一、HLA表型与肿瘤逃逸（论文文献综述）
王静,魏素菊[1]（2021）在《HLA-Ⅰ类在肺癌免疫治疗中相关研究进展》文中研究指明免疫治疗在肺癌治疗中扮演着重要的角色,人类白细胞抗原Ⅰ类（HLA-Ⅰ）分子改变所致抗原呈递机制受损介导肺癌的免疫逃逸并影响免疫治疗疗效。HLA杂合性缺失（LOH）以及β2-微球蛋白（β2-MG）突变是目前研究较多的影响抗原呈递,从而引起免疫治疗耐药的机制,HLA-Ⅰ类多样性是黑色素瘤应用免疫检查点抑制剂疗效的预测性生物标志物,但与肺癌患者应用免疫治疗无相关性。HLA-Ⅰ类丢失与肺癌免疫细胞浸润及肿瘤组织结构相关,肿瘤组织结构在癌症进展期间会随着HLA-Ⅰ类的丢失发生变化。提出ALK、RET抑制剂可提高"软"结构改变的细胞表面的HLA表达,并且具有"硬"结构改变的免疫治疗耐药肿瘤中HLA-Ⅰ类抗原表达的恢复,是癌症治疗未来的挑战。HLA-Ⅰ类和PD-L1表达之间的关系尚无定论,但HLA-Ⅰ类和PD-L1的共表达是肺腺癌独立的不良预后因素,共同分析二者有助于更好地指导免疫治疗。HLA与TMB共同分析,可以更好地筛选免疫治疗人群。本文就HLA-Ⅰ类在肺癌免疫治疗中相关研究做一综述。
杨忖卿[2]（2021）在《西黄丸抑制乳腺癌上皮间质转化和免疫逃逸的分子机制》文中认为西黄丸由牛黄（原方犀黄）、麝香、乳香、没药四味药物组成,首见于清代名医王洪绪《外科证治全生集》。具有和营消肿止痛,清热解毒散痈的作用,可用于治疗热毒蕴结所致的多种恶疾（如流注、乳岩、痰核、瘰疬、肺痈、小肠痈等）。现代临床上可用来治疗乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤,但分子机制有待阐明。复发转移是乳腺癌治疗失败的主要原因。上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）与肿瘤转移密切相关。EMT经过一系列生物学变化,丧失细胞极性和细胞间接触能力,增强了运动和侵袭能力,进而赋予了癌细胞侵袭和转移能力。在EMT过程中,上皮标志物如E钙黏素蛋白（E-cadherin）、角蛋白（Cytokeratin）等表达水平降低,间质标志物如纤连蛋白（Fibronectin）、N钙黏素蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等表达水平升高。表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）与其受体结合后,可诱导E-cadherin进入胞内,上调Snail 1或Twist的表达水平,下调E-cadherin的表达,诱导EMT表型,进而参与肿瘤的增殖、迁移、侵袭和转移。EMT状态和程序性死亡配体1（programmed death ligand1,PD-L1）信号之间存在复杂的双向调节作用。EMT与PD-L1高表达有关:EMT相关标志物如Snail和波形蛋白（Vimentin）H评分与PD-L1表达呈正相关。PD-L1的高表达通常被认为是癌症患者预后不良的预测因子,癌细胞可通过自身高表达PD-L1来逃避宿主的抗癌免疫攻击。PD-L1可与活化的T细胞表面表达的程序性死亡受体1（Programmeddeathreceptor 1,PD-1）相互作用,诱导T细胞凋亡,导致肿瘤免疫逃逸。除EMT与PD-L1有重要的双向调节作用之外,PD-L1还受到γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-y）的上调。肿瘤细胞内干扰素刺激基因高表达往往会发生化疗或免疫治疗的耐药。IFN-y与其受体结合后,激活下游JAK/STAT信号通路,IRF-1蛋白表达激活,进而诱导肿瘤细胞PD-L1的表达;而另一个干扰素刺激基因IFIT3过表达可直接促进肿瘤耐药,而敲除IFIT3基因后可减弱化疗耐药性;在乳腺癌患者中,干扰素下游的OAS1的表达也与预后不良密切相关。尽管免疫细胞中高表达的具有IFN-γ抗肿瘤作用,但肿瘤细胞内高表达的干扰素刺激基因却可以发挥促进肿瘤发生发展的作用。我们的前期结果显示,西黄丸水提液可以抑制一组下游干扰素刺激基因的表达,同时抑制乳腺癌细胞EMT过程和PD-L1表达。因此,本研究旨在进一步探讨西黄丸对乳腺癌细胞EMT的作用及分子机制;分析西黄丸抑制乳腺癌细胞PD-L1表达及对干扰素刺激基因的作用;阐明西黄丸对于单核细胞亚群比例与功能的影响。以更好地了解西黄丸抑制乳腺癌发生发展的分子机理,为西黄丸的现代化开发以及未来与肿瘤免疫治疗药物联用打下坚实基础。第一部分 西黄丸水提液抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞上皮间质转化目的:揭示西黄丸水提液对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞EMT的影响及其分子机制。方法:利用EGF刺激,诱导乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞出现EMT表型,再联用不同浓度的西黄丸水提液,Western Blot法检测肿瘤细胞EMT相关标志物及相关信号通路标志物Fibronectin、E-cadherin、Vimentin、STAT3和p-STAT3的表达水平。结果:100nM EGF刺激24小时后可显着升高乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞Fibronectin和p-STAT3的表达水平,诱导出EMT表型。联用西黄丸水提液后,可在乳腺癌细胞中显着下调间质细胞标志物Fibronectin的表达水平,降低STAT3的活性,抑制因EGF刺激诱导出的EMT表型。结论:在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中,西黄丸可下调STAT3的活性,并抑制由EGF诱导的EMT表型。第二部分基于中药网络药理学和基因表达谱分析西黄丸治疗乳腺癌作用机制目的:利用中药网络药理学和基因表达谱技术探讨西黄丸治疗乳腺癌的分子作用网络,进一步阐明西黄丸治疗乳腺癌的分子机理,寻找药物靶点。方法:检索网络药理学数据库,查找西黄丸的有效成分、作用靶点及乳腺癌的相关基因并进行分析;将西黄丸的有效成分作用靶点与乳腺癌的相关基因取交集,导入Cytoscape软件作“活性成分-疾病靶点图”核心靶点网络图,建立PPI网络、GO富集分析和KEGG信号通路分析。以10nM的紫杉醇（Paclitaxel,PTX）作用乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞24h,加入7.5mg/ml的西黄丸水提液作用24h后提取总RNA,进行基因芯片表达谱分析,找出差异基因,进行GO分析和KEGG通路分析。结果:网络药理学显示西黄丸的主要有效成分包括槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、鞣花酸（ellagicacid）等;主要作用靶点包括 TP53、IL6、JUN、VEGFA、MAPK1和STAT1等;信号通路包括:PI3K-Akt、肿瘤坏死因子、HIF-1、干扰素相关信号通路等;基因表达谱显示差异表达基因有OAS2、IFIT3、IFIT2、IFI44L、IFI44、FLG2、MUC17和MUC19,差异基因生物过程主要富集在:对病毒的反应,Ⅰ型干扰素信号通路、对外界生物刺激的反应、细胞对生物刺激的反应、细胞对IFN-γ的反应等。综合二者结果,我们选择干扰素通路进行下一步研究。结论:综合分析网络药理学及基因芯片表达谱结果,包括STAT1在内的一组干扰素刺激基因可能是西黄丸水提液的重要作用靶点。第三部分 西黄丸抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231免疫逃逸的分子机制目的:通过分析西黄丸对重要免疫检查点PD-L1及IFN-y诱导基因的抑制作用,揭示西黄丸对乳腺癌免疫逃逸及耐药的影响和分子机制。方法:利用流式细胞术,检测西黄丸水提液XHW（Z）、牛黄水提液NH（W）、麝香水提液SX（W）、乳香水提液RX（W）单独或在PBMC共培养体系下对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231表面PD-L1表达水平的作用。利用紫杉醇或干扰素进行诱导刺激,通过Real Time PCR法检测西黄丸全方或单药水提液对乳腺癌MCF-7 细胞、MDA-MB-23 1 中 STAT1、IFIT3、OAS1 和 IFI44 基因表达的影响。结果:在对肿瘤细胞单独给药或肿瘤细胞与人PBMC共培养条件下,7.5mg/ml XHW（Z）处理24小时可显着下调乳腺癌MDA-MB-231细胞PD-L1的表达水平（P<0.01）。0.75mg/mlMY（W）、RX（W）可显着下调乳腺癌MCF-7与PBMC共培养后PD-L1的表达水平（P<0.01）。在乳腺癌MCF-7细胞中,0.75mg/ml NH（W）、SX（W）可显着降低因IFN-γ（200ng/ml）刺激而升高的STAT1、IFIT3、OAS1、IFI44 基因表达量（P<0.01）;10nM 紫杉醇（paclitaxel,PTX）作用于乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞24h后,加入7.5mg/ml XHW（Z）作用24h,可显着地抑制因PTX诱导升高的OAS1、STAT1、IFIT3和ISG15基因表达（P<0.05）。结论:西黄丸水提液可以显着降低乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中关键免疫检查点PD-L1蛋白的表达,单药中乳香水提液对其作用最为明显。西黄丸水提液可以降低因紫杉醇或INF-γ诱导升高的STAT1、IFIT3、OAS1、IFI44等干扰素刺激基因的表达水平,验证了上述基因表达谱的结果。第四部分 西黄丸有效成分对单核细胞亚群比例及HLA-DR表达的影响目的:通过研究西黄丸有效成分对单核细胞CD14++CD16-亚群比例及HLA-DR表达的影响,了解西黄丸对于机体重要免疫细胞功能亚群活性的作用。方法:将西黄丸有效成分加入健康志愿者外周血中,流式细胞术检测XHW（Z）、XHW（W）、NH（W）、SX(W、RX（W）对单核细胞 CD14++CD16-、CD14+CD16+和CD14+CD16++不同亚群HLA-DR表达水平的影响;分析单核细胞不同亚群比例的变化。结果:7.5mg/ml XHW（Z）可以显着上调单核细胞经典群（CD14++CD16-）中HLA-DR的表达水平（P<0.01）,并显着增加CD14++CD16-HLA-DRhi的比例（P<0.01）,上调单核细胞经典群（CD14++CD16-）的比例（P<0.01）。在各个单药水提液中,RX（W）对上述二者的上调作用最为明显。结论:西黄丸全方水提液可以上调单核细胞经典群中HLA-DR的表达,并升高单核细胞经典群的比例,提示这可能是西黄丸增强免疫细胞活性的重要作用机制。综上所述,西黄丸水提液可以抑制乳腺癌细胞EMT并下调关键免疫检查点PD-L1,降低肿瘤细胞中干扰素刺激基因的表达,同时提高单核细胞HLA-DR的表达水平,这为西黄丸抑制肿瘤EMT和免疫逃逸提供了全新的分子机制,并为进一步开发西黄丸有效成分,未来与肿瘤免疫治疗药物联用提供了重要依据。
