 融合蛋白对K562,HL60 细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）以Src家族同源结构域为抗肿瘤治疗靶位点的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 国内外研究回顾 |
| 第一部分 氨酸激酶与恶性肿瘤 |
| 第二部分 Src家族同源结构域相关研究进展 |
| 第三部分 PTD融合蛋白研究进展 |
| 小结 |
| 正文 |
| 实验材料 |
| 实验一：PTD-BCR/ABL SH3 融合蛋白动物实验 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 实验二：G162 SH2 结构域的基因克隆和序列分析 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验三：G162 SH2 结构域的表达载体构建和蛋白表达、纯化 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验四：His-PTD-G162-SH2 融合蛋白体外功能实验 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）Grb2抑制剂peptidimer-c抗K562细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Grb2 抑制剂Peptidimer-c 的设计、合成和鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 Peptidimer-c 对K562 生长增殖的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 Peptidimer-c 诱导K562 细胞凋亡 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 Peptidimer-c 对K562 细胞周期的改变 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 Peptidimer-c 对K562 细胞基因表达谱的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献(一) |
| 综述 |
| 参考文献(二) |
| 在学期间从事的科研工作 |
| 致谢 |
（9）OD蛋白的表达及对K562细胞的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验内容 |
| 第一部分 材料与方法 |
| 第二部分 试验研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）1. 慢性粒细胞性白血病融合基因bcr/abl第一外显子条件性基因打靶的实验研究 2. RNA干扰在哺乳动物细胞中的初步应用性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略语表 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 试剂与材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 试剂与材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| BCR/ABL在白血病发生发展中的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白在K562细胞内的含量变化（论文参考文献）
- [1]慢性髓细胞白血病中ABL1激酶通过磷酸化抑癌因子Smad4以抑制TGF-β信号通路的研究[D]. 王丽静. 浙江大学, 2021(01)
- [2]LncRNA119766-miR-124-3p-CRKL axis通过PI3K/AKT通路调控K562细胞恶性行为[D]. 王金霞. 大连医科大学, 2020(02)
- [3]PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响[J]. 康志杰,闫金松,崔嵩,李国辉,黄斯勇,梁亮,尹郸丹,梁英民. 第三军医大学学报, 2014(05)
- [4]腺病毒介导的SH2-DED融合肽抑制CML细胞增殖和诱导凋亡的效应研究[D]. 彭智. 重庆医科大学, 2011(11)
- [5]Grb2的RNA干扰对K562细胞侵袭和迁移能力的影响[D]. 姚娜. 福建医科大学, 2009(10)
- [6]ABD蛋白的表达及对K562，HL60细胞的作用研究[D]. 康志杰. 第四军医大学, 2008(04)
- [7]以Src家族同源结构域为抗肿瘤治疗靶位点的研究[D]. 阴继凯. 第四军医大学, 2007(04)
- [8]Grb2抑制剂peptidimer-c抗K562细胞的实验研究[D]. 叶韵斌. 福建医科大学, 2007(01)
- [9]OD蛋白的表达及对K562细胞的作用[D]. 叶盛开. 第四军医大学, 2005(06)
- [10]1. 慢性粒细胞性白血病融合基因bcr/abl第一外显子条件性基因打靶的实验研究 2. RNA干扰在哺乳动物细胞中的初步应用性研究[D]. 杨帆. 中国协和医科大学, 2004(11)