一、猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定(论文文献综述)
滑坷鑫[1](2021)在《抵抗素和p38 MAPK/Wnt信号通路介导副猪嗜血杆菌感染引起细胞损伤的机制研究》文中研究说明副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS),可以引起仔猪严重的全身性炎症反应,导致大量仔猪的发病和死亡,给全球生猪养殖业带来重大的经济损失。由HPS感染所引起的格拉泽氏病(Gl(?)sser’s disease)的特征性症状为全身性的急性渗出性纤维素炎。目前,尚未有研究报道HPS引起渗出性纤维素炎的具体分子机制。本研究分析了HPS诱导猪肺泡巨噬细胞3D4/21中抵抗素(Resistin)表达和分泌的机制,以及Resistin对原代猪血管内皮细胞(Porcine vascular endothelial cell,PVEC)间紧密连接结构的调控,以探究HPS破坏内皮细胞结构、引起渗出性炎症发生的机制;本研究同时探索了HPS引起新生猪气管上皮细胞NPTr和猪肾上皮细胞PK-15中上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)效应的发生和调控机制,解析HPS破坏上皮细胞结构,引起全身性感染的病理机制。具体内容如下:1.HPS诱导3D4/21细胞分泌的Resistin破坏内皮细胞PVEC间紧密连接结构本研究发现HPS可以诱导3D4/21细胞表达和分泌Resistin,且Resistin的表达和分泌受到转录因子Ets2的调控。进一步检测发现,HPS感染3D4/21细胞后激活p38 MAPK通路,该通路通过调控Ets2基因的表达,介导Resistin的表达和分泌。通过跨内皮电阻测定实验发现,3D4/21细胞缺失Resistin后,明显抑制HPS引起的体外共培养体系中PVEC通透性的升高,这表明HPS感染时,3D4/21细胞分泌的Resistin增加了PVEC通透性。进一步研究发现,Resistin通过LKB1/AMPK/mTOR通路抑制PVEC中紧密连接结构蛋白Claudin-5和Occludin的表达,从而增加PVEC的通透性。2.HPS中外膜脂蛋白LPPA参与调控Resistin的分泌和PVEC间紧密连接结构的破坏通过跨内皮电阻测定实验发现,HPS强毒株与弱毒株感染3D4/21细胞后,Resistin的表达水平和体外共培养体系中PVEC的通透性均存在显着差异。通过比较强弱毒株间的基因分布差异,筛选出32个显着分布于HPS强毒株中的基因,分别针对这些基因构建单基因缺失株,发现HPS强毒株在缺失细菌外膜脂蛋白基因lppA时,可以显着回复3D4/21细胞中Resistin的表达水平,以及PVEC中Claudin-5和Occludin的表达水平。通过基因缺失突变株ΔlppA及其互补菌株C-lppA与野生型HPS-SH0165的比较发现,HPS的外膜脂蛋白LPPA通过p38 MAPK/Ets2通路调控了3D4/21细胞中Resistin表达和分泌。同时,HPS的外膜脂蛋白LPPA通过改变LKB1/AMPK/mTOR通路的活性,调控PVEC中Claudin-5和Occludin的表达以及PVEC的通透性。3.HPS通过p38 MAPK通路调控Wnt/β-catenin通路介导的上皮细胞EMT效应本研究从细胞形态和分子水平证明了HPS促使PK-15和NPTr细胞发生EMT效应。而在抑制Wnt/β-catenin通路激活或干扰通路下游靶基因MMP7、COX2和PAI-1的表达后,PK-15和NPTr细胞中HPS诱发的EMT效应减弱。这表明Wnt/β-catenin通路通过调控下游靶基因的表达,启动了上皮细胞的EMT效应。通过进一步的通路抑制实验发现,在抑制p38 MAPK通路活性后,可以抑制PK-15和NPTr细胞中HPS对Wnt/β-catenin通路的激活。而在PK-15和NPTr细胞缺失Wnt/β-catenin通路天然抑制子DKK1基因时,p38 MAPK失去了对Wnt/β-catenin通路的调控作用。这表明在PK-15和NPTr细胞中,HPS通过p38 MAPK/DKK1通路调节Wnt/β-catenin通路的活性。相应的,在HPS感染的PK-15和NPTr细胞中,抑制p38 MAPK通路活性后,Wnt/β-catenin通路所介导的EMT效应也明显减弱。表明p38 MAPK通路参与调控HPS感染时Wnt/β-catenin通路介导的EMT效应。本研究首次证明HPS通过诱导猪肺泡巨噬细胞分泌的Resistin,破坏内皮细胞中的紧密连接结构,增加内皮细胞通透性。同时通过p38 MAPK和Wnt/β-catenin通路促使上皮细胞发生EMT效应,增加上皮细胞移动性。HPS对内皮细胞的损伤可能促进了渗出性炎症的发生,而对上皮细胞的破坏可能有助于HPS在动物机体内的扩散。综上,本研究为解析HPS感染引起渗出性纤维素炎的致病机理提供了初步的理论基础。
张珊珊[2](2021)在《视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究》文中研究表明血管生成是通过已有的血管发芽而形成新血管的过程,胚胎发育完成后生理性与病理性血管均通过此过程产生。生理性的血管生成对损伤修复、组织的生长和再生都十分关键,而生理性血管的异常生成和病理性血管的形成往往与许多疾病的发生有关。视网膜血管作为视网膜中氧气和营养供应的通道,其异常发育会诱发许多眼病,如家族性渗出性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等。目前对于这些疾病仍缺少有效的诊疗方法,寻找影响血管生成的基因,明确生理性血管发育与病理性血管生成的机制,对于这些疾病的诊疗具有重要意义。本论文研究了三个基因在视网膜血管生成中的作用,并对其调控机制进行了研究,为血管性眼病的治疗提供了参考。论文的主要内容如下:1.首次就TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其机制进行了研究。研究发现,人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常。另外,在小鼠血管内皮细胞中特异性敲除Tmem30a导致视网膜表层血管发育迟缓、密度降低,血管末端膨大,顶端内皮细胞的数量减少,丝状伪足数目降低;在小鼠全身敲除Tmem30a还会导致血管壁的完整性遭到破坏。而在小鼠视网膜血管发育完成后敲除Tmem30a不会影响血管网络的维持。在转录水平进行分析发现在敲减TMEM30A的人视网膜血管内皮细胞与全身敲除Tmem30a小鼠的肺组织中与细胞周期有关的基因表达量减少;同时蛋白质免疫印迹分析发现其中涉及VEGF信号传导的相关蛋白质的磷酸化水平也明显降低。以上结果表明,Tmem30a在血管生成和维持血管屏障的完整性中发挥了作用,其通过调节VEGF的信号传导来控制血管生成。2.研究了TWIST1基因在视网膜病理性血管生成中的作用。研究发现在血管内皮细胞条件性过表达Twist1的小鼠中出现了视网膜表层血管发育迟缓、前端异常增生和局部渗漏的表型。免疫荧光染色发现该小鼠血管内皮细胞增殖速度显着加快,小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白表达增多,血管内皮生长因子分泌异常。而血管内皮细胞核染色显示血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠血管内皮细胞核多为椭圆形,且不指向无血管区。该结果说明Twist1过表达导致星形胶质细胞的异常激活,其分泌的血管内皮生长因子随之升高,进一步导致了血管的异常增生,同时Twist1过表达后引起的血管内皮细胞极性的丧失会导致血管发育迟缓。而在小鼠视网膜血管发育完成后过表达Twist1不会影响血管网络的维持。另外,全身过表达Twist1后,小鼠眼球变小,视网膜表层血管发育迟缓、密度下降、局部渗漏,与在血管内皮细胞过表达Twist1的表型不同,说明Twist1在其他细胞中同样发挥作用。体外荧光素酶实验发现过表达TWIST1导致Norrin/β-catenin信号通路活性增强。以上结果表明TWIST1可能通过异常激活Norrin/β-catenin信号通路导致视网膜病理性新生血管的生成。3.鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1,并对其致病机制进行了研究,首次将DLG1与FEVR相关联,进一步明确了DLG1影响血管生成的作用机制。研究表明DLG1的错义突变S598G使DLG1无法正常激活β-catenin信号的传导,血管形成实验表明敲减DLG1影响了人视网膜血管内皮细胞的管腔形成,蛋白免疫印迹实验证明了DLG1缺失后VEGFR2蛋白磷酸化水平降低。综上,本研究阐明了TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其分子机制,证实了TWIST1在病理性血管生成中的作用,鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1。为血管性眼病及其他病理性血管生成疾病的治疗提供了新的药物治疗靶点。
陈林军[3](2019)在《Waardenburg综合征模型猪的血管纹发育及转录组学分析》文中研究指明Waardenburg综合征2A型是一种常见的遗传性耳聋,主要是由Mitf基因突变造成神经嵴细胞来源的黑色素细胞发育不良、黑色素合成减少引起,表现为全身性的色素沉积不足,其中由于内耳血管纹黑色素细胞源性的中间细胞(intermediate cells)缺失导致耳蜗内淋巴电位消失,并继发广泛的毛细胞损伤,最终表现为重度感音神经性耳聋。Mitf-M基因自发突变的模型猪与人类Waardenburg综合征2A型表型一致,即色素缺失、听觉功能和内耳形态学与电生理学缺陷,其耳蜗发育与听觉形成过程相较于小鼠模型更接近人类。本研究基于该模型开展耳蜗血管纹的形态学和分子生物学分析,为血管纹发育及损伤相关疾病的致病机理和干预途径提供参考。血管纹是由边缘细胞、中间细胞、基底细胞和毛细血管网等组成的高度血管化组织,在维持耳蜗内电位、离子转运循环中发挥着重要作用,既往研究主要认为Mitf具有支持中间细胞的存活、维持血管纹结构完整的功能,但对于Mitf作为转录因子如何涉及血管纹功能和听觉形成尚未深入的研究,因此本研究利用RNA-Seq测序方法、免疫荧光技术及电镜等技术,分析Mitf基因参与的生物学过程、通路及在形成血管纹组织中发挥的作用。目前广泛应用于遗传性耳聋研究的动物模型主要是小鼠,其中MfM敲除小鼠也出现类似人类Waardenburg综合征2A型的表型,但考虑到小鼠和人类在进化关系、听觉发育及能量代谢等方面存在的差异,同时受限于正常人及患者的耳蜗难以用于医学研究,因此很难比较Mitf-M突变在小鼠和人耳蜗血管纹之间调控的具体差异,但猪较小鼠与人类物种相比,听觉发育规律及听觉器官形态和结构更相近,同时已建立成熟的内耳组织取材技术,因此我们利用Mitf-M突变猪(和突变小鼠)与正常对照猪(和小鼠)的耳蜗血管纹转录组数据进行对比,分析Mitf-M突变在两物种耳蜗血管纹之间的调控的差异及比较两物种耳蜗血管纹组织之间的物种特异性。第一部分.:为了研究Mitf基因在血管纹组织参与的生物学过程和调控通路,我们利用RNA-seq 比较Mitf-M基因突变荣昌猪(Mitf/-)及正常型荣昌猪(Mitf+/+)耳蜗血管纹组织的基因转录组,共得到差异表达基因113个,其中59个表达下调,54个表达上调。