宫文静[3]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中研究表明研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。
李青[4]（2021）在《ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸》文中研究指明肺癌是全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。据文献报道,过去的40年里,肺癌的5年生存率小于21%。肺腺癌（Lungadenocarcinoma,LUAD）作为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）最重要的亚型,发病率逐渐增多,成为备受关注的NSCLC亚型。伴随着靶向治疗的出现,晚期LUAD患者的5年总生存有所改善,但仍面临靶向药物耐药、获益人群受限、缓解率不高等问题。以PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点阻断（Immunecheckpointblockade,ICB）及以抗原嵌合受体T细胞（CAR-T）治疗为代表的过继性T细胞转移（ACT）治疗的出现为晚期肺癌患者带来了新的希望。而目前PD-I/PD-L1抑制剂在实体瘤的临床有效率及瘤种反应率不尽相同。单纯抗PD-1/PD-L1免疫治疗在晚期NSCLC的客观有效率仅为20%,除了患者选择不足和肿瘤自身免疫原性低外,复杂的免疫抑制微环境,包括抑制性免疫细胞、细胞因子和代谢物,以及肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）数量和功能下降,是T细胞免疫和有效ICB治疗的主要障碍。因此,寻找新的免疫检查点分子作为替代或补充,以突破肿瘤免疫抑制性屏障,逆转肿瘤免疫抑制微环境是目前肿瘤免疫治疗亟需解决的问题。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,而肿瘤浸润T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境中参与抗肿瘤免疫应答的最重要的免疫细胞,如何提高肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的浸润水平及功能是当下免疫治疗的研究热点。成熟T淋巴细胞膜表面可表达CD3分子,根据T细胞表面分化抗原的不同,T细胞可分为CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞二个亚群。CD4+T淋巴细胞,通过与外源性抗原肽-MHCII分子结合发挥辅助作用;CD8+T淋巴细胞,主要与内源性抗原肽-MHC-I分子结合、活化,借助于颗粒酶、穿孔素等发挥特异性杀伤功能,是机体免疫系统中最重要的效应细胞。目前研究表明肿瘤浸润淋巴细胞,特别是CD4+Th1和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）的存在与肿瘤患者较好的预后及肿瘤免疫治疗的疗效相关。FOXP3是Tregs的特异性转录因子。它不仅控制其表型,而且维持其免疫抑制功能,是应用最广泛的Treg标记。Treg通常通过接触依赖方式抑制Teffertor、NK或APC的激活,或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制因子介导免疫抑制功能。目前大部分研究表明,在绝大多数肿瘤类型中,细胞毒性抗肿瘤免疫应答的主要细胞(如细胞毒CD8+T细胞、Th1导向的CD4+T细胞、三级淋巴结构（TLSs,tertiary lymphoid structures）的存在与良好的临床结果相关。相反,Tregs表达者预后较差。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中Tregs和抑制性检查点分子等复杂的免疫抑制因子可以限制T细胞的浸润和杀伤能力,而这对于肿瘤的根除至关重要。因此,开展肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的研究对肿瘤的免疫治疗尤为重要。ILT4作为免疫球蛋白样转录子抑制性受体的一种,主要在髓系固有细胞（DC细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞）中表达,通过与经典或非经典组织相容复合体I类分子（MHC-I）结合,在维持母婴免疫耐受、器官移植耐受及炎症反应中发挥重大作用。研究表明,免疫细胞中ILT4的表达可有效抑制CD4+T细胞、CD8+细胞毒T细胞、NK细胞及树突状细胞的免疫活性,同时亦能诱导不同类型Treg细胞发挥免疫抑制作用。其虽在免疫学研究中取得十足的进展,但在肿瘤领域的研究相对较少。近年来,研究发现ILT4在NSCLC、白血病、乳腺癌、食管癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞中存在表达,且与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等多种恶性生物学行为息息相关。此外,ILT4在髓系抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）中高表达,可促进肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAM）的M2极化,在创造肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。但肿瘤源性ILT4对实体肿瘤免疫抑制性微环境中T淋巴细胞亚群的调控作用及相关机制尚无报道。研究目的1.通过免疫组化染色方法和大数据统计分析ILT4在肺腺癌中的表达及其与T细胞浸润与亚群分布的相关性,以及二者与患者预后的相关性,明确ILT4对免疫抑制微环境的调控作用。以此为基础构建肺腺癌患者预后Nomogram列线图模型,为患者预后的预测提供量化工具。2.体外利用CD3+、CD4+和CD8+T细胞及敲低/过表达ILT4的肺腺癌细胞株构建T细胞-肿瘤细胞共培养体系,应用CCK-8和流式细胞术检测T细胞的增殖和凋亡情况。旨在探讨肿瘤源性ILT4抑制T细胞浸润的可能机制。方法1.收集216例经烟台市烟台山医院病理科诊断明确的原发性肺腺癌患者的病理组织标本及临床病理资料,并通过电话随访的方式获得入组患者的生存资料。应用免疫组织化学染色法检测其ILT4及CD3、CD4、CD8、FOXP3在肿瘤癌巢及间质的表达情况;结合免疫组化结果和GEO公共数据库统计分析ILT4与肺腺癌预后的关系。其次,分别统计ILT4的表达与上述T淋巴细胞亚群在癌巢及间质的分布密度关系,探讨ILT4与T淋巴细胞两者共表达对肺腺癌患者生存预后的影响。2.利用KM-plotter在线工具（http://kmplot.com/）数据库分析肺腺癌患者ILT4的生存情况。对基因表达综合数据库（GEO）中的720例和461例LUAD患者分别进行无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分析。自动选择每个队列的最佳截止值,其他所有参数均为默认设置。从GEO数据库下载LUAD患者的基因表达谱（GSE50081;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50081）,GSE50081的基因注释基于微阵列平台GPL570,对127个L UAD样本进行了进一步的研究。对于癌症基因组图谱（TCGA）队列,泛癌的RNASeq数据从UCSC xena下载（https://xenabrowser.net/datapages/）,共纳入515个样本。用ssGSEA函数对R package GSVA中的Treg浸润评分进行量化。采用Spearman相关系数评价ILT4表达与Treg浸润的相关性。3.利用患者临床病理资料、ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据创建可评估患者预后生存的诺谟图。其中,利用Lasso回归,基于Lambda.1se筛选有意义的指标,将能够反应免疫微环境状态（即ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据）的这些自变量与其回归系数组成一个计算评分,即为lasso系数。将lasso回归筛选得到的指标联合临床病理参数制作诺谟图,以估算NSCLC患者2年和3年的生存率。其中模型的构建采用R语言3.0.1（R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria）和glmnet package进行LASSO Cox回归模型分析,并运用图形校准法检验模型的一致性/标定度（Calibration）及C-Index值评价模型的区分度。4.利用基因转染技术,分别敲低/过表达LUAD细胞系-H1975中ILT4的表达,应用Western blot、RT-PCR方法分别检测ILT4的转染效率。然后,运用Ficoll-Paque分离液分离健康志愿者全血中的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采用相应T细胞亚群磁珠分选试剂盒分选并利用CD3单抗活化人CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群。将敲低/过表达ILT4的LUAD H1975细胞系（H1975-shILT4与H1975-ILT4）分别与活化的CD3+、CD4+及CD8+T细胞按2:1比例共培养48h。然后,分离共培养之后的T细胞。分别利用CCK-8法和流式细胞术检测共培养体系中T淋巴细胞亚群增殖和凋亡情况。结果1.ILT4在LUAD高表达,正常邻近组织低表达,其表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及较差的PFS、OS相关。此外,ILT4的表达与肿瘤浸润T淋巴细胞的减少有关。进一步行T细胞亚群分析显示,ILT4高表达肿瘤中癌巢和间质中浸润的CD8+T淋巴细胞的减少,Treg浸润增加,而与CD4+T淋巴细胞亚群的浸润密度无关。同时ILT4highCD8low/ILT4highTreghigh肺腺癌患者的OS更差。因此,ILT4与CD8/Treg联合相比任何单一标记具有更好的生存预测价值。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可以有效的预测患者2年及3年的生存率,为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者的2年、3年生存概率。3.应用RT-PCR及Western blot方法分别检测敲低/过表达肺腺癌细胞H1975中ILT4的转染效率满意。敲低H1975细胞中ILT4表达后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性增加,而凋亡比例明显减少。而过表达H1975细胞中ILT4后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性受到抑制,凋亡比例明显增加。但两组中均未观察到CD4+T淋巴细胞亚群的浸润变化。结论1.肿瘤源性ILT4的表达与肺腺癌免疫抑制T淋巴细胞亚群的浸润和不良的临床预后相关。提示ILT4可能成为LUAD患者潜在的免疫治疗靶点和预后生物标记物。同时,ILT4与CD8/Treg联合可作为评估LUAD患者预后的更佳指标。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者生存概率。3.肿瘤源性ILT4通过调控T细胞亚群增殖、凋亡诱导肺腺癌的免疫逃逸。
郑博[5]（2021）在《肝癌免疫微环境空间异质性研究》文中研究表明研究背景和目的:癌症是致死率最高的疾病之一。近年来,免疫治疗成为了一种非常有前景的癌症治疗策略,其主要作用机制是通过激活免疫细胞的抗肿瘤免疫反应,达到主动杀伤肿瘤逆转肿瘤恶性进展的目的。然而目前免疫疗法的广泛应用仍面临着诸多阻碍,既免疫治疗效果在不同患者、不同癌种中的差异非常大。即便是对于最广泛应用的抗PD-1/PD-L1和抗CTLA4治疗,也只有小部分患者表现出较好的反应性,说明我们仍然需要对肿瘤免疫微环境开展更深入的研究。肿瘤中免疫微环境的空间异质性是癌症免疫治疗中面临的主要难题之一,也是近年国内外研究热点。肿瘤细胞与浸润免疫细胞之间的相互作用在肿瘤发生发展每个阶段都具有重要作用。已有大量报道证明在肺癌,乳腺癌,大肠癌,肝癌等众多肿瘤中都存在空间免疫异质性。特别是肝癌,由于在肝癌发病过程中表观遗传学、病毒感染、酒精以及代谢异常等多种因素参与其中,因此肝细胞肝癌（HCC）也被认为是异质性最高的癌种之一。与癌旁组织相比,肝癌微环境表现出更为复杂的免疫抑制表型,其可诱导肿瘤逃逸并促进肿瘤恶性进展。近年北京大学张泽民研究员团队在单细胞层面整体描述了肝细胞肝癌免疫微环境,并发现了与肿瘤免疫逃逸机制相关的全新免疫细胞亚群,但免疫细胞如何从激活状态转变为抑制状态的过渡机制,肿瘤微环境如何与周围正常或异常肝细胞相互交流目前仍不清楚。最近有研究发现癌组织与癌旁组织交界区（L）也是免疫微环境细胞的过渡区域,L区中富集的PD-1+B细胞可通过IL-10信号通路促进HCC进展。而驻留在L区的嗜中性粒细胞则可通过诱导血管生成来促进肿瘤进展。因此深入探讨从非肿瘤癌旁组织向肝癌癌组织过渡的免疫微环境变化规律、寻找关键免疫细胞亚群、探讨其起源以及潜在的生物学功能并与患者临床表型和预后相联系,将有助于我们建立针对不同肝癌患者的个性化诊疗策略和新的免疫治疗评估模型。本课题旨在探索肝癌免疫微环境的空间异质性,分析肝癌交界区（L）的特殊免疫亚群构成,寻找关键的免疫亚群,为肝癌免疫治疗提供新靶点和思路。研究方法:1.手术获取新鲜的肝癌样本,严格按照癌组织和癌旁各一半进行取样,样本大小6cm（长）*4cm（宽）*3cm（厚）,共收取样本13例。每例样本按照癌与癌旁交界线正负约0.5cm进行两处切割,将样本分为癌（T）,交界区（L）,癌旁（N）三份。再通过ficoll试剂提取法,提取出T/L/N区域的浸润淋巴细胞;2.根据T细胞表面分群标志物特征,设计包含有35个T细胞表面标志物的金属标签抗体组,对T/L/N区域提取出的浸润淋巴细胞进行抗体染色,随后进行质谱流式细胞仪（Mass Cytometry,Helios,Fluidigm）上机检测;3.通过质谱流式细胞仪,我们获得了单细胞水平的蛋白组学表达数据并对每例样本不同的区域分别进行了约50万个细胞的数据收集;4.将获得的数据进行标准化（standardization）处理之后,我们利用cytobank平台对数据进行预分群,随后再借助R语言（Cytofkit package）对分群后数据进行深度分析;5.流式分选出交界区域特异性富集的T细胞亚群,在体外加入Phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）和Ionomycin刺激4.5小时,同时加入蛋白转运抑制剂（Brefeldin A）,最终用流式检测一系列细胞因子的表达水平;6.利用多标免疫荧光染色技术,在组织原位验证交界区域特征性T细胞亚群的存在。并通过对组织芯片进行染色,探索该亚群与肝癌预后的关系;7.通过原位种植和皮下种植两种形式构建肝癌动物模型,分离动物模型肝癌肿瘤中的浸润淋巴细胞,验证交界区域特征性T细胞亚群是否存在;8.利用单细胞测序技术,对人肝癌组织来源的交界区富集的特征性T细胞亚群进行转录组和TCR测序,揭示该T细胞亚群的内部异质性和谱系起源。研究结果:1.肝癌免疫微环境中淋巴细胞构成存在明显异质性,交界区域（L）有着其独特的免疫细胞亚群构成,而其中T细胞亚群构成的差异尤为明显;2.通过对T/L/N三个区域的T细胞亚群构成和丰度分析,我们发现双阳性T细胞（Double positive T cell,DPT）特异性的富集于交界区域（L）,根据疲劳分子PD-1的表达丰度,可以将这些DPT细胞分为PD-1highDPT细胞和PD-1lowDPT细胞;3.进一步研究发现,交界区域（L）富集的PD-1highDPT细胞不仅高表达疲劳分子,如PD-1,TIM-3,LAG-3,CTLA-4。还同时高表达T细胞激活分子,如HLA-DR,CD28。并且其表达水平远高于PD-1lowDPT细胞和单阳性T细胞;4.通过分离交界区域来源的DPT细胞,在体外进行刺激和流式细胞因子检测,我们发现PD-1highDPT细胞高水平分泌IFNγ和TNFα,是具有杀伤活性的功能性T细胞;5.通过对包含有46组T/L/N的组织芯片进行多标免疫荧光染色,我们不仅在组织原位验证了PD-1highDPT细胞的存在,同时还发现交界区域（L）的PD-1highDPT细胞与肝癌患者的预后成正相关;6.通过肝癌动物模型和其他癌种（胆管癌,肾癌）的质谱流式数据,我们验证了PD-1highDPT细胞不仅存在于人类肝癌组织,还存在于肝癌动物模型和其他癌种;7.通过对流式分选出的5018个肝癌来源的DPT细胞进行单细胞转录组测序,我们将DPT细胞深度划分为11个亚群,其中10号亚群与质谱流式数据鉴定出的PD-1highDPT细胞表型相似,同时高水平表达疲劳分子如LAG-3,CTLA-4和杀伤分子如GZMH,GZMB。利用转录谱表达的差异性,我们对11个DPT细胞亚群进行了细胞激活评分（activation score）和疲劳状态评分（exhaustionscore）,结果显示10号亚群无论是激活评分还是疲劳评分都是最高的,并且也高表达PD-1;8.为了探究肝癌来源DPT细胞的谱系起源,我们分别对同一位患者的5018个DPT细胞、3676个CD4单阳性T细胞、4470个CD8单阳性T细胞以及4652个外周血来源的CD3阳性T细胞进行了单细胞TCR测序。通过TCR分析,我们发现肝癌来源的DPT细胞来源于组织内部而并非外周血,PD-1highDPT细胞与肿瘤内的PD-1highCD8阳性T细胞起源于相同的前体细胞。结论:本研究发现肝癌的交界区域（L）有着其独特的免疫细胞构成。双阳性T细胞特异性富集于肝癌交界区并可根据PD-1表达高低分为两组,而其中PD-1highDPT细胞同时高表达疲劳分子和激活分子,并与肝癌患者预后正相关。通过单细胞转录谱和TCR测序技术,我们发现DPT细胞具有内部异质性并可以被进一步分为11个亚群,其中PD-1highDPT细胞与肿瘤内PD-1highCD8阳性T细胞起源相同,说明肝癌来源的DPT细胞来源于组织内部而并非外周血。本研究揭示了肝癌来源DPT细胞的复杂功能,同时还阐明了该群DPT细胞的演化规律及肝癌组织临界区免疫微环境的特点。