通过基因功能分类富集分析发现,差异基因最主要富集在黑色素分泌、离子转运、PI3K-AKT信号通路和细胞-基质粘附等功能分类。其中离子转运相关差异基因表明Mitf在血管纹中广泛参与了离子通道相关的功能调控,提示Mtf与血管纹的泌钾功能形成密切相关;PI3K-AKT信号通路相关基因的差异表达可能由于Mitf的缺失导致PI3K-AKT信号通路的激活,从而抑制黑色素代谢通路,导致黑色素相关蛋白的低表达,这些发现为研究MitfM对内耳发育的影响及治疗Waardenburg综合征提供了新的线索。第二部分:为了研究Mitf基因对血管纹发育和结构形成的作用,对出生早期多个发育阶段的正常对照猪和Mitf突变型猪的耳蜗血管纹进行形态学分析,来探讨Mitf基因缺失对血管纹关键结构的影响。结果表明:1.Mitf突变猪血管纹毛细血管密度在出生后7d、10d及30d没有明显变化,血管纹毛细血管密度维持在6个/80μm,但在40d后突变猪的血管纹毛细血管密度为2.6个/80μm,较正常对照猪5.3个/80μm明显减少。因此Mtf基因突变并不会影响出生早期30d之前血管纹血管网络发育。2.透射电镜分析显示突变猪在1d、10d均未表现出细胞形态与结构的变化,而血管纹铺片分析表明突变猪出生后7d和40d血管纹边缘细胞数均在25个/400μm2左右,与正常对照猪没有明显差异,表明在出生后40d前Mitf基因突变并不会导致血管纹细胞连接的破坏,同时并不影响血管纹边缘细胞数。3.血管纹巨噬细胞的荧光标记结果表明,突变猪与正常对照猪并无显着差异,说明在出生后40d前,Mtf基因突变不会导致血管纹巨噬细胞的病变。4.对血管纹黑色素细胞标记基因Dct的荧光染色结果表明,Dct阳性细胞在突变血管纹中几乎完全缺失,证实Mi矿基因突变缺失对血管纹中间细胞的显着影响。第三部分:利用MitfM突变荣昌猪(和突变小鼠)与正常对照猪(和正常小鼠)的耳蜗血管纹转录组数据,比较Mitf-M突变在小鼠和荣昌猪耳蜗血管纹之间表达的差异。取MitfM突变小鼠与正常小鼠和MitfM突变与正常荣昌猪耳蜗血管纹的共有差异基因做GO分析,发现其主要集中在酪氨酸代谢、黑色素形成和离子转运等生物学过程。在猪和小鼠中分别有99和177个基因表现出物种特异性的变化,说明Mitf作为转录因子具有目标基因识别的物种特异性。此外,血管纹标志结构相关基因也存在较大程度的物种特异性。紧密连接相关基因在猪中表达较高的是Cadm1、Cldn11、Pcdh1、Pcdh19、Cdh24 等;而在小鼠中表达较高的是 Ncam、Cldn6、Cldn9、Cldn14等。类似的是血管相关基因在两物种血管纹中差异也较大,在猪中表达较高的是Col2a1、Col3a1、Coll1a1、Col11a2 等;而在小鼠中表达较高的是Col8a2、Cd34、Ncam等。另外负责离子通道相关基因在两者间也存在明显的差异,Mitf突变之后在两物种中共同影响的是Trpm1、Kcnj13、Slc45a2;在猪中表达较高的是kcnn1、Clcn2、Trpm4等;在小鼠中表达较高的是Trprn7、Kcnq1、Kcnj8等。上述结果表明猪和小鼠的血管纹功能和结构虽然较为相似,但在功能实现和结构发育方面采取了不同的关键基因,提示在模式动物和人类之间也可能存在较大的基因表达和功能差异。结论:MitfM基因突变及正常型荣昌猪的耳蜗血管纹组织的差异基因最主要富集在黑色素分泌、离子转运和PI3K-AKT信号通路、细胞-基质粘附等功能分类。提示Mitf与血管纹的泌钾功能形成及PI3K-AKT信号通路密切相关。Mitf--M突变在出生30d前不会导致血管纹巨噬细胞、紧密连接、毛细血管网等血管纹主要结构破坏,但出现会出现标记黑色素细胞的蛋白表达减少。Mitf-M突变小鼠与正常小鼠和MitfM突变与正常荣昌猪耳蜗血管纹的共有差异基因主要集中在酪氨酸代谢、黑色素形成和离子转运生物学过程。表明猪和小鼠的血管纹功能和结构虽较为相似,但在调控离子功能和结构发育方面采用了不同的关键基因,这也提示了模式动物和人类之间也可能存在较大的基因表达和调控的差异,因此选择与人类进化关系较近的模式动物可能是研究血管纹相关疾病更适宜的模型。
魏雪栋[4](2018)在《HLA-Ⅰ类抗体通过活化动脉血管内皮细胞定向诱导人外周血来源单核细胞向M2a/c样巨噬细胞分化的分子和信号机制》文中认为研究背景术后新生抗供者HLA特异性抗体(donor specific anti-HLA antibody,HLA DSA)介导的体液排斥反应(antibody-mediated rejection,ABMR)是导致移植肾远期失功的最主要原因,但机制尚未完全明确,临床上也缺乏有效的治疗手段。早期研究认为,激活补体系统是HLA抗体介导ABMR损伤的主要致病机制。但随着临床上C4d-ABMR的“出现”和逐渐被认识,以及HLA抗体生物学功能相关研究的不断深入,人们发现HLA抗体可能通过多种途径介导ABMR损伤。本研究小组和其他文献报道,除激活补体系统外,这些途径主要还包括刺激并活化移植物内血管内皮细胞(endothelial cell,EC),促使其增殖和抗凋亡从而引起微血管损伤,以及通过活化EC诱导其表面P-selectin表达和ICAM-1聚集促进移植物内单核细胞招募和浸润等。其中EC活化已被Banff 2013列为诊断C4d-ABMR的必须条件。移植肾内的单核/巨噬细胞浸润现象以及其与器官纤维化和不良结局之间的相关性也被越来越多的文献报道。此外,在HLA DSA阳性患者的移植肾穿刺标本中还发现巨噬细胞相关基因表达显着升高。后续临床研究发现,这些移植肾内浸润,与器官纤维化和远期失功密切相关的巨噬细胞主要表现为M2表型。这说明M2型巨噬细胞可能是另一个HLA抗体介导ABMR损伤的重要参与者。尽管如此,HLA DSA以及其活化后的EC是否与这种M2型巨噬细胞的形成有关,目前尚无报道。巨噬细胞是一群异质性大,可塑性极强的细胞群体。按表型和功能以及“Th1”和“Th2”免疫应答的概念主要分为“经典活化”M1和“选择性活化”M2型。前者主要表现为促炎性特点,在急性炎症或炎症早期发挥病原吞噬和清除作用,同时通过释放细胞毒性物质和炎性细胞因子引起组织损伤和扩大炎症反应。后者主要表现为抗炎性特质,通过分泌抗炎性介质在慢性炎症或炎症晚期发挥炎症控制、组织修复和重建作用。根据表型和功能不同,M2型又被分为M2a、M2b、M2c三个亚型。虽然M2型巨噬细胞,尤其M2a和M2c,具有组织修复功能,但过度活化会导致组织纤维化和器官功能障碍。传统观点认为,单核细胞向巨噬细胞的分化起始于离开外周血进入组织后的阶段,而近年来转录子学研究发现这种分化在单核细胞与血管内皮的粘附和向外周组织的浸润阶段就已经开始。那么,HLA DSA在通过活化EC促进移植肾内单核细胞招募和浸润的过程中,是否同时对后者的分化具有诱导作用从而使之参与ABMR损伤呢?国内外目前尚无报道。本研究旨在探索HLA DSA是否和如何通过活化EC诱导人外周血单核细胞定向分化的,这对进一步了解HLA抗体在介导ABMR中的作用机制和寻找有效、可行的治疗手段具有实际应用意义。第一部分:HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC对人外周血单核细胞表型分化的影响和分子机制目的:探索HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC是否影响人外周血单核细的表型分化,以及其中的分子机制。方法:构建体外EC-单核细胞共培养体系。将新鲜分离的健康志愿者外周血单核细胞与HLA-Ⅰ类完整抗体(HLA-Ⅰ Ab)活化后的EC在共培养体系中培养5天。5天后收集共培养体系下室细胞,流式细胞术检测表面标志表达。同时以IFN-γ、IL-4、h Ig G+LPS、IL-10和IL-4+GM-CSF+LPS为刺激剂建立体外巨噬细胞(M1、M2a、M2b、M2c)和成熟树突状细胞(m DC)阳性对照。比对分析共培养体系下室细胞与各阳性对照组细胞的表面标志表达情况,确定共培养后所得细胞的种类和亚型。利用Luminex Multiplex assays检测共培养第2天上清中的细胞因子表达,探索诱导单核细胞分化的驱动因素。利用Ides酶切制作HLA-Ⅰ F(ab’)2抗体,通过比较HLA-Ⅰ F(ab’)2和HLA-Ⅰ Ab活化后的EC所诱导的巨噬细胞表面标志的差异分析HLA-Ⅰ Ab的Fc段在诱导单核细胞向巨噬细胞分化过程中的作用。利用PSGL-1融合蛋白(r PSGL-1-Ig)和抗ICAM-1抗体(anti-ICAM-1 Ab)阻断HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC表面表达的P-selectin和ICAM-1,观察后两者在单核细胞向巨噬细胞分化过程中的作用。同时观察,HLA-Ⅰ Ab的Fc段和活化后EC表面的P-selectin和ICAM-1对单核细胞迁移能力的影响。结果:利用3μm孔径小室构建的Transwell体外共培养体系符合实验设计要求,共培养5天后下室细胞均为单核细胞来源。各阳性对照组表型和细胞因子分泌特征符合文献报道。与单独培养的单核细胞相比,与未刺激的四种EC共培养后得到的下室细胞表面CD206(M2a标志)表达均明显增加(p均<0.05),提示未刺激EC诱导单核细胞分化为M2a样巨噬细胞。与HLA-Ⅰ Ab活化后的EC共培养可以使CD206的表达进一步增加(p<0.01),同时CD68(M2a、M2c共有标志)(p<0.05)和CD163(M2c标志)(p<0.05)表达也显着增加,提示HLA-Ⅰ Ab刺激可进一步诱导单核细胞分化为M2a/c样巨噬细胞。但与未刺激EC相比,HLA-Ⅰ Ab刺激2天后的EC培养上清中细胞因子并无显着增加(p均>0.05),提示HLA-Ⅰ Ab并非是通过刺激EC表达细胞因子从而诱导单核细胞极化的。然而,酶切Fc断后发现(利用HLA-Ⅰ F(ab’)2刺激EC),CD163的表达显着下降(p>0.05),而CD206却无显着变化(p<0.01),说明CD163的表达,即M2c表型,依赖于HLA-Ⅰ Ab的Fc段作用。此外,阻断P-selectin和ICAM-1均能完全抑制HLA-Ⅰ Ab和HLA-Ⅰ F(ab’)2增加的CD206表达(p均<0.05),同时也能抑制HLA-Ⅰ Ab增加的CD163表达(p均<0.05),提示CD206的表达,即M2a表型,依赖于活化后EC表面表达的P-selectin和ICAM-1,同时说明CD163的表达依赖于CD206,即M2c表型是在M2a表型的基础上出现的。迁移实验结果显示,和未刺激EC共培养的单核细胞相比,HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC可以显着增加单核细胞的迁移能力(p均<0.05),但这种效应可以完全被r PSGL-1-Ig和anti-ICAM-1 Ab阻断(p均<0.01),提示经HLA-Ⅰ类抗体活化的EC所表达的P-selectin和ICAM-1不仅参与了单核细胞的粘附和迁移,同时还参与了后者分化的启动过程。结论:EC诱导人外周血单核细胞向M2a样巨噬细胞分化。HLA-Ⅰ Ab增强并促进EC诱导的巨噬细胞进一步向M2a/c样亚型分化。这种作用依赖于活化后EC表面P-selectin和ICAM-1的表达(M2a表型),以及HLA-Ⅰ Ab自身的Fc段(M2c表型),而非活化后EC分泌的细胞因子。P-selectin和ICAM-1阻断剂,以及Fc的酶切制剂可能成为有效干预HLA抗体介导的ABMR的重要手段。第二部分:HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC所诱导的巨噬细胞的功能鉴定目的:通过分析细胞因子分泌特点和内源性免疫功能相关基因的表达特征对HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC所诱导的巨噬细胞进行功能鉴定。方法:采用Luminex Multiplex assays检测未刺激和HLA-Ⅰ类抗体刺激后的EC与单核细胞共培养第4天上清中的细胞因子表达水平。收集共培养第5天下室内已分化的巨噬细胞,并通过nano String技术检测胞内579个免疫功能相关基因的表达情况。从细胞因子和基因表达水平分析HLA-Ⅰ类抗体所诱导形成的巨噬细胞的功能和特点,并通过与各阳性对照组的比对确定其是否与第一部分中的表型相符。结果:与未刺激的共培养上清相比,HLA-Ⅰ Ab刺激后的共培养上清中IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1表达水平显着增高(p值依次为<0.05、<0.001、<0.01和<0.01)。GRO、MIP-1b、Eotaxin和MDC也有所升高,但差异不具有统计学意义(p均>0.05)。其中,MDC、MIP-1b以及MCP-1和M2a、M2c阳性对照组中的表达趋势相符。IL-6被报道具有促进巨噬细胞向M2型极化的功能,而IL-10则是M2型巨噬细胞的细胞因子标志之一。尽管如此,这些细胞因子的表达在HLA-Ⅰ Ab和HLA-Ⅰ F(ab’)2刺激的共培养上清中未见明显差异(p均>0.05)。这提示,HLA-Ⅰ类抗体刺激诱导分化的巨噬细胞具有M2型细胞因子分泌特征,但在此水平尚无法区分HLA-Ⅰ Ab和HLA-Ⅰ F(ab’)2所诱导形成的巨噬细胞的功能差异。基因水平结果显示,HLA-Ⅰ类抗体刺激使与EC共培养后获得的巨噬细胞胞内61个免疫功能相关基因出现了差异表达(筛选标准,p<0.01,fold change>1.5)。从功能上看,HLA-Ⅰ Ab刺激诱导后表达上调的基因中大部分为M2型相关基因,如C1QA、C1QB、CD59、SERPING1、CD209、CR1、EGR1、JAK3、NFKBIA、S1PR1、TNFAIP3、CCL24、HAMP、HFE和TFRC等。下调基因中以M1型相关基因为主,如C3、CLEC5A和KLRC4。这说明,HLA-Ⅰ Ab刺激诱导形成的巨噬细胞主要具有M2型的基因表达特征。此外,多个粘附分子(ICAM-1、ICAM-4、SELPLG)、协同共刺激分子(CD274、CD40、CD80、CD83)和吞噬相关基因(CD209、CR1、MRC1)表达也明显增高,提示巨噬细胞的活化和抗原提成能力增强。相比而言,这些上调基因在HLA-Ⅰ F(ab’)2刺激下诱导分化成的巨噬细胞中表达量相对较低。值得注意的是,数个M1型相关基因在HLA-Ⅰ Ab刺激诱导后也出现了表达上调,如C2、PTGS2、SOCS3、CCL3、CCL4、CCRL2、IL1A和CXCL1,而这些基因在HLA-Ⅰ F(ab’)2刺激诱导的巨噬细胞中表达相对较低,部分如PTGS2、CCL3、CCL4和CXCL1甚至出现了下降。这说明,HLA-Ⅰ Ab刺激诱导分化形成的巨噬细胞还具有部分促炎性特性。通过与阳性对照比对发现,HLA-Ⅰ Ab刺激诱导形成的巨噬细胞的基因表达特征主要与M2a和M2c巨噬细胞相符,部分与M2b相符。结论:HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC诱导的巨噬细胞的细胞因子分泌符合M2型特征。HLA-Ⅰ Ab刺激诱导下分化成的M2a/c样巨噬细胞具有典型的M2a和M2c巨噬细胞基因表达特征,功能上具有抗炎-促炎的“双面性”。相比而言,切除Fc段后的HLA-Ⅰ F(ab’)2抗体所诱导的M2a样巨噬细胞主要表现为M2a型基因表达特征,且强度较HLA-Ⅰ Ab刺激诱导的巨噬细胞明显减弱。这提示HLA-Ⅰ Ab较HLA-Ⅰ F(ab’)2而言具有更强的致病性,利用生物酶类切除抗体Fc段可能成为临床治疗ABMR的潜在手段之一。第三部分:HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC诱导人外周血单核细胞定向分化的胞内触发信号转导机制目的:探索HLA-Ⅰ类抗体通过活化EC诱导单核细胞向巨噬细胞定向分化的单核细胞胞内触发信号转导机制。方法:通过流式细胞检测技术检测与未刺激或HLA-Ⅰ类抗体刺激后的EC共培养的单核细胞胞内p AktT308和p ERK1/2T202/Y204的磷酸化水平变化,分析HLA-Ⅰ类抗体及活化后的EC对单核细胞胞内信号的触发作用。利用r PSGL-1-Ig和anti-ICAM-1 Ab分别阻断EC侧P-selectin和ICAM-1分子,以及用PSGL-1抗体(anti-PSGL-1 Ab)和CD18、CD11a、CD11b抗体阻断单核细胞侧PSGL-1和ICAM-1受体(LFA-1或Mac-1),明确P-selectin/PSGL-1、ICAM-1/LFA-1或Mac-1是否通过触发前述信号诱导单核细胞定向分化。并通过利用CD16、CD32和CD64抗体阻断单核细胞表面Fcγ受体(Fcγreceptors,FcγR),明确HLA-Ⅰ Ab的Fc段在诱发单核细胞分化过程中所结合的FcγR种类。结果:与HLA-Ⅰ Ab或HLA-Ⅰ F(ab’)2刺激后的EC共培养的单核细胞其胞内p ERK1/2T202/Y204高磷酸化水平的细胞比例均显着高于未刺激阴性对照(p依次<0.01和<0.05),但HLA-Ⅰ F(ab’)2刺激组的增加幅度显着低于HLA-Ⅰ Ab刺激组(p<0.05),提示HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC,以及抗体Fc段均能触发单核细胞胞内ERK磷酸化信号。相反,HLA-Ⅰ Ab刺激后胞内p AktT308高磷酸化水平的单核细胞比例显着下降(p<0.0001),而HLA-Ⅰ F(ab’)2刺激组未见显着变化(p>0.05)。在共培养体系中,MEK抑制剂U0126可以完全抑制HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC诱导的单核细胞表型变化,提示HLA-Ⅰ类抗体主要通过触发单核细胞胞内ERK信号诱导其定向分化。阻断EC侧P-selectin和ICAM-1可以完全抑制HLA-Ⅰ F(ab’)2(p分别<0.001和<0.05)和部分抑制HLA-Ⅰ Ab触发的单核细胞胞内ERK磷酸化(p分别<0.0001和<0.001)。而阻断单核细胞侧PSGL-1,以及CD18或CD11a可以观察到相同的结果(p均<0.05),提示HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC表面的P-selectin和ICAM-1与单核细胞侧相应受体结合后是通过活化ERK途径进行分化信号转导的,并进一步验证了前述结果。同时也说明,在此过程中单核细胞表面的LFA-1是EC侧ICAM-1的主要受体。此外,阻断单核细胞表面CD64分子可以明显抑制HLA-Ⅰ Ab Fc段所诱发的ERK磷酸化(p<0.05),而当同时阻断CD64和CD32后磷酸化被完全抑制(p<0.01),提示在此过程中HLA-Ⅰ Ab Fc段主要通过与单核细胞表面的FcγR I,部分与FcγR II结合发挥作用。结论:HLA-Ⅰ类抗体通过活化EC所诱导的单核细胞定向分化依赖于后者胞内的ERK信号通路活化。活化后EC表面的P-selectin和ICAM-1分别主要通过与单核细胞表面的PSGL-1以及LFA-1结合向后者胞内转导激活信号。HLA-Ⅰ类抗体Fc段主要通过与单核细胞表面的FcγR I结合传递活化信号。MAP/ERK信号通路抑制剂可能成为预防或治疗HLA抗体介导的ABMR的新选择。
朱伟峰[5](2017)在《红斑丹毒丝菌GAPDH等分子致病作用研究及DNA聚合酶Ⅳ诊断标识验证》文中提出红斑丹毒丝菌是造成动物丹毒病和人类类丹毒病的病原体。所有动物丹毒病中猪丹毒的经济意义最大。目前研究认为红斑丹毒丝菌对血管内皮细胞的粘附是感染发病起始环节的关键,但是红斑丹毒丝菌的毒力因子和致病机制依然不很清楚。本研究比较系统地研究了红斑丹毒丝菌致病表型。研究了GAPDH等5个红斑丹毒丝菌表面蛋白的致病作用,评估了这5个蛋白作为保护性抗原的潜质。最后,我们建立和改进了区分红斑丹毒丝菌疫苗菌株和野生型菌株的方法。本研究结果表明:红斑丹毒丝菌可以粘附血管内皮细胞,且强毒菌株表现出更高的粘附活性。红斑丹毒丝菌不能直接损伤血管内皮细胞。红斑丹毒丝菌能够利用宿主的血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白,强毒菌株表现出更高的招募活性。红斑丹毒丝菌具有抵抗全血杀伤能力且强毒菌株表现出更强的抵抗能力。红斑丹毒丝菌强毒菌株的占优势的免疫反应是Th1型反应。本研究克隆、表达、纯化了5个红斑丹毒丝菌表面蛋白:Spa A、Cbp B、GAPDH、HP0728、HP1472。研究结果显示它们都定位于红斑丹毒丝菌菌体表面。我们的研究结果显示表面蛋白Spa A、Cbp B、GAPDH、HP1472可以在红斑丹毒丝菌粘附血管内皮细胞中发挥粘附素作用。Spa A、Cbp B、GAPDH、HP0728可以在红斑丹毒丝菌招募宿主血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白中发挥受体作用。本研究结果表明Spa A、Cbp B、GAPDH是红斑丹毒丝菌的保护性抗原,免疫HP0728和HP1472不能为小鼠提供保护力。GAPDH抗血清能够降低红斑丹毒丝菌粘附猪血管内皮细胞的能力,能够促进全血对红斑丹毒丝菌的杀伤能力,但是不能抑制红斑丹毒丝菌招募血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白。GAPDH抗血清能够结合猪链球菌菌体和多杀性巴氏杆菌菌体,但是免疫重组红斑丹毒丝菌GAPDH没有保护小鼠免受两种病原体的致死剂量感染。本研究修正了日本学者建立的基于SNP的区分红斑丹毒丝菌疫苗菌株和野生型菌株的PCR方法,基于DNA聚合酶IV的差异,建立了既能够鉴定红斑丹毒丝菌临床分离株又能够同时区分猪丹毒疫苗菌株和野生型菌株的双重PCR方法。总之,本研究首次明确红斑丹毒丝菌对猪血管内皮细胞的损伤是间接损伤并研究了几种可能的机制,首次测定红斑丹毒丝菌的免疫反应类型,报道红斑丹毒丝菌具有招募宿主血浆纤维蛋白溶解酶原的表型并发现了几个该过程中可能的受体,首次通过实验证实兼职蛋白在红斑丹毒丝菌感染中可能发挥作用,首次发现GAPDH是红斑丹毒丝菌的保护性抗原,建立能够鉴定猪丹毒临床分离株同时区分猪丹毒疫苗菌株和野生型菌株的双重PCR方法。