赵亚楠[6]（2021）在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中研究说明第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂（ICB）、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1（PD-L1）,与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）及调节性T细胞（Tregs）等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织（14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结）,制备微阵列组织芯片。（1）免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子（IL-1β、IL-18）的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。（2）免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。（3）分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。（1）检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子（TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160）的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力（IFN-γ、TNF-α）及NK细胞脱颗粒能力（颗粒酶、穿孔素、CD107a）,判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。（2）流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs、M-MDSCs）和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测NLRP3炎症小体相关基因（IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1）在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株（OCI-LY3、RC和DB）,对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。（1）提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。（2）将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:（1）A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。（2）ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。（3）WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。（4）淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。（5）对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。（6）对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。（1）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL（GCB-DLBCL）相比,非GCB型（non-GCB）DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10（-）和MUM1（+）的患者中表达水平更高。（2）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。（3）RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。（1）流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞（CD3-CD56+）比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。（2）流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶（LDH）水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数（IPI）有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。（3）流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。（1）WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1表达明显下调。（2）体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。（1）我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。（2）Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3（pSTAT3）的蛋白水平。（3）分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。（1）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。（2）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。（3）与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。（1）将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。（2）流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。（3）流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。（4）流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。（5）Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。（1）在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。（2）流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。（3）流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织（Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,HP）感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1（Arginase 1,Arg-1）消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞（Tregs）聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点（8、11、14、19月）分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs（Gr-1+CD 11 b+）的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs（CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+）、Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s（CD33+CD11b+）和γδT17（TCRγδ+IL-17+）在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害（LEL）,这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。
陈小徵[7]（2021）在《ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究》文中研究说明研究背景针对PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂（ICIS）是近年来抗肿瘤治疗的里程碑。这些药物已经在多发性实体瘤中取得了有希望的结果,并被确立为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）一线治疗的标准治疗方案。然而,ICIS的疗效仍然有限,在表皮生长因子受体（EGFR）野生型NSCLC患者中小于20%。更糟糕的是,到目前为止,在EGFR驱动的非小细胞肺癌中ICIS的临床试验基本上是无效。据报道,除了固有的低肿瘤突变负荷（TMB）和主要组织相容性复合体（MHC）的表达外,激活的EGFR信号可以利用多种策略来诱导免疫抑制性肿瘤微环境（TME）,包括抑制T细胞浸润和细胞杀伤功能,募集免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性T细胞（Tregs）,以及分泌抑制性细胞因子和代谢物,这是有效的抗肿瘤免疫和免疫治疗的主要障碍。因此,探索EGFR促进肿瘤免疫逃逸和发生发展新机制、逆转抑制性TME是提高EGFR激活的NSCLC患者ICIS疗效的潜在策略。免疫球蛋白样转录子（ILT）4是免疫球蛋白超家族的一种抑制性受体,主要表达于髓系细胞,包括树突状细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板。这些细胞中的ILT4代表其免疫抑制表型,负性调节DC的抗原呈递、中性粒细胞的吞噬、巨噬细胞的成熟和血小板聚集。近年来,我们和其他人发现ILT4还富集于多种实体肿瘤细胞中,并直接诱导其增殖、侵袭和迁移。此外,ILT4与肺腺癌患者的免疫抑制T细胞亚群浸润有关,并预测患者不良预后。这些证据表明ILT4是一个潜在的肿瘤治疗靶点。然而,ILT4在NSCLC细胞中表达的调控机制,以及在免疫微环境和免疫治疗中的作用尚不清楚。TME是癌症不可分割的一部分,它从根本上协调了肿瘤的发生、疾病的进展和治疗的耐药性。在TME的复杂细胞成分中,包括TAMs和失能T细胞在内的免疫细胞在ICI抵抗中起着核心作用。TAMs是TME中最丰富的免疫细胞。大量证据表明,TAMs在肿瘤发生时具有促肿瘤表型,其功能是通过诱导T细胞功能障碍、血管生成以及肿瘤细胞的侵袭和迁移来促进肿瘤的进展。在免疫学角度讲,这些促肿瘤的TAMs既可以直接抑制细胞杀伤功能T淋巴细胞（CTL）反应,也可以通过重塑免疫微环境来间接调节免疫抑制,最终削弱了 ICIS的有效性。除TAMs外,包括CD4+T辅助细胞和CD8+CTL在内的T细胞在抗肿瘤反应中占据最关键和最直接的位置。当CD4+T细胞通过产生干扰素-γ和白细胞介素-2杀死肿瘤细胞并招募肿瘤特异性CTL时,CTL直接通过释放细胞毒颗粒（穿孔素和颗粒酶）或间接通过分泌细胞因子（IFN-γ和肿瘤坏死因子）介导抗肿瘤活性。然而,TME中的T细胞通常由于耗竭或衰老而对肿瘤反应低下,这阻碍了有效的抗肿瘤免疫治疗。虽然针对PD-1/PD-L1信号的ICIS部分逆转了 T细胞的耗竭,但T细胞功能障碍的机制比我们预期的要复杂得多。进一步探索肿瘤介导的免疫抑制机制,通过联合免疫治疗逆转抑制性TME,将为提高ICI疗效提供有效途径。然而,ILT4对TAMs和T细胞介导的EGFR活化NSCLC免疫微环境的作用尚不清楚。因此,全面了解阻断ILT4治疗EGFR活化NSCLC的机制将有利于探索更有效的免疫治疗策略。研究目的本研究将首先明确ILT4在EGFR活化NSCLC中的表达机制和功能作用,发现ILT4可被EGFR-AKT/-ERK1/2信号通路上调表达。其次构建体外肿瘤-TAM/T细胞共培养体系,证实肿瘤细胞中ILT4 一方面可诱导TAMs的募集和M2样极化,应一方面抑制了 T细胞的浸润和细胞杀伤功能。运用全基因的在C57BL/6J小鼠和免疫缺陷的NSG小鼠,证实ILT4不仅可直接促进肿瘤细胞增殖,还可以通过调控M2-TAM和失能T细胞浸润重塑肿瘤微环境,促进小鼠肿瘤生长;ILT4阻断联合PD-L1抑制剂在治疗肿瘤方面显示出协同作用。此外,为明确ILT4阻断是否可增强EGFR突变TKIs耐药和EGFR野生型NSCLC免疫治疗疗效,我们构建EGFR这两类亚型的人源化小鼠肿瘤免疫治疗模型。明确了ILT4阻断与PD-L1抑制剂在EGFR野生型中表现出协同抗肿瘤治疗作用,而在EGFR突变TKIs耐药NSCLC中ILT4阻断单独而非与PD-L1阻断联合显示出了肿瘤治疗疗效。我们的研究确定了在ILT4介导的肿瘤免疫逃逸的新机制,并为EGFR活化NSCLC患者提供了有前途的免疫治疗和联合治疗策略。研究方法1.采用免疫组化检测NSCLC患者组织标本中ILT4的表达和EGFR磷酸化表达水平,并统计分析二者表达的相关性及与患者临床病理参数的关系;2.用EGFR-TKIs/EGF分别刺激EGFR突变/野生型NSCLC细胞,来抑制/激活EGFR活化;或分别敲除/过表达EGFR突变/野生型NSCLC中EGFR,real-time PCR、western blot、免疫荧光和流式细胞术分析人NSCLC细胞系中EGFR活化对ILT4表达的调控作用;3.采用mRNA基因芯片和TCGA数据库分析筛选EGFR调控的信号通路,并通过相应信号通路抑制剂利用western blot确定EGFR诱导肿瘤细胞ILT4表达的特异性分子信号通路;4.敲除EGFR活化NSCLC细胞中ILT4,构建肿瘤细胞与TAM或T细胞的共培养体系,采用Transwell迁移实验、流式细胞术和real-time PCR检测肿瘤细胞ILT4对TAMs募集和极化的影响;通过CFSE增殖实验、凋亡实验、流式细胞术、ELISA和细胞杀伤实验分析肿瘤细胞ILT4对T细胞存活和细胞杀伤功能的影响。5.分别用单抗阻断EGFR活化NSCLC细胞中ILT4和PD-L1,构建肿瘤细胞与TAM或T细胞的共培养体系,如上所述检测TAMs募集和M2样极化及T细胞存活和杀伤水平,验证ILT4联合PD-L1阻断协同逆转了 TAMs/T细胞介导的免疫抑制;6.C57BL/6小鼠皮下注射敲除PIR-B（小鼠ILT4的同源物）的肺癌细胞株LLC,定期给与PD-L1抑制剂治疗,建立肿瘤免疫治疗模型。研究阻断PIR-B及PD-L1单抗治疗对肿瘤生长的影响,用流式细胞术检测小鼠脾脏和外周血中TAMs和T细胞的数量和表型,用免疫组化和免疫荧光检测肿瘤组织中肿瘤TAMs和T细胞的数量和表型。明确PIR-B对肿瘤生长及免疫逃逸的双重影响;7.在NSG小鼠中皮下注射PIR-B敲除的肺癌细胞株LLC构建肿瘤生长模型,观察免疫缺陷小鼠中PIR-B对肿瘤生长的影响;8.将人PBMC尾静脉注射至NSG小鼠,构建人源化免疫系统;分别接种敲除ILT4的吉非替尼耐药PC9（PC9-GR）和EGFR野生型H1299细胞,定期给与PD-L1抗体或对照抗体治疗,建立肿瘤免疫治疗模型。用流式细胞仪检测小鼠脾脏和外周血中TAMs和T细胞的数量和表型,用免疫组化法检测肿瘤组织中TAMs和T细胞的数量和表型。研究结果1.EGFR活化诱导NSCLC细胞ILT4表达在患者NSCLC组织中,我们发现肿瘤细胞ILT4的表达与EGFR磷酸化水平呈明显正相关。在NSCLC细胞系中,证明了 EGFR活化的两种方式,即酪氨酸激酶突变诱导的EGFR激活和配体（EGF）结合依赖的EGFR激活,均上调了 ILT4的表达。2.EGFR通过激活ERK和AKT信号通路介导ILT4表达通过mRNA基因芯片和TCGA大数据分析筛选出EGFR与MAPK,NF-κB,和AKT信号通路密切相关;运用相关通路的特异性抑制剂并WB验证,证实EGFR激活通过ERK和AKT信号通路诱导NSCLC细胞ILT4的表达。3.EGFR活化的NSCLC中ILT4促进TAM募集和M2样极化,抑制T细胞的增殖和细胞杀伤功能利用临床患者肿瘤组织标本及TCGA大数据初步发现肺癌组织ILT4表达与TME中TAMs募集极化及T细胞数量功能有相关性。体外机制研究证实,EGFR活化NSCLC中ILT4通过上调趋化因子CCL2和CCL5表达分泌促进的TAM募集。敲除EGFR活化NSCLC细胞株中ILT4表达,显着降低了其诱导的TAMs的迁移能力;并抑制TAMs中CD206、CD209、IL-10和Arg1等M2样标记物表达,增加了 IL-12、TNFα和IL-6等M1样标记物表达,且削弱了 TAMs诱导的肿瘤免疫抑制作用。敲除EGFR活化NSCLC细胞株中ILT4表达,显着增强了共培养T细胞的增殖、IFN-y的表达分泌水平及杀伤能力。4.ILT4阻断剂在EGFR活化的NSCLC细胞中可与PD-L1抑制剂发挥协同作用,逆转TAM和失能T细胞介导的肿瘤免疫抑制分别用ILT单抗或/和PD-L1单抗预处理EGFR突变、EGFR突变TKIs耐药和EGFR野生型NSCLC肿瘤细胞,然后与TAMs或T细胞共培养。结果发现,阻断上述三种EGFR活化状态的NSCLC细胞中ILT4或PD-L1均抑制了诱导的TAM的迁移能力,而两种抗体的联合应用对TAM的迁移表现出最显着的抑制作用;同时,阻断ILT4或PD-L1可降低TAMs中CD163和CD206的水平,联合抗体组CD163和CD206表达最低。与抗ILT4-或抗PD-L1-预处理肿瘤细胞共培养可提高T细胞的IFN-γ水平、肿瘤杀伤能力和增殖水平,而联合阻断这两种分子则表现出最显着的增加。5.PIR-B和PD-L1阻断剂联合治疗可协同抑制肿瘤生长和免疫逃逸将PIR-B敲除/对照的LLC皮下注射至全基因C57BL/6J小鼠后,腹腔注射PD-L1单抗/对照抗体治疗。结果显示显示PIR-B敲除或PD-L1阻断均可抑制小鼠体内肿瘤的生长,改善T细胞和TAMs介导的免疫抑制TME;二者显示协同治疗作用。NSG小鼠肿瘤生长模型中PIR-B的敲除同样抑制了小鼠体内肿瘤的生长,但变化趋势明显小于全基因的C57BL/6J小鼠,提示免疫系统参与了 PIR-B诱导的肿瘤发生发展。6.ILT4单独阻断而非与PD-L1抑制剂联合可抑制TKI耐药EGFR突变NSCLC的肿瘤进展和免疫逃逸运用TKI耐药EGFR突变型NSCLC细胞系PC9-GR建立了免疫重建NSG小鼠的免疫治疗模型。证实ILT4基因敲除显着抑制了肿瘤生长,增强了脾脏、外周血和肿瘤组织中的T细胞浸润和功能;然而,PD-L1单抗竟然是促进而非抑制了 PC9-GR的肿瘤生长,PD-L1单独阻断或联合ILT4抑制都不会未能改善T细胞上述器官中的浸润。提示单独阻断ILT4而非与ICIs联合,可能是EGFR-TKI耐药的EGFR突变患者一种有效的治疗策略。7.ILT4阻断增强PD-L1抑制剂对EGFR野生型NSCLC的体内治疗疗效敲除EGFR-H1299细胞中ILT4,建立人源化NSG小鼠肿瘤免疫治疗模型。证实ILT4或PD-L1阻断剂均可抑制体内肿瘤的生长,联合治疗对肿瘤生长的抑制作用最为显着;二者协同增强了脾脏、外周血和肿瘤组织中的T细胞的浸润及IFN-γ表达水平。结论1.NSCLC细胞中的ILT4是由EGFR-AKT/-ERK1/2信号通路激活诱导表达的;2.EGFR活化NSCLC中ILT4 一方面可诱导TAM募集和M2样极化,增强TAMs的肿瘤免疫抑制作用;另一方面还可直接抑制T细胞增殖、细胞杀伤作用以及干扰素-γ的表达和分泌。ILT4阻断和PD-L1阻断在体外协同逆转了肿瘤免疫抑制。3.体内研究证实PIR-B不仅促进肿瘤恶性生物学行为,而且诱导了 TAM/T细胞介导的免疫抑制微环境,进而促进肿瘤进展。PIR-B和PD-L1阻断在EGFR活化NSCLC治疗中显示出协同功效。4.人源化小鼠治疗模型中ILT4阻断可增强PD-L1抑制剂对EGFR野生型NSCLC的疗效,但对EGFR突变型NSCLC无影响。