高卓[6](2014)在《GalTKO.hCD46.hTM转基因猪异种肺移植的初步研究及mfat-1转基因小鼠血清中miRNAs的表达分析》文中提出肺移植术是治疗各种晚期阻塞性、限制性、感染性肺部疾病和肺血管病等终末期肺病的有效方法。随着临床医学的发展以及免疫抑制剂的广泛利用,同种器官移植已获得显着成效。但器官资源缺乏严重阻碍其广泛应用,因而异种器官移植包括异种肺移植受到了高度重视。猪因其器官形状和大小适宜,易进行基因调控和控制病毒传播等因素成为异种移植的理想供体。然而,异种移植虽然可以有效解决器官来源的问题,但却也面临比同种异体移植更为复杂的免疫排斥反应,这一难题成为摆在研究者们面前的第一道屏障。异种移植免疫排斥反应中最先发生的也是需要首先解决的就是超急性免疫排斥反应,会导致移植物出血和血小板血栓形成,从而破坏内皮功能。它的发生是由于人体内预存的异种反应性天然抗体与异种器官血管内皮细胞表面的抗原结合,从而引发的补体系统链式激活所致。被天然抗体识别的异种抗原主要是Gala(1,3)Gal,也称Gal表位,其在α1,3-半乳糖苷转移酶(al,3galactosyltransferase, al,3-GT)作用下合成。因而从理论上我们需要从异种移植物抗原和补体方面考虑克服超急性免疫排斥反应的发生。我们的课题组建立了GalTKO.hCD46.hTM转基因猪模型,这一转基因猪敲除了α1,3-半乳糖苷转移酶基因,并通过进一步人源化修饰,转入人膜辅助调节蛋白(membrane cofactor protein, MCP/CD46)和在凝血机制中发挥重要作用的人血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM),使转基因猪的血管内皮细胞表面表达人源化的补体调节蛋白和血栓调节蛋白,从而抑制补体活化反应和凝血反应,进一步降低异种移植排斥反应。利用GalTKO.hCD46.hTM转基因猪模型,我们采用多种研究手段对异种肺移植进行了有效研究,包括离体肺灌注、检测人源化修饰基因在细胞水平的表达及功能、体外细胞灌流等,以验证这些表型的转入对异种移植肺在移植后抗器官损伤、抗免疫排斥反应以及抗凝血反应方面的作用。在离体肺灌注实验中,我们利用体外循环系统采用肝素化的新鲜人血对GalTKO.hCD46.hTM转基因猪(n=14)、野生型猪(n=16)、Ga1TKO转基因敲除猪(n=16)进行了异种灌注,对12只猪肺进行了自体血液灌注,并监测了灌注过程中的各项生理、血液和生化指标。结果显示,GalTKO.hCD46.hTM的转基因猪肺平均生存期为175分钟(生存期范围:15-240分钟),Ga1TKO猪肺为120分钟(生存期范围:15-240分钟,p=0.24),而野生型猪肺平均灌注存活时间仅为10分钟(p<0.001)。与GalTKO猪相比,GalTKO.hCD46.hTM异种灌注猪肺中的补体激活水平、血小板活化水平显着降低,在240分钟时,ΔC3a:238±22VS572±162, p=0.03; ACD62P:11.9±6VS25.4±7.4, p=0.03。 GalTKO.hCD46.hTM猪肺在抑制凝血级联活化反应和中性粒细胞封存等方面也显示出了明显的优势。此外通过免疫组化结果显示在灌注过程中,肺组织始终有血栓调节蛋白的表达。体外实验结果显示,Ga1TKO.hCD46.hTM的转基因猪的血管内皮细胞具有极高的hCD46及血栓调节蛋白表达率,且针对血栓调节蛋白的功能检测结果也显示,血管内皮细胞表达的血栓调节蛋白可以有效激活蛋白C,其所辅助活化的蛋白C含量是Ga1TKO组的14倍,是阳性对照组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的5.5倍。在体外细胞灌流过程中,Ga1TKO.hCD46.hTM组的内皮细胞发挥了良好的抗凝血功能,与Ga1TKO组相比,使血栓体积降低了84%(P=0.0001),使黏附和聚集率降低了58%和65%(P<0.001)。以上均说明我们对于转基因猪的人源化修饰是有效的,这些表型的转入对移植后抗器官损伤、抗免疫排斥反应以及抗凝血反应均产生了积极的作用。我们将进一步探讨不同表型转入对于异种移植物抗免疫排斥反应的影响,并通过药物干预等合理的方式对其进行进一步修饰与补充。研究证实,机体内多不饱和脂肪酸的含量与构成对癌细胞的分化、增殖和凋亡有着复杂而重要的作用,尤其是n-3多不饱和脂肪酸被认为在细胞的功能和分化中发挥功能,可起到降血脂、舒张血管、抑制过敏与炎症反应、抑癌及预防心血管疾病等作用,但其作用的分子机制尚不明确。microRNA (miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的小分子单链RNA,它由一段具有发夹结构的单链RNA前体经Drosha酶和Dicer酶的剪切后生成。miRNA通过与目标mRNA分子的3’端非编码区域(3’-UTR)互补配对,使目标mRNA分子的翻译受到抑制或引起特异性的针对mRNA分子的切割,从而在转录后水平对靶基因的表达进行调控。自在秀丽隐杆线虫中发现第一个miRNA以来,越来越多的miRNA在其他物种中被发现。保守估计miRNA调控着基因组中30%以上基因的表达。大量研究成果表明,miRNA参与着生物体中包括癌症的发生等基本生命过程的调控,在生命活动中起着非常重要的作用。miRNA在各种组织中的表达失调已经被证实与多种疾病相关,如癌症和糖尿病等。血清中的循环miRNA以其良好的个体间稳定性和重复性,被认为是各种癌症和其他疾病检测的潜在生物标志物。课题组建立了mfat-1转基因小鼠动物模型,特异性的表达来源于秀丽隐杆线虫的fat-1基因,这一基因编码n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,可以n-6多不饱和脂肪酸为底物,将其转换为n-3多不饱和脂肪酸。采用Solexa基因芯片测序的方法,我们分析了野生型小鼠与mfat-1转基因小鼠血清中miRNA的表达谱差异,并通过定量RT-PCR验证确认了12种miRNA在mfat-1转基因小鼠中高表达。针对这12种miRNA所调控的靶基因的进一步分析显示,其靶标基因均为癌症发生发展相关的多种信号通路中的关键基因,包括PI3K, MAPK, mTOR等多条信号通路,揭示了n-3多不饱和脂肪酸对于癌症发生发展的影响。
王建锋[7](2013)在《猪主动脉内皮细胞株的建立和鉴定》文中研究说明异种移植是解决临床器官供体短缺的重要思路。目前认为猪是异种移植较为合适的供体,而急性血管排斥反应是异种移植的主要障碍。异种移植物的血管内皮细胞是免疫排斥反应首先攻击的对象,内皮细胞损伤是介导和放大免疫排斥和凝血功能紊乱的关键环节。为研究异种移植中猪动脉内皮细胞损伤、活化机制以及在异种移植中的作用,为保护和延长异种移植物存活时间必需获得猪的动脉内皮细胞,而我国目前尚无成熟的猪动脉内皮细胞株,因此该实验通过胶原酶消化法获取了猪原代主动脉内皮细胞,用携带SV40LT基因的慢病毒转染猪原代主动脉内皮细胞,通过形态学、表面标志物、管状成形能力和免疫学功能对细胞株进行了鉴定,并与原代细胞进行比较,建立了可长期传代且表型稳定的猪主动脉内皮细胞株,该细胞株保持了原代细胞的基本特征,具备一般在体血管内皮细胞的绝大部分功能,为异种移植研究提供了细胞水平研究平台。目的建立猪主动脉内皮细胞株,为以猪为供体的异种移植研究提供必要的细胞水平研究平台。方法1.原代内皮细胞的提取和细胞株的建立:用胶原酶消化法分离猪主动脉内皮细胞,并用携带SV40LT基因的慢病毒转染原代细胞,建立细胞株。2.细胞基本特征鉴定:在形态学上,通过倒置显微镜和电子显微镜分别观察了原代细胞和细胞株的大体形态结构和超微结构;通过MTT法测定了两类细胞的生长曲线;RT-PCR检测了两类细胞中SV40LT基因表达情况;免疫细胞荧光化学法检测了两类细胞表达vWF因子的能力;荧光显微镜下观察了两类细胞吞噬DiI-Ac-LDL的能力;检测了两类细胞在Matrigel基质胶中的管状成形能力。3.免疫学特性检测:RT-PCR测定了两类细胞中α-1,3-GT基因的表达情况;流式细胞术检测了两类细胞中α-1,3-Gal抗原表达情况;两类细胞与人血清共培养后,MTT法检测了人血清对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测了人血清对内皮细胞凋亡率的影响;免疫细胞化学法检测内皮细胞结合人IgG抗体和补体C3、C5b-9的能力。结果1.成功分离和培养了原代猪主动脉内皮细胞,通过倒置显微镜观察细胞呈单层生长,细胞为梭形、椭圆形或不规则形;电镜下细胞表面有绒毛凸起和W-P小体;内皮细胞表达vWF因子并可吞噬DiI-Ac-LDL;内皮细胞具有管状成形能力。2.用携带SV40LT慢病毒成功转染了原代细胞,转染后细胞株高表达SV40LT基因;原代细胞倍增时间约为21h,而细胞株倍增时间约18h;细胞株在形态学、表面标志物、吞噬DiI-Ac-LDL能力以及管状成形能力与原代内皮细胞相似。3.在免疫学特性上,α-1,3-GT基因和α-1,3-Gal抗原在两类细胞内表达无差异(荧光强度分别为(498.2士3.5)和(500.6士3.2),P>0.05),且均高于人脐静脉内皮细胞(P <0.05)。与人血清共培养时,随血清浓度升高,两类内皮细胞的增殖能力下降、细胞凋亡率增加,并均可结合人IgG抗体和补体C3和C5b-(9P>0.05)。结论实验提取的原代猪主动脉内皮细胞具有一般血管内皮细胞的基本形态结构、表型以及功能特征,通过原代动脉内皮细胞转染慢病毒建立的猪主动脉内皮细胞株较好的保持了原代血管内皮细胞的各种特征,并具有和人血清发生免疫反应的能力,具备在体血管内皮细胞的绝大部分功能,可用于异种移植细胞研究。
陈苹[8](2012)在《诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究》文中研究指明目的:通过在体外分阶段的序贯诱导途径,探索小鼠胚胎干细胞(ES)及诱导型多潜能干细胞(i PS)向角膜内皮样细胞定向分化的潜能,探究化学分子RA,细胞因子(b FGF、BMP4)联合体细胞共培养诱导的具体条件和方案,以期阐明其定向分化中的关键机制,并验证ES和i PS细胞作为角膜组织工程种子细胞的可行性,为组织工程角膜内皮层重建寻找来源充足,安全可靠的新型种子细胞奠定基础。方法:1.体外撕膜法分离消化新西兰大白兔的角膜内皮细胞及晶状体上皮细胞,建立培养扩增体系,并对其活力和特异性表达的标志物进行免疫荧光细胞化学(ICC)鉴定。收集晶状体上皮细胞的条件培养液,采用MTT法、Ki67的免疫荧光检测角膜内皮细胞在条件培养液中的增殖能力,用Western blot评估其表型标记物表达的变化。2.应用mef制备feeder,联合ES培养液维持和扩增小鼠ES细胞及i PS细胞系,并鉴定其全能性指标。去除lif因子及feeder,在低黏附培养皿中悬浮培养拟胚体EB,EB形成第四天加入不同浓度RA,并在不同时间点用定量PCR检测神经脊分化的指标。选择和比较不同的细胞外基质包括纤维连接蛋白、层粘蛋白、明胶、多聚赖氨酸和组织液房水作培养板的包被对神经脊(neural crest,NC)细胞迁出分化的影响,并采用ICC法对分化标志物进行检测。3.用P2-P3的兔角膜内皮细胞和兔晶状体上皮细胞分别进行如下共培养处理,包括:(1)条件培养液收集;(2)微胶囊包裹隔离共培养;(3)作为transwell小室隔离共培养的细胞;(4)丝裂霉素C处理制备饲细胞铺层;(5)活性细胞铺层。将初步诱导的NC样细胞序贯进入共培养阶段,比较并确定合适的共培养方法。应用ICC对分化后内皮样细胞进行表面标记关键分子的鉴定,定量PCR对分化后细胞m RNA表达谱的分析。4.采用b FGF+BMP4单层贴壁法诱导ES细胞向神经脊干细胞分化,后续条件培养液诱导向角膜内皮样细胞分化,并用ICC鉴定分化标记物的表达情况,用定量PCR分析基因表达的变化。结果:1.兔角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞在体外可以稳定地培养增殖,并表达其组织特异性的标记物。晶状体的条件培养液对角膜内皮细胞的增殖没有明显影响,但能上调角膜内皮细胞中ZO-1,N-cadherin和Vimentin的表达。2.ES/i PS细胞在lif和feeder的培养条件下表达全能性的标记物Oct4,SSEA-1,AP(+);去除lif和feeder后,在悬浮培养过程中形成拟胚体EB,第四天添加RA继续培养,随后的第四天获得一组神经脊分化标记物最高的表达。EB重新贴壁后继续培养时有大量细胞迁出,ICC检测显示有Nestin,P75,AP-2α,SOX10等的表达。3.Transwell小室,微胶囊包裹的实验组,EB细胞迁出生长,但不能维持良好的长势;在活性细胞做铺层的接触共培养组,EB细胞迁出受阻,出现大量的细胞凋亡;在晶状体上皮细胞及角膜内皮细胞条件培养液诱导7-8天后,诱导细胞形成紧密的铺路石结构,表达AQP1,ZO-1,Na+-K+-ATPase,N-cadherin等内皮标记。在长时间明胶铺层及Fn、Ln、多聚赖氨酸和兔房水铺层中,长时间明胶铺层能较好地维持EB贴壁生长并促进向内皮样细胞的分化。4.在单层细胞贴壁分化中,b FGF+BMP4诱导ES-cells表达神经脊细胞的标记物,继续晶状体条件培养液诱导6d出现角膜内皮样细胞标记物的表达。结论:1通过撕膜法可以建立稳定的兔角膜内皮细胞和晶状体上皮细胞的培养体系。晶状体上皮细胞条件培养液能更好地维持角膜内皮细胞的表型包括中ZO-1、N-cadherin、Vimentin,对细胞增殖没有明显影响。2.小鼠ES/i PS细胞可以通过EB途径经RA诱导向神经脊多潜能间充质干细胞分化。在定向分化中,长时间的明胶铺层效果更优于Laminin和Fibronectin所做的铺层。3.条件培养液是一种简单、可行、可控的共培养模式。在序贯法诱导方案中,角膜内皮细胞条件培养液和晶状体上皮细胞的条件培养液均能有效促进ES/i PS细胞来源的神经脊间充质干细胞向角膜内皮细胞的分化。4.单层细胞贴壁分化联合b FGF+BMP4因子诱导ES细胞向神经脊多潜能间充干细胞分化,后续应用晶状体上皮细胞条件培养液能更高效地诱导ES细胞分化成角膜内皮样细胞。