綦霞[8]（2021）在《因多基因遗传疾病发生风险评估而构建的STR分析模型及实验基础》文中进行了进一步梳理背景和目的:短串联重复序列（short tandem repeat,STR）是一种可遗传的短核苷酸重复序列,具有在基因组中分布广泛、高度多态性、高杂合度、低突变率、检测简便快速等优点。自被开发利用以来,已广泛应用于法医学鉴定、遗传制图、疾病基因定位、遗传病的诊断和肿瘤生化与分子生物学研究等诸多领域,是目前应用最广泛的遗传标记。本文根据个体程序化发病理论,研究癌症的发生与STR多态性的关联并建立癌症死亡遗传风险的评估方法;基于STR模型建立多基因遗传现象遗传风险评估方法;探讨胃癌组织STR变异类型和规律并确定肿瘤组织的微卫星不稳定性;研究胃癌患者微卫星不稳定与HLA基因多态性的相关性并探讨可能的机制。方法:1.选取2016年9月至2017年6月大连市第三人民医院经术后病理确诊的肺癌患者50例（男27例,女23例）和肝癌患者50例（男33例,女17例）作为癌症组,选取大连地区健康献血者200例（男100例,女100例）作为对照组。采血并提取基因组DNA后用STR分型技术检测15个STR基因座位,采用Cox回归评估携带或不携带等位基因癌症患者发病年龄的差异,确定患者平均发病年龄有差异的STR等位基因。再采用Logistic二元回归进行交叉验证,确定癌症组与对照组有显着差异的等位基因,找到与癌症相关STR等位基因。将病例对照研究结果转化为队列研究结果,根据死因构成比计算携带两个、一个或不携带癌症相关STR等位基因的个体患肺癌和/或肝癌死亡的概率。2.选取2018年1月至2018年12月到大连市血液中心进行亲子鉴定并证实为亲子关系的396组儿童及其亲生父母的血样,提取基因组DNA后用STR分型技术检测19个STR基因座位,将一个STR基因座位中两个等位基因的串联重复次数模拟为某种疾病发病的定量遗传强度,个体的19个STR基因座位的串联重复次数总和则是该个体的定量遗传强度。计算儿童及其父亲、母亲之间的STR阈值,将前四分之一阈值范围赋值为“1”,而其他样本赋值为“0”。根据有或无疾病组父母所生子女的患病率差异计算遗传一致率,将观察到的遗传一致率与预期的遗传一致率的比值定义为遗传指数,建立STR模型。另选择121名儿童及其亲生父母作手指交叉试验对STR模型进行验证,数据来自于自我报告或电话访谈。3.收集2018年9月至2019年8月大连医科大学附属一院经术后病理确诊为胃癌的患者35例（男23例,女12例）,胃癌石蜡包埋组织来源于病理科,相应的血液样本来源于检验科。采血并提取基因组DNA后用STR分型技术检测所有样本的21个STR基因座位,对比同一个体的肿瘤组织与血液样本的STR分型结果,记录STR变异位点和类型并进行相应的统计,确定MSI和LOH表型。4.对MSI胃癌患者的肿瘤组织和血液样本DNA进行HLA-A、-B、-DR基因座位的扩增,用PCR-SBT技术对HLA-A、-B位点等位基因测序并比较基因频率,网上搜索美国国立医学图书馆文献检索系统NCBI、蛋白质结构数据库PDB以及PROSITE数据库并结合Discovery Studio（DS）软件来分析预测HLA-B*44、HLA-A*02这两种HLA分子与TCR之间的相互作用。结果:1.通过Cox回归和Logistic回归交叉验证,证实D18S51-20为肺癌相关等位基因,D21S11-30.2和D6S1043-18为肝癌相关等位基因。携带或不携带D18S51-20、D21S11-30.2、D6S1043-18等位基因的个体因患癌症死亡的概率为0.115至0.395。2.396名儿童的个体定量遗传强度用条形图表示后可形成近似正态分布的曲线,表明个体定量遗传强度符合多基因遗传现象,经Kolmogorov-Smirnov检验遵循正态分布（p>0.05）。将手指交叉试验的数据代入STR模型,当CHe为0.221时可得到HI为0.950。3.与胃癌患者血液样本STR分型结果相比,同一个体肿瘤组织中可观察到等位基因增加、新等位基因、完全杂合性丢失和部分杂合性丢失4种STR变异类型,前三种可引起基因型改变。21个STR基因座位的变异率为1.43～10.00%,D19S433基因座位变异率最高（10.00%）。35例胃癌患者中有23例肿瘤组织STR等位基因发生了变异,变异率为65.71%（23/35）。只有等位基因增加检出6例,既有等位基因增加又有新等位基因变异检出2例,这两种变异类型均代表着微卫星不稳定性。单独杂合性丢失检出9例,既有微卫星不稳定性又有杂合性丢失的变异为6例。微卫星不稳定性的总发生率为40.00%（14/35）。将大于等于两个基因座位发生微卫星不稳定变异定义为微卫星高度不稳定性（6例）。4.对14例MSI胃癌患者肿瘤组织和血液样本的DNA进行HLA-A,-B,-DR位点的PCR扩增和电泳,显示肿瘤组织的A、B位点扩增结果为阴性,DR位点扩增结果为阳性;而同一个体血液样本A、B、DR位点扩增结果均为阳性。对14例胃癌患者血液样本HLA-A、-B位点测序后计算等位基因频率,HLA-B*44的基因频率（0.1071）高于文献报道的基因频率（0.0205）,经非参数检验中的二项检验分析,两者有统计学差异（p=0.019,p<0.05）。从生物信息学角度分析发现,HLA对TCR的亲和性排序为:HLA-B*44>HLA-A*02。HLA-B*44和TCR形成非键相互作用的主要位点为82GLU、86ARG、89GLN,而HLA-A*02在这三个位点没有和TCR形成主要的非键相互作用。但两种分子也存在着共同位点（93位、96位、100位、103位）的驱动力来稳定与TCR的结合。结论:1.根据程序化发病理论和STR遗传标记分析可以创建一种有效的评估个体遗传风险的分析方法,并可以用来评估个体癌症死亡遗传风险。2.成功建立了可以分析多基因遗传现象的STR模型并用实际家系调查资料（手指交叉试验）证实STR模型的准确性。可用STR模型评估多基因遗传现象在一级亲属中的遗传风险或评估多基因遗传现象在不相关人群中的发生率。3.肿瘤组织可能存在STR基因型改变;通过比较肿瘤组织和血液样本STR等位基因的变异情况可能确定胃癌MSI表型。STR遗传标记有可能作为胃癌患者的诊断标记物和免疫治疗敏感性标记物。4.HLA-B*44可能与胃癌MSI表型存在相关性,具有高度多态性的HLA I类分子的缺失可能与肿瘤的发生、发展、免疫疗法疗效预测有关。5.造成HLA-B*44-TCR复合物的结合亲和力比HLA-A*02-TCR复合物的结合亲和力更强的位点可能是82位、86位、89位,而93位、96位、100位、103位这四个位点对于HLA与TCR结合比较重要,如果在此处发生突变,容易导致驱动力的减弱或丧失,增加肿瘤免疫逃逸的风险。
曹金龙[9]（2021）在《基于机器学习对膀胱癌免疫分子亚型和微环境特征的综合分析》文中提出目的:本研究旨在利用机器学习相关原理对膀胱癌的免疫分子亚型及免疫逃逸的潜在分子机制进行研究,并探索亚型与免疫相关特征的相互联系。方法:从癌症基因组图谱（The Cancer Genomic Atlas,TCGA）数据库中下载膀胱癌转录组数据及单核苷酸变异（simple nucleotide variation,SNV）数据,样本包括412个肿瘤及19个癌旁组织,数据提取和后续分析均使用R 4.0.0软件。使用edge R包进行差异表达基因（Differential Expressed Genes,DEGs）分析,通过与从IMMport数据库获取的1830个免疫相关基因进行求交集运算,获得膀胱癌中差异表达的免疫基因。接着,以膀胱癌中差异表达免疫基因的表达谱作为特征变量,使用Consensus Cluster Plus包无监督聚类分析识别膀胱癌免疫分子亚型。通过比较不同亚型的各类临床特征、免疫细胞浸润、检查点基因及人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）基因表达、肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden,TMB）等,对比了各亚型之间的各种临床和免疫学特征的差异。然后,对各亚型中差异表达的免疫相关基因进行加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Coexpression Network Analysis,WGCNA）分为不同基因模块,并对各模块内基因进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析以探索与肿瘤免疫分子亚型及不同亚型转化相关的主要生物学通路。