张思春[9](2012)在《人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原介导的猪血管内皮细胞永生化研究》文中提出血管内皮细胞(EC)指血管内表面形成的单层扁平细胞,它们在多种生理过程中发挥着重要的作用。猪的血管内皮细胞是猪瘟病毒(CSFV)的主要靶细胞,其感染CFSV后可引起严重的广泛性出血,是导致病猪死亡的主要原因之一。因此EC是研究CSFV感染及致病机制的良好细胞模型。原代EC作为一种终末分化的细胞,在体外的培养时间有限,传代10次左右就会进入衰老期而不能再继续增殖。反复分离原代EC不仅费时费力,而且各批次细胞间存在差异,不能保持各种细胞生理指标的稳定性。为了在CSFV感染与致病机制的研究过程中拥有稳定的、充足的细胞材料,我们拟建立能在体外无限培养的永生化猪EC细胞系。本研究首先采集新生小猪脐带,分离出静脉血管,灌注0.1%的I型胶原酶溶液,在37℃水浴消化10min后收集并培养血管内皮细胞。从共计200多条脐静脉中分离获得了大量的猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)。这些细胞呈单层铺路石样排列生长,2~3d能长满单层,von Willbrand factor阳性,并能大量摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL),证明这些细胞为血管内皮细胞。前2~6代的SUVEC生长速度较快,可用于CSFV感染研究,之后细胞生长速度逐渐减慢,总共可培养10代左右。为了提高基因重组效率,本研究使用重组逆转录病毒介导的基因转导来将人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40LT)基因分别转移进入SUVEC中。重组逆转录病毒载体pBABE-neo-hTERT和pBABE-puro-SV40LT分别与pVSV-G质粒共转染到GP2-293细胞中,收集假病毒液并感染SUVEC,利用G418或嘌呤霉素筛选出阳性克隆,并进行传代研究和细胞形态学及表型鉴定。获得的两个稳定的猪血管内皮细胞系分别命名为SUVEC-hT(携带hTERT基因)和SUVEC-ST(携带SV40LT基因)。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,生长速度比原代血管内皮细胞快,能稳定地传代培养而不表现衰老细胞的特征,迄今已培养至第120代和第115代,细胞生长仍然稳定,形态正常。利用RT-PCR及Western Blotting检测到SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT,SUVEC-ST细胞系持续表达SV40T抗原。SUVEC-hT细胞还表达特异的内皮细胞标志CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil-Ac-LDL。SUVEC-ST细胞系持续表达CD31和CD34分子,并能摄取Dil-Ac-LDL。核型分析表明,两种细胞系均保持与SUVEC相同的染色体数目和形态,含有38条染色体及正常的核型。细胞保持贴壁依赖性、接触抑制性,并且不能在软琼脂中生长。细胞增殖能力研究表明,这两个细胞系保持血清依赖性,它们不能在无血清培养基中生长;细胞增殖速度随着血清浓度的增加而加快,在血清浓度为10%时达到最大值,更高的血清浓度及内皮细胞生长支持物对细胞的生长没有进一步的促进作用。CSFV感染结果表明,两个细胞系保持了对CSFV的敏感性。以上研究表明,本研究在成功分离培养SUVEC的基础上,通过转录病毒转导的方法利用hTERT或SV40LT基因成功地建立了永生化的猪血管内皮细胞系SUVEC-hT及SUVEC-ST。它们保留了EC的主要生物学特征,并且是正常的而非转化的细胞。这些细胞将有助于出血性疾病病毒如CSFV的致病机理研究。
王峰[10](2012)在《微囊蛋白-1对创伤后内皮祖细胞功能受损的调控机制研究》文中提出创伤会导致机体的靶细胞严重损伤,同时由于感染所致的脓毒症及非感染所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)相互作用使得自体修复功能障碍,并进一步造成微血管损伤、微循环障碍,从而引起重要脏器功能障碍,这可能就是多器官功能障碍(multiple organ dysfunctionsyndrome,MODS)的始发环节。而MODS是重症监护病房(intensive care unit,ICU)患者死亡的最常见原因。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)是血管内皮细胞的前体细胞,在生理或病理因素刺激下,可从骨髓及其它组织被动员到外周血进行损伤的修复。内皮祖细胞又称为血管母细胞(angioblast),既参与出生后的血管生成(angiogenesis,AG),同时亦参与机体、器官损伤后的血管再生与修复。1997年,Asahara等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞,并将其命名为血管内皮祖细胞。近年来的研究显示,内皮祖细胞是参与出生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞,同时可以在体内分化为内皮细胞,并参与心、肝、肾等单个器官损伤或器官衰竭时的修复。因此,内皮祖细胞在创伤后缺血性疾病和创伤修复等过程中的具有重要治疗作用和广阔的临床应用前景。微囊蛋白(Caveolin),又称小窝蛋白,为小窝最主要组成蛋白,属整合膜蛋白。微囊蛋白家族包括Caveolin-1,Caveolin-2,Caveolin-3,其主要的作用是把细胞外的生物活性分子向胞内转移,并在胞内运输并参与多种信号的接收和转运,其生理功能主要表现在维持细胞进出平衡,参与细胞增殖、迁移和信号传递。微囊蛋白-l(Caveolin-1)是其主要组成蛋白,能直接与多种信号分子如G蛋白a亚单位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成员(Src,Fyn等)、EGF受体、胰岛素受体、PKC、eNOS等连接,从而调控这些信号分子的活性状态。Tan Zh等研究发现雌激素可以通过提高Caveolin-1的表达从而促进EPC的增殖和分化,同时Caveolin-1的表达强度和EPC的功能密切相关。进一步研究发现,Caveolin-1是体内信号转导通路的枢纽,可以能直接与多种信号分子如G蛋白a亚单位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成员等连接,调控这些信号分子的活性状态。有研究显示:通过药物干预或剔除Caveolin-1可使PI3K表达下降,用β-环糊精抑制Caveolin-1可阻止PI3K活化。活化的PI3K可以激活其下游的信号转导通路磷脂酰肌醇激酶-3/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/内皮型一氧化氮合成酶(PI3K/Akt/eNOS),而该信号通路下游的内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)的完整与否直接影响到EPC的动员、增殖和分化;而无论是PI3K/Akt/eNOS通路上游的磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt);还是下游的eNOS的效应子一氧化氮(NO)对EPC的动员、迁徙及血管形成功能都有非常重要的调节功能。Everaert研究发现,PI3K的活化能使其下游的Akt磷酸化,磷酸化的Akt可直接磷酸化eNOS,导致eNOS被激活,诱导血管内皮大量合成NO。NO可以通过作用于金属基质蛋白-9(mmp-9)促进EPC的动员、迁徙和血管形成功能,并可灭活细胞凋亡的关键酶caspase-3和caspase-6等,从多条途径抑制EPC和血管内皮细胞凋亡。本研究通过从不同组织(外周血、骨髓、脐血和脐带)中成功分离培养出内皮祖细胞,并在体外模拟缺血、缺因子环境下培养EPC,使EPC受损,观察EPC表面Caveolin-1的表达与EPC功能的关系,并在EPC体外培养体系中,利用RNA干扰技术调控Caveolin-1的表达强度,以及尝试阻断Caveolin-1信号转导通路PI3K/Akt/eNOS,观察EPC功能的变化。以明确Caveolin-1与EPC功能的相关性及其调控作用机制,从信号转导通路的角度进一步研究MODS的发生和发展机制,并通过改善创伤后内皮祖细胞功能,为有效防治MODS提供确实的理论依据和实验基础,并为临床创伤后MODS的有效防治提供新的方法。第一部分不同组织来源的人内皮祖细胞的分离、培养和鉴定目的:从不同组织中分离培养内皮祖细胞,并对比不同组织来源的内皮祖细胞功能的优劣,从而挑选出组织来源方便及功能优良的内皮祖细胞,为最终能够获得用于细胞移植或组织工程的种子细胞提供基础。方法:采用密度梯度差速贴壁培养法及组织块植块法,分别从外周血、骨髓、脐带血及脐带组织中分离培养内皮祖细胞,结合细胞形态学特征、细胞的超微结构、细胞免疫表型、乙酰化的低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)和荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的吞噬功能、体外血管生成功能进行鉴定,并对比不同组织来源的内皮祖细胞功能的优劣。结果:除外周血来源的细胞不能增殖传代,从骨髓、脐带血及脐带组织中均能成功分离培养并扩增内皮祖细胞,骨髓来源的内皮祖细胞连续传4代以上,细胞形态发生改变,而脐带血及脐带组织来源的内皮祖细胞可稳定传10代以上,细胞形态无明显改变。细胞呈集落样生长,继而增殖加速,周边出现梭状分化细胞,培养至约20天以后,出现了内皮细胞样的“铺路石”状,同时电镜观察细胞发现有内皮细胞特有的特征性的Weibel-Palade小体存在,符合内皮祖细胞的形态特点;流式细胞仪检测细胞表型发现,三种组织来源的内皮祖细胞都表达CD133、CD34、CD31和KDR,CD133和CD34的表达随培养时间增加逐渐下降,而CD31和KDR的表达随时间增加而升高;双吞噬功能鉴定发现超过85%体外培养的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1;体外血管形成实验显示:三种组织来源的内皮祖细胞均具有血管形成能力。对比三者的功能后发现,脐带及脐带血来源的内皮祖细胞较骨髓来源的内皮祖细胞,无论是稳定维持祖细胞的特性,还是增殖能力及成血管能力都较强。且按照每根脐带中位长30cm计算,原代平均可获得大量的内皮祖细胞(约1.51×l07个)。结论:从骨髓、脐带血及脐带组织中能成功分离培养出内皮祖细胞,并能传代扩增。脐带来源的内皮祖细胞形态学特征及功能与脐血来源的相似,无论是稳定维持祖细胞的特性,还是增殖能力及成血管能力相对于骨髓来源的内皮祖细胞来说都较强。且按照每根脐带中位长30cm计算,原代平均可获得大量的内皮祖细胞(约1.51×l07个),且培养方法简便、可靠。为最终能够获得用于细胞移植或者组织工程的种子细胞的临床应用做准备。第二部分微囊蛋白-l的表达与内皮祖细胞功能的相关性研究目的:证明内皮祖细胞功能受损时与其表面的微囊蛋白-l(Caveolin-1)的表达变化密切相关。方法:采用无血清无因子培养法,在体外使脐带来源的内皮祖细胞受损,检测其增殖和血管形成能力等功能变化及其表面微囊蛋白-l的表达。再通过RNA干扰技术抑制内皮祖细胞表面微囊蛋白-l的表达后,检测其增殖能力和血管形成能力等功能变化。结果:无血清无因子培养法可以诱导内皮祖细胞损伤凋亡,且随时间延长,凋亡增加,并且其血管形成能力也显着降低,其表面Caveolin-1的表达较正常组显着下降(P<0.01),并且随着内皮祖细胞损伤的加重,Caveolin-1的表达逐渐降低。说明内皮祖细胞的功能变化与其表面Caveolin-1的表达相关。利用RNA干扰技术成功抑制脐带来源的内皮祖细胞Caveolin-1的表达后,Caveolin-1RNA干扰组细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且细胞的血管形成能力也明显下降。结果表明,抑制Caveolin-1mRNA的表达,可以抑制内皮祖细胞的生长和血管形成等功能。结论:当内皮祖细胞受损时,其生长及血管形成能力降低等功能变化与其表面Caveolin-1的表达密切相关。抑制内皮祖细胞Caveolin-1mRNA的表达后,内皮祖细胞的增殖能力和血管形成能力显着下降。从而说明了内皮祖细胞表面Caveolin-1的表达可以调控其功能。通过正向调控Caveolin-1可以改善创伤后内皮祖细胞的功能,从而为有效防治多器官障碍提供确实的理论依据和实验基础。第三部分微囊蛋白-l对内皮祖细胞功能调控的机制探讨目的:探讨Caveolin-1是否通过PI3K/Akt/eNOS信号转导通路调节内皮祖细胞功能的变化。方法:在内皮祖细胞体外培养体系中,分别利用Caveolin-1、PI3K和Akt特异性抑制剂β-环糊精、LY294002和triciribine阻断信号转导通路后,观察该信号转导通路的下游产物磷酸化Akt蛋白和NO(间接反映eNOS)的表达情况及内皮祖细胞的生长和血管形成等功能变化,以证实Caveolin-1是否通过PI3K/Akt/eNOS信号转导通路调节内皮祖细胞功能的变化。结果:β-环糊精、LY294002抑制Caveolin-1和PI3K后,其下游的磷酸化Akt蛋白和NO(间接反映eNOS)表达均减少,加之triciribine抑制Akt后,eNOS表达减少,说明β-环糊精阻断Caveolin-1后,通过阻止PI3K活化来抑制Akt磷酸化,进而影响eNOS的活化造成NO产生减少。三组抑制组细胞与对照组相比,其细胞增殖能力和成血管能力都明显下降(P<0.05),说明了Caveolin-1通过PI3K/Akt/eNOS通路可调节内皮祖细胞的功能。当然,Caveolin-1可能还通过其它通路来调节内皮祖细胞的功能,这就需要我们更进一步的研究。结论:当内皮祖细胞受损时,其表面Caveolin-1表达降低,细胞增殖能力和成血管能力随之下降。内皮祖细胞表面的Caveolin-1表达减少,影响了PI3K的活化,使Akt磷酸化减少造成eNOS的活化减少,进而NO产生减少,导致内皮祖细胞的增殖能力和成血管能力等功能下降,进而影响机体修复。总之,当某些疾病(如缺血、创伤、甚至MODS)造成内皮祖细胞受损时,内皮祖细胞表面的Caveolin-1表达减少,影响了PI3K的活化,使Akt磷酸化减少造成eNOS的活化减少,进而NO产生减少,导致内皮祖细胞的增殖能力和成血管能力等功能下降,进而影响机体修复。这一结论为我们从信号转导通路的角度进一步研究MODS的发生和发展机制,并通过改善创伤后内皮祖细胞功能,为有效防治MODS提供确实的理论依据和实验基础,并为临床创伤后MODS的有效防治提供新的方法。
二、猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定(论文提纲范文)
(1)抵抗素和p38 MAPK/Wnt信号通路介导副猪嗜血杆菌感染引起细胞损伤的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语表(Abbreviation) |
第一章 前言 |
1.1 文献综述 |
1.1.1 副猪嗜血杆菌病概述 |
1.1.2 影响内皮细胞结构完整性的因素 |
1.1.3 抵抗素研究进展概述 |
1.1.4 影响上皮细胞结构完整性的因素 |
1.2 研究目的与意义 |
第二章 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 细胞、菌株与载体 |
2.1.2 主要试剂与试剂盒 |
2.1.3 培养基与主要溶液配制 |
2.1.4 主要材料、仪器与设备 |
2.1.5 干扰因子及其配制 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 副猪嗜血杆菌培养 |
2.2.2 荧光素酶报告质粒和表达质粒的构建 |
2.2.3 质粒转染(脂质体转染法) |
2.2.4 双荧光素酶实验检测方法 |
2.2.5 实时荧光定量RT-PCR检测基因m RNA水平 |
2.2.6 Western Blot样品制备 |
2.2.7 Resistin的原核表达与纯化 |
2.2.8 基因缺失细胞系的构建 |
2.2.9 跨内皮电阻测定 |
2.2.10 泛基因组的构建 |
2.2.11 分组可行性验证 |
2.2.12 HPS基因缺失突变株的构建 |
2.2.13 互补菌株的构建 |
2.2.14 野生株、缺失株和互补菌株的生长曲线绘制 |
2.2.15 细胞形态学观察及划痕实验 |
2.2.16 间接免疫荧光实验 |
2.2.17 统计学分析 |
第三章 结果与分析 |
3.1 HPS诱导3D4/21细胞分泌Resistin引起内皮细胞损伤的机制 |
3.1.1 HPS诱导3D4/21 细胞中Resistin的表达和分泌 |
3.1.2 Ets2 调控HPS诱导的3D4/21 细胞中Resistin的表达和分泌 |
3.1.3 p38 MAPK/Ets2调控HPS诱导的3D4/21细胞中Resistin的表达和分泌 |
3.1.4 HPS诱导3D4/21细胞分泌的Resistin调控PVEC间紧密连接结构 |
3.1.5 Resistin通过LKB1/AMPK/mTOR通路调控PVEC间紧密连接结构 |
3.2 HPS中 LPPA诱导Resistin分泌及引起内皮细胞损伤的机制 |
3.2.1 HPS强弱毒株对PVEC间紧密连接结构的影响存在显着差异 |
3.2.2 HPS强毒株中调控PVEC间紧密连接结构的相关基因筛选 |
3.2.3 HPS中LPPA通过p38 MAPK/Ets2调控3D4/21细胞中Resistin的表达和分泌 |
3.2.4 HPS中的LPPA蛋白通过LKB1/AMPK/mTOR通路调控PVEC间紧密连接结构 |
3.3 HPS通过p38 MAPK通路调控Wnt/β-catenin通路介导的上皮细胞EMT效应 |
3.3.1 Wnt/β-catenin通路调控HPS激活的上皮细胞EMT效应 |
3.3.2 p38 MAPK/DKK1通路调控上皮细胞中HPS激活的Wnt/β-catenin通路 |
3.3.3 HPS通过p38 MAPK调控Wnt/β-catenin通路介导的上皮细胞EMT效应 |
第四章 讨论与结论 |
4.1 讨论 |
4.1.1 Resistin表达和分泌的调控机制 |
4.1.2 Resistin对内皮细胞间连接结构的调控 |
4.1.3 HPS中外膜脂蛋白LPPA调控Resistin表达和分泌 |
4.1.4 HPS感染上皮细胞引起EMT效应 |
4.1.5 p38 MAPK通路与Wnt/β-catenin通路间的相互作用 |
4.2 结论 |
参考文献 |
附录 在读期间发表论文 |
致谢 |
本研究由以下项目资助 |
(2)视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1.1 研究意义 |
1.2 研究背景 |
1.2.1 视网膜血管的发育 |
1.2.2 视网膜血管生成异常眼病的治疗进展 |
1.2.3 小鼠模型在视网膜血管发育研究中的应用 |
1.2.4 家族性渗出性玻璃体视网膜病变的研究进展 |
1.3 本文的主要贡献与创新 |
1.4 本论文的结构安排 |
第二章 TMEM30A在视网膜血管生成中的功能研究 |
2.1 研究背景 |
2.2 实验材料与方法 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验所需溶液的配制 |
2.2.3 人视网膜细胞的培养 |
2.2.4 人视网膜血管内皮细胞的感染 |
2.2.5 Trizol法提取细胞总RNA |
2.2.6 RNA的逆转录及实时定量PCR |
2.2.7 血管形成实验 |
2.2.8 细胞蛋白的提取 |
2.2.9 蛋白免疫印记实验 |
2.2.10 实验小鼠模型的构建与诱导 |
2.2.11 实验小鼠基因型鉴定 |
2.2.12 视网膜铺片的制备 |
2.2.13 视网膜铺片的免疫荧光染色 |
2.2.14 冰冻切片的制备 |
2.2.15 免疫组化染色 |
2.2.16 视网膜铺片增殖染色 |
2.2.17 小鼠组织蛋白提取 |
2.2.18 细胞凋亡检测 |
2.2.19 转录组测序分析 |
2.2.20 实时荧光定量PCR |
2.2.21 数据分析 |
2.3 结果 |
2.3.1 磷脂内翻酶及TMEM30A在血管内皮细胞中广泛表达 |
2.3.2 人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常 |
2.3.3 血管内皮细胞敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
2.3.4 全身敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
2.3.5 TMEM30A影响血管内皮细胞增殖与VEGF的信号传导 |
2.4 讨论 |
2.5 本章小结 |
第三章 TWIST1在视网膜病理性血管生成中的功能研究 |
3.1 研究背景 |
3.2 实验材料与方法 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验小鼠模型的构建与诱导 |