最后,我们使用与免疫分子亚型最相关的模块基因作为变量,通过随机森林原理筛选特征变量和构建决策树模型。并随机选择训练集内30%的样本进行内部验证,以及基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）的GSE133624作为外部验证集进行外部验证。结果:对膀胱癌转录组数据的癌与癌旁的差异表达分析得到3203个DEGs,与1830个免疫基因交集运算后筛选得到303个差异表达的免疫基因。以这些基因的表达谱为特征变量,鉴定出4种膀胱癌免疫分子亚型。在四个亚型中,cluster2临床预后较好,免疫细胞、免疫检查点及HLA基因的表达均为最低,即发生免疫逃逸的程度最为严重。对SNV数据的分析显示cluster 2较其他亚型突变频率较高,TMB最高。这些特征均符合免疫治疗应答者的一般特征,提示cluster 2患者的免疫治疗效果较好。而cluster 4各项免疫特征表达较高,与正常膀胱组织的免疫微环境特征相似,发生免疫逃逸程度最轻。接着WGCNA分析将膀胱癌中差异表达的免疫基因分为6个模块,其中棕色基因模块与免疫分子亚型最为相关。KEGG富集分析显示与亚型相关的通路有MAPK、Rap1、Ras、IL-17、Erb B、B细胞受体等,这些通路参与了膀胱癌免疫逃逸及免疫分子亚型的形成。最后,通过随机森林原理筛选棕色模块内的ANXA6,NRP2,TGFB3,GREM1及FGF7五个基因作为特征变量构建决策树模型,其在训练集中准确性为90.5%,内部验证准确性为91.8%。对外部验证集GSE133624的分析显示,预测的各亚型的患者免疫特征与训练集中保持较高一致。这说明模型具有较好的普遍适用性,可准确预测临床膀胱癌测序患者的免疫分子亚型。结论:本研究主要结论如下:1、膀胱癌患者根据差异表达免疫基因可分为4种亚型,不同亚型患者的临床特征不同,其中cluster 2预后较好,cluster 4预后最差。2、四种免疫分子亚型发生了不同程度的免疫逃逸,其中cluster 2发生免疫逃逸程度最为严重,其次为cluster 1,cluster 3,cluster 4。cluster 4亚型的肿瘤微环境免疫特征与正常膀胱组织几乎类似。3、cluster 2亚型患者群体的各项免疫特征符合免疫治疗应答者的特征,提示该亚型可能有较好的免疫治疗效果。4、与膀胱癌免疫分子亚型及免疫逃逸相关的潜在分子通路有MAPK、Rap1、Ras、IL-17、Erb B、B细胞受体等信号通路。5、通过构建决策树模型,可实现对膀胱癌测序患者进行准确的免疫分子亚型分析及免疫治疗的疗效预测。综上,我们探索了膀胱癌的免疫分子亚型及其亚型分化的潜在分子机制,这些结果可能为膀胱癌免疫治疗策略的制定提供指导。
张楠[10]（2020）在《乙型脑炎病毒诱导髓源抑制性细胞及CD3阳性巨噬细胞分化的研究》文中研究表明乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是黄病毒家族的重要成员之一,是一种典型的人畜共患传染性疾病病原,在世界范围内造成了巨大的社会和经济损失。在我国由于疫苗的接种,人群中的乙脑发病率已得到了有效控制,但养殖业中发病情况及经济损失仍十分严重。JEV进入机体后首先引发免疫逃逸为入侵中枢神经系统（central nervous system,CNS）创造机会,而JEV进入CNS之后会诱发强烈的炎症反应。对于JEV调控机体免疫反应的深入研究将有利于相关治疗及防治手段的开发,然而对于JEV如何调控机体免疫系统的响应和进程目前尚缺少详细的研究。我们对于JEV感染后小鼠脑组织中浸润细胞的研究表明,浸润细胞以M-MDSCs为主,同时M-MDSCs向CD3+巨噬细胞进一步分化。髓源抑制性细胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSCs）是近年来发现的免疫系统中主要的调节性细胞,在多种疾病中发挥了关键作用,而MDSCs同时也是一群异质性细胞。因此对于JEV感染模型中MDSCs的深入研究不仅有利于揭示JEV等黄病毒通过调控免疫系统进而致病的内在机制也有利加强学术界对MDSCs的深入理解。首先,本研究采用尾静脉注射JEV P3于C57BL/6-GFP骨髓移植小鼠中,流式检测分析感染后脑组织中的浸润细胞类型。结果表明:JEV P3的感染诱导的脑组织浸润细胞以M-MDSCs为主,同时M-MDSCs向CD3阳性巨噬细胞分化。JEV感染后脾脏组织中的M-MDSCs比例也显着增加。M-MDSCs的T细胞增殖抑制实验表明:JEV P3诱导脾脏和脑组织中的M-MDSCs均具有T细胞增殖抑制能力,并且可通过ARG1和i NOS两条通路发挥抑制作用。其次,我们分别采用了脾脏摘除模型和缓释ATRA的MDSCs剔除模型,探究MDSCs的来源以及对JEV致病性的影响。结果表明:JEV P3诱导的MDSCs主要来源于骨髓,经血液进入CNS,同时MDSCs的剔除显着增加了JEV感染后小鼠的存活率。随后,对于JEV P3诱导MDSCs的转录组学分析发现ZBP1-IRF7信号通路的相关基因在JEV所诱导的M-MDSCs中上调较为明显。重组突变病毒的感染实验、慢病毒的过表达实验以及IRF7缺失小鼠的体外实验表明:JEV可通过NS1’和NS5共同诱导M-MDSCs的产生,而MDSCs的产生及功能发挥主要是通过ZBP1-IRF7信号通路介导的。最后,我们对于MDSCs浸润CNS的介导因子及CD3+巨噬细胞的分化条件的分析表明:MDSCs可通过星形胶质和神经元细胞来源的CCL2/N-CCL2趋化进入CNS并在微环境中M-CSF、IL-6、IFN-γ的介导下分化为CD3+巨噬细胞。而CD3+巨噬细胞的转录组学分析显示ZBP1-IRF7信号通路同样在CD3+巨噬细胞的分化过程中也发挥了重要作用。综上所述,本研究详细研究了JEV P3的NS1’和NS5蛋白通过ZBP1-IRF7信号通路诱导M-MDSCs的产生过程,M-MDSCs浸润CNS的介导因子以及其向CD3+巨噬细胞分化的诱导条件。这些研究将有助于通过靶向免疫系统进而治疗乙型脑炎相关治疗手段的开发和应用,也为其他MDSCs发挥主要作用的疾病研究提供了借鉴。
二、HLA表型与肿瘤逃逸（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HLA表型与肿瘤逃逸（论文提纲范文）
（1）HLA-Ⅰ类在肺癌免疫治疗中相关研究进展（论文提纲范文）
| 1 认识HLA结构及功能 |
| 2 HLA-Ⅰ类分子在肺癌免疫治疗中相关研究 |
| 2.1 HLA-Ⅰ类分子介导肺癌免疫逃逸及影响免疫治疗疗效 |
| 2.1.1 HLA LOH与HLA-Ⅰ类多样性 |
| 2.1.2 β2-微球蛋白突变 |
| 2.1.3 HLA体细胞突变 |
| 2.2 HLA-Ⅰ类缺失与肺癌免疫细胞浸润及肿瘤组织结构关系 |
| 2.3 HLA-Ⅰ类与PD-L1及TMB的关系 |
| 3 小结 |
（2）西黄丸抑制乳腺癌上皮间质转化和免疫逃逸的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 IFN-γ介导肿瘤免疫逃逸分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一部分 西黄丸水提液抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞上皮间质转化 |
| 前言 |
| 试剂与设备 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 中药网络药理学和基因表达谱分析西黄丸治疗乳腺癌的作用机制 |
| 前言 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 西黄丸有效成分对关键免疫检查点PD-L1表达的影响 |
| 前言 |
| 试剂与设备 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 西黄丸有效成分对单核细胞亚群比例及HLA-DR表达的影响 |
| 前言 |
| 试剂与设备 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 ILT4对非小细胞肺癌血管生成的作用和预后分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4调控非小细胞肺癌血管内皮细胞迁移和血管生成的机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分体内验证ILT4通过诱导血管生成促进肿瘤进展 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述:ILT4和VEGF-A的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分: 肺腺癌中ILT4过表达与免疫抑制性T细胞亚群浸润及患者的不良预后相关 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 肿瘤源性ILT4通过抑制T细胞增殖及诱导T细胞凋亡介导肿瘤免疫逃逸 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌与免疫抑制细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（5）肝癌免疫微环境空间异质性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二,实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、肝细胞肝癌中存在免疫微环境异质性 |