3.2.3 实验小鼠基因型鉴定 |
3.2.4 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
3.2.5 人视网膜血管内皮细胞中TWIST1的过表达 |
3.3 结果 |
3.3.1 TWIST1 在正常血管内皮细胞中表达量较低 |
3.3.2 血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠视网膜表层血管发育异常 |
3.3.3 血管内皮细胞过表达Twist1促进血管内皮细胞增殖 |
3.3.4 血管内皮细胞过表达Twist1影响血管内皮细胞极性 |
3.3.5 血管内皮细胞过表达Twist1影响VEGF分泌 |
3.3.6 过表达TWIST1后Norrin/β-catenin信号通路活性上调 |
3.3.7 全身过表达Twist1的小鼠的视网膜血管发育异常 |
3.4 讨论 |
3.5 本章小结 |
第四章 家族性渗出性玻璃体视网膜病变家系致病相关突变筛查 |
4.1 研究背景 |
4.2 实验材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 样本收集及伦理审查 |
4.2.3 外周血收集及DNA提取 |
4.2.4 全外显子测序 |
4.2.5 全外显子测序结果的生物信息学分析 |
4.2.6 致病基因筛选原则 |
4.2.7 Sanger测序验证筛选到的致病基因 |
4.2.8 点突变质粒的构建 |
4.2.9 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
4.2.10 人视网膜血管内皮细胞中DLG1的敲减 |
4.3 结果 |
4.3.1 家族性渗出性玻璃体视网膜病变患者临床表型评估 |
4.3.2 家族性渗出性玻璃体视网膜病变致病基因筛选 |
4.3.3 S598G突变影响了DLG1功能的正常发挥 |
4.3.4 DLG1在人视网膜血管内皮细胞及小鼠各组织中广泛表达 |
4.3.5 敲减DLG1影响了血管内皮细胞的正常成管 |
4.3.6 敲减DLG1影响了VEGFR2的磷酸化 |
4.4 讨论 |
4.5 本章小结 |
第五章 全文总结与展望 |
5.1 全文总结 |
5.2 后续工作展望 |
致谢 |
参考文献 |
攻读博士学位期间取得的成果 |
(3)Waardenburg综合征模型猪的血管纹发育及转录组学分析(论文提纲范文)
英文缩略表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 分析Mitf-M缺失对猪血管纹基因转录组的影响 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
第二部分 Mitf-M缺失对猪血管纹组织结构发育的影响 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
第三部分 荣昌猪和小鼠耳蜗血管纹比较转录组学分析 |
引言 |
数据与方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
文献综述 巨噬细胞在内耳急性损伤中的作用 |
参考文献 |
附录1 |
附录2 |
附录3 |
附录4 |
附录5 |
附录6 |
攻读硕士期间发表文章情况 |
攻读硕士期间参加的学术会议 |
参与基金资助项目和课题研究 |
致谢 |
(4)HLA-Ⅰ类抗体通过活化动脉血管内皮细胞定向诱导人外周血来源单核细胞向M2a/c样巨噬细胞分化的分子和信号机制(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
引言 |
参考文献 |
第一部分 HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC对人外周血单核细胞表型分化的影响和分子机制 |
材料和方法 |
一、材料 |
二、方法 |
结果 |
一、HLA-ⅠAb、HLA-ⅠF(ab’)2与EC的结合力测定 |
二、体外人外周血单核细胞来源的巨噬细胞及mDC阳性对照的建立 |
三、单核/巨噬细胞与EC表面区分标志的选择和单核细胞-EC体外共培养体系的评估 |
四、HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC对人外周血单核细胞分化的影响和分子机制 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第二部分 HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC所诱导的巨噬细胞的功能鉴定 |
材料和方法 |
一、材料 |
二、方法 |
结果 |
一、人外周血单核细胞与HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC共培养后上清中细胞因子的变化 |
二、人外周血单核细胞与HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC共培养后胞内免疫功能相关基因的表达改变 |
讨论 |
小结 |
附件 |
参考文献 |
第三部分 HLA-Ⅰ类抗体活化后的EC诱导人外周血单核细胞定向分化的胞内触发信号转导机制 |
材料和方法 |
一、材料 |
二、方法 |
结果 |
一、HLA-Ⅰ类抗体通过活化EC诱导人外周血单核细胞胞内信号分子磷酸化变化 |
二、HLA-Ⅰ类抗体通过活化EC诱导人外周血单核细胞定向分化的信号转导机制 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
结论 |
创新之处 |
局限性 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位期间的学术成果 |
英文缩略词表 |
致谢 |
(5)红斑丹毒丝菌GAPDH等分子致病作用研究及DNA聚合酶Ⅳ诊断标识验证(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略词 |
1 文献综述 |
1.1 红斑丹毒丝菌研究进展 |
1.1.1 微生物学特性 |
1.1.2 猪丹毒及其他动物的丹毒病 |
1.1.3 人类红斑丹毒丝菌感染 |
1.2 红斑丹毒丝菌毒力因子和致病机制 |
1.2.1 已知的毒力因子和致病机制 |
1.2.2 相关领域研究进展 |
1.3 丹毒疫苗研究进展 |
1.3.1 传统疫苗 |
1.3.2 弱毒疫苗和野生型菌株的鉴别诊断 |
1.3.3 新型疫苗研究进展 |
1.4 本研究的内容与目标 |
2 红斑丹毒丝菌致病性表型研究 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 菌株、细胞系及培养条件 |
2.1.2 小鼠致病性实验 |
2.1.3 细胞粘附实验 |
2.1.4 细胞毒性试验 |
2.1.5 血浆纤维蛋白溶解酶原招募活性检测 |
2.1.6 粘附促进实验 |
2.1.7 招募plasminogen和fibronectin能力比较 |
2.1.8 全血杀菌实验 |
2.1.9 血清制备和IgG1/IG2a类型检测 |
2.1.10 统计分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 小鼠致病性实验 |
2.2.2 猪髋动脉血管内皮细胞粘附实验 |
2.2.3 细胞毒性实验 |
2.2.4 招募血浆纤维蛋白溶解酶原的活性检测 |
2.2.5 血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白的粘附促进实验 |
2.2.6 招募血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白能力的比较 |
2.2.7 全血杀菌实验 |
2.2.8 IgG1/IgG2a类型测定 |
2.3 讨论 |
3 GAPDH等红斑丹毒丝菌表面蛋白的致病作用研究 |
3.1 材料和方法 |
3.1.1 菌株、细胞系和培养条件 |
3.1.2 待研究的红斑丹毒丝菌表面蛋白的筛选 |
3.1.3 克隆、表达和纯化重组的红斑丹毒丝菌表面蛋白 |
3.1.4 重组GAPDH活性测定 |
3.1.5 制备多克隆血清 |
3.1.6 红斑丹毒丝菌表面蛋白分布测定 |
3.1.7 猪髋动脉血管内皮细胞粘附实验 |
3.1.8 竞争粘附抑制实验 |
3.1.9 血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白绑定活性检测 |
3.2 结果 |
3.2.1 红斑丹毒丝菌致病性相关表面蛋白的筛选 |
3.2.2 蛋白的克隆、表达和纯化 |
3.2.3 rGAPDH的酶活性 |
3.2.4 表面定位检测 |
3.2.5 重组表面蛋白对猪血管内皮细胞的粘附 |
3.2.6 竞争粘附抑制实验 |
3.2.7 血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白结合活性 |
3.3 讨论 |
3.3.1 SpaA的致病作用 |
3.3.2 CbpB的致病作用 |
3.3.3 GAPDH的致病作用 |
3.3.4 HP0728的致病作用 |
3.3.5 HP1472的致病作用 |
3.3.6 未来应该做的工作 |
3.3.7 小结 |
4 GAPDH等红斑丹毒丝菌表面蛋白的保护力研究 |
4.1 重组红斑丹毒丝菌表面蛋白的保护力 |
4.1.1 材料与方法 |
4.1.2 结果 |
4.1.3 讨论 |
4.2 对GAPDH作为广谱疫苗的评估 |
4.2.1 材料与方法 |
4.2.2 结果 |
4.2.3 讨论 |
5 红斑丹毒丝菌疫苗弱和野毒菌株鉴别诊断方法的建立 |
5.1 基于SNP区分猪丹毒疫苗株和野毒株的PCR方法的修正 |
5.1.1 材料与方法 |
5.1.2 结果 |
5.1.3 讨论 |
5.2 区分猪丹毒疫苗菌株和野生型菌株的双重PCR方法的建立 |
5.2.1 材料与方法 |
5.2.2 结果 |
5.2.3 讨论 |
6 总结 |
参考文献 |
附录 |
研究生期间的论文与专利 |
致谢 |
(6)GalTKO.hCD46.hTM转基因猪异种肺移植的初步研究及mfat-1转基因小鼠血清中miRNAs的表达分析(论文提纲范文)
第一部分:Ga1TKO.hCD46.hTM转基因猪异种肺移植的初步研究 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
材料与方法 |
1 实验材料 |
2 研究方法 |
结果 |
分析与讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分 mfat-1转基因小鼠血清中miRNAs的表达分析 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
材料与方法 |
1 实验材料 |
2 研究方法 |
结果 |
分析与讨论 |
结论 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
攻读学位期间发表文章情况 |
致谢 |
(7)猪主动脉内皮细胞株的建立和鉴定(论文提纲范文)
缩略语表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
文献回顾 |
实验一 原代猪主动脉内皮细胞的分离和鉴定 |
1 材料 |
1.1 主要试剂和耗材 |
1.2 主要仪器和设备 |
1.3 主要实验溶液的配制及相关实验准备 |
2 方法 |
2.1 原代猪主动脉内皮细胞的分离和培养 |
2.2 原代猪主动脉内皮细胞的鉴定 |
2.3 原代猪主动脉内皮细胞的生长曲线测定 |
2.4 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 原代猪主动脉内皮细胞的形态学特征 |
3.2 原代猪主动脉内皮细胞的一般特征 |
3.3 原代猪主动脉内皮细胞的管状成形能力 |
3.4 原代猪主动脉内皮细胞的生长曲线 |
4 讨论 |
实验二 猪主动脉内皮细胞株的建立和鉴定 |
1 材料 |
1.1 主要试剂和耗材 |
1.2 主要仪器和设备 |
1.3 主要实验溶液的配制及相关实验准备 |
2 方法 |
2.1 原代内皮细胞转染慢病毒 |
2.2 实时定量 PCR 测定内皮细胞表达 SV40LT 的情况 |
2.3 转染病毒后内皮细胞的鉴定 |
2.4 转染病毒后内皮细胞的免疫学功能检测 |
2.5 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 实时定量-PCR 检测两类内皮细胞内 SV40LT 的表达情况 |
3.2 两类内皮细胞的形态学特征 |
3.3 两类内皮细胞的一般特征 |
3.4 两类内皮细胞的生长曲线 |
3.5 两类内皮细胞的管状成形能力 |
3.6 两类内皮细胞的免疫学特征 |
4 讨论 |
小结 |
参考文献 |
个人简历和研究成果 |
致谢 |
(8)诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩略语一览表 |
第一部分 前言 |
1.1 研究意义和背景 |
1.1.1 角膜内皮层重建的重要意义 |
1.1.2 组织工程技术修复角膜内皮层的研究现状 |
1.1.3 ES/IPS细胞为基础的干细胞治疗的研究现状 |
1.1.4 ES/iPS 细胞为基础的干细胞作为替代治疗的种子细胞的可行性 |
1.2 本论文的研究目的及主要内容 |
第二部分 晶状体上皮细胞的旁分泌作用对角膜内皮细胞的影响 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 试剂与材料 |
2.2.2 兔角膜内皮细胞(Corneal endothelial cell,CEC)的取材和培养 |
2.2.3 兔角膜内皮细胞的表面分子标记鉴定(表型鉴定) |
2.2.4 晶状体上皮细胞(Lens epitheliual cell,LEC)的取材和培养 |
2.2.5 晶状体上皮细胞表型鉴定 |
2.2.6 MTT/CCK8 生长曲线法检测 LEC 条件培养液对角膜内皮细胞增值的影响 |
2.2.7 免疫荧光法 Ki67 检测条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
2.2.8 流式细胞术检测 LEC 条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
2.2.9 Western-blot 检测条件培养液对角膜内皮细胞表型维持的影响 |
2.3 结果 |
2.3.1 兔角膜内皮细胞 CEC 和晶状体上皮细胞 LEC 的体外生长形态与规律 |
2.3.2 兔角膜内皮细胞的表面分子标记鉴定 |
2.3.3 兔角膜内皮细胞Ac-LDL 及UEA-1 检测 |
2.3.4 兔晶状体上皮细胞的细胞标记鉴定 |
2.3.5 MTT/CCK8 生长曲线法检测晶状体条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
2.3.6 免疫荧光法Ki67检测条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
2.3.7 条件培养液下多次传代后的CEC细胞状态 |
2.3.8 流式细胞术检测晶状体条件培养液对角膜内皮细胞增殖的影响 |
2.3.9 Western-blot检测条件培养液对角膜内皮细胞表型维持的影响 |
2.4 讨论 |
2.5 本章结论 |
第三部分 ES/iPS细胞的体外培养,经EB途径RA诱导向神经脊间充质干细胞的分化 |
3.1 引言 |
3.2 材料和方法 |
3.2.1 试剂与材料 |
3.2.2 ES/iPS干细胞的体外培养和增殖 |
3.2.3 ES/iPS干细胞的全能性标记鉴定 |
3.2.4 拟胚体EB(Embryonic body,EB)形成 |
3.2.5 RA诱导EB进一步分化方法 |
3.2.6 不同铺层的制备 |
3.2.7 免疫荧光检测神经脊间充干细胞相关蛋白标记物(P75、AP-2α、SOX10) |
3.2.8 Real-time PCR法检测EB分化过程中神经脊间充干细胞相关m RNA表达 |
3.3 结果 |
3.3.1 分化流程 |
3.3.2 feeder的准备 |
3.3.3 ES/iPS细胞的体外生长形态与规律 |
3.3.4 ES/iPS 干细胞的全能性标记物检测鉴定 |
3.3.5 EB分化及RA诱导分化的生长情况 |
3.3.6 不同铺层 EB 细胞迁出的形态与大体情况 |
3.3.7 免疫荧光检测神经脊间充干细胞相关蛋白标记物表达 |
3.3.8. RT-PCR检测分化过程胚层标记物表达及Realtime PCR法检测EB分化过程中神经脊间充质干细胞相关mRNA 表达 |
3.4 讨论 |
3.5 本章结论 |
第四部分 共培养诱导角膜内皮样细胞分化 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 试剂与材料 |
4.2.2 不同共培养体系的建立 |
4.2.3 不同共培养体系对EB贴壁细胞迁出的初步比较 |
4.2.4 条件培养液法进一步诱导ES/iPS细胞源的NC细胞向内皮样细胞分化 |
4.2.5 免疫荧光检测角膜内皮细胞相关蛋白标记物表达 |
4.2.6 Realtime PCR检测诱导分化后角膜内皮样细胞相关mRNA表达 |
4.3 结果 |
4.3.1 不同共培养模式及其中诱导细胞的状态 |
4.3.2 不同共培养方式细胞分化生长的差别 |
4.3.3 免疫荧光检测诱导后角膜内皮细胞相关蛋白标记物表达情况 |
4.3.4 Realtime PCR法检测不同诱导方案,分化过程中角膜内皮细胞相关m RNA表达变化及差异 |
4.4 讨论 |
4.5 本章结论 |
第五部分 单层贴壁法诱导ES细胞向角膜内皮样细胞分化 |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 试剂与材料 |
5.2.2 bFGF+BMP4单层贴壁法诱导ES细胞向NC细胞分化 |
5.2.3 神经脊 NC 细胞分化指标的检测 |
5.2.4 条件培养液法对 NC 细胞的序贯诱导 |
5.2.5 分化后角膜内皮样细胞标记物的检测 |
5.2.6 分化后角膜内皮细胞相关 mRNA 表达变化及差异 |
5.3 结果 |
5.3.1 ES细胞单层贴壁法向神经脊干细胞分化的情况 |
5.3.2 免疫荧光检测神经脊间充干细胞相关蛋白标记物 |
5.3.3 RealtimePCR法检测分化过程中神经脊间充干细胞相关m RNA表达 |
5.3.4 NC分化后序贯诱导出现 CEC 的分化 |
5.3.5 分化后角膜内皮样细胞标记的检测 |
5.3.6 分化后角膜内皮细胞相关 mRNA 表达变化及差异 |
5.4 讨论 |
5.5 本章结论 |
第六部分 全文总结与展望 |
6.1 全文总结 |
6.2 主要贡献和创新点 |
6.3 未来研究工作展望 |
参考文献 |
致谢 |
博士期间学术论文及科研成果 |
(9)人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原介导的猪血管内皮细胞永生化研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
第一篇 文献综述 |
第1章 血管内皮细胞生物学 |
1.1 内皮细胞的结构 |
1.2 内皮细胞的功能 |
1.3 内皮细胞的典型特征 |
1.4 内皮细胞的培养历史 |
第2章 细胞的衰老和永生化 |
2.1 细胞的衰老 |
2.2 端粒与复制性衰老 |
2.3 细胞永生化的方法 |
2.4 永生化内皮细胞系 |
第二篇 实验内容 |
第1章 猪脐静脉血管内皮细胞的分离及培养 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
1.3 结果 |
1.4 讨论 |
1.5 小结 |
第2章 猪脐静脉血管内皮细胞的永生化 |
2.1 材料 |
2.2 方法 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
结论 |
参考文献 |
作者简介及科研成果 |
导师简介 |
致谢 |
(10)微囊蛋白-1对创伤后内皮祖细胞功能受损的调控机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩写 |
前言 |
参考文献 |
第一部分 不同组织来源的人内皮祖细胞的分离、培养和鉴定 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 微囊蛋白-l 的表达与内皮祖细胞功能的相关性研究 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 微囊蛋白-l 对内皮祖细胞功能调控的机制探讨 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
全文总结 |
综述 |
参考文献 |
在读期间发表论文及参加科研工作情况说明 |
致谢 |
四、猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定(论文参考文献)
- [1]抵抗素和p38 MAPK/Wnt信号通路介导副猪嗜血杆菌感染引起细胞损伤的机制研究[D]. 滑坷鑫. 华中农业大学, 2021
- [2]视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究[D]. 张珊珊. 电子科技大学, 2021(01)
- [3]Waardenburg综合征模型猪的血管纹发育及转录组学分析[D]. 陈林军. 中国人民解放军医学院, 2019
- [4]HLA-Ⅰ类抗体通过活化动脉血管内皮细胞定向诱导人外周血来源单核细胞向M2a/c样巨噬细胞分化的分子和信号机制[D]. 魏雪栋. 苏州大学, 2018(12)
- [5]红斑丹毒丝菌GAPDH等分子致病作用研究及DNA聚合酶Ⅳ诊断标识验证[D]. 朱伟峰. 华中农业大学, 2017(01)
- [6]GalTKO.hCD46.hTM转基因猪异种肺移植的初步研究及mfat-1转基因小鼠血清中miRNAs的表达分析[D]. 高卓. 南京医科大学, 2014(03)
- [7]猪主动脉内皮细胞株的建立和鉴定[D]. 王建锋. 第四军医大学, 2013(03)
- [8]诱导小鼠ES/iPS细胞向角膜内皮细胞定向分化的研究[D]. 陈苹. 上海交通大学, 2012(05)
- [9]人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原介导的猪血管内皮细胞永生化研究[D]. 张思春. 吉林大学, 2012(09)
- [10]微囊蛋白-1对创伤后内皮祖细胞功能受损的调控机制研究[D]. 王峰. 第二军医大学, 2012(09)