| 二,肝癌中T细胞亚群存在着显着的空间分布差异,交界区域表现出特殊的T细胞构成特点 |
| 三,肝癌交界区富集双阳性T细胞的表型和功能分析 |
| 四,交界区双阳性T细胞是肝癌中重要的预后因子,并存在于多癌种中并具有相近的表型 |
| 五,单细胞测序分析深度解析肝癌双阳性T细胞的表达谱特点和生物学特征 |
| 六,多维度分析肝癌交界区双阳性T细胞的谱系起源 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 单细胞质谱流式技术在肿瘤学研究中的意义 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 炎症、肿瘤和免疫: 微环境中的密切交流 |
| 一、肿瘤中炎症的类型 |
| 二、炎症与肿瘤的发生发展 |
| 三、炎症反应的关键信号通路与肿瘤 |
| 四、炎症和肿瘤免疫 |
| 五、靶向炎症反应和肿瘤治疗 |
| 六、总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论着 |
（7）ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分E GFR激活AKT/ERK1/2信号通路上调非小细胞肺癌中ILT4表达 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4促进TAM-和失能T细胞介导的EGFR活化NSCLC免疫逃逸 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 阻断EGFR活化NSCLC中ILT4增强了PD-L1免疫治疗疗效 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第四部分 ILT4阻断可增强EGFR野生型,而非EGFR突变TKIs耐药NSCLC中PD-L1抑制剂疗效 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（8）因多基因遗传疾病发生风险评估而构建的STR分析模型及实验基础（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 根据程序化发病理论对个体进行遗传风险分析(以肺癌和肝癌为例) |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 DNA的提取 |
| 2.2 DNA浓度及纯度检测 |
| 2.3 STR等位基因的检测 |
| 2.4 数据分析 |
| (二)结果 |
| 1.用 Cox回归对肺癌患者的发病年龄进行评估并用 Logistic回归进行交叉验证 |
| 2.用 Cox回归对肝癌患者的发病年龄进行评估并用 Logistic回归进行交叉验证 |
| 3.根据携带的癌症相关等位基因频率计算癌症死亡概率 |
| (三)讨论 |
| (四)结论 |
| (五)参考文献 |
| 第二章 利用STR模型评估多基因遗传疾病遗传风险的研究 |
| (一)材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 分析模型的理论基础 |
| 2.2 STR等位基因的检测 |
| 2.3 建立STR模型 |
| 2.4 遗传指数 |
| 2.5 将手指交叉试验数据作为HI的实际数据 |
| (二)结果 |
| 1.STR分型结果 |
| 2.儿童的STR个体遗传强度呈正态分布 |
| 3.手指交叉试验验证STR模型 |
| (三)讨论 |
| (四)结论 |
| (五)参考文献 |
| 第三章 利用STR分型技术评价肿瘤组织的微卫星DNA异常(以胃癌为例) |
| (一)材料与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.主要试剂和仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 全血DNA的提取 |
| 3.2 石蜡切片组织 DNA 的提取 |
| 3.3 DNA质量检测 |
| 3.4 STR等位基因的检测 |
| (二)结果 |
| 1.血液样本和肿瘤组织的STR分型结果 |
| 2.胃癌组织STR变异类型 |
| 2.1 等位基因增加(Additional alleles,Aadd) |
| 2.2 新等位基因(New alleles,Anew) |
| 2.3 完全杂合性丢失(complete loss of heterozygosity,LOH) |
| 2.4 部分杂合性丢失(partial loss of heterozygosity,pLOH) |
| 3.STR等位基因变异的统计 |
| 4.STR变异例数的统计 |
| (三)讨论 |
| (四)结论 |
| (五)参考文献 |
| 第四章 MSI表型胃癌与HLA的关联及生物信息学机制探讨 |
| (一)材料与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.主要试剂和仪器 |
| 2.1 试剂 |
| 2.2 仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 HLA基因分型 |
| 3.2 统计学分析 |
| 4.HLA分子生物信息学研究 |
| 4.1 搜索uniprot数据库 |
| 4.2 采用Discovery Studio(DS)软件进行分子模拟 |
| (二)结果 |
| 1.MSI胃癌样本PCR扩增HLA-A, -B, -DRB1 结果 |
| 2.HLA-A, -B基因测序结果 |
| 3.MSI胃癌患者与中国正常人群基因频率的比较 |
| 4.生物信息学分析 |
| 4.1 HLA蛋白质分子结构的构建 |
| 4.2 HLA与 TCR结合模式的分析 |
| (三)讨论 |
| (四)结论 |
| (五)参考文献 |
| 全文总结 |
| 工作展望 |
| 综述 微卫星DNA与肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文名词对照表 |
| 附录 作者简介 |
| 附录 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）基于机器学习对膀胱癌免疫分子亚型和微环境特征的综合分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 膀胱癌与免疫治疗概述 |
| 1.2 膀胱癌免疫应答预测标记物的研究现状 |
| 1.3 机器学习在膀胱癌研究中的应用 |
| 1.4 本课题的研究内容简介 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料及分析流程 |
| 2.2 识别膀胱癌免疫分子亚型 |
| 2.3 不同亚型的临床特征差异 |
| 2.4 不同亚型免疫特征的对比 |
| 2.5 不同亚型单核苷酸突变的差异 |
| 2.6 加权基因共表达网络分析和通路富集分析 |
| 2.7 构建决策树模型 |
| 2.8 内部验证和外部验证 |
| 2.9 本研究中使用的R包及网站汇总 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 基于差异表达的免疫基因识别膀胱癌亚型 |
| 3.2 四种亚型的临床特征差异 |
| 3.3 四种亚型的免疫特征分布差异 |
| 3.4 四种亚型间单核苷酸突变的差异 |
| 3.5 WGCNA分析和KEGG通路富集分析 |
| 3.6 决策树模型的构建 |
| 3.7 决策树模型的内部和外部验证 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱癌免疫治疗的研究进展与诊疗现状 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）乙型脑炎病毒诱导髓源抑制性细胞及CD3阳性巨噬细胞分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(ABBREVIATION) |
| 1 前言 |
| 1.1 乙型脑炎病毒 |
| 1.1.1 乙型脑炎病毒的发现 |
| 1.1.2 乙型脑炎病毒的危害 |
| 1.1.3 乙型脑炎病毒的病原学特征 |
| 1.1.4 乙型脑炎病毒的致病机制 |
| 1.1.5 乙型脑炎病毒的免疫逃逸 |
| 1.1.6 乙型脑炎的治疗 |
| 1.2 髓源抑制性细胞 |
| 1.2.1 髓源抑制性细胞的发现 |
| 1.2.2 小鼠髓源抑制性细胞 |
| 1.2.3 人髓源抑制性细胞 |
| 1.2.4 髓源抑制性细胞的扩增和募集 |
| 1.2.5 髓源抑制性细胞的免疫抑制机制 |
| 1.2.6 靶向髓源抑制性细胞的治疗 |
| 1.2.7 在感染性疾病中髓源抑制性细胞的驱动因素 |
| 1.2.8 在感染性疾病中髓源抑制性细胞扩增的结果 |
| 1.3 CD3阳性巨噬细胞 |
| 1.3.1 巨噬细胞的分类 |
| 1.3.2 CD3阳性巨噬细胞的研究进展 |
| 2 目的及意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 毒株、细胞、菌株与实验动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 主要药品和试剂 |
| 3.1.4 主要培养基及其配方 |
| 3.1.5 溶液及其配制 |
| 3.1.6 细胞流式相关抗体 |
| 3.1.7 实验所用手术器械 |
| 3.1.8 重要仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞复苏与培养 |
| 3.2.2 JEV的扩增与毒价滴定 |
| 3.2.3 GFP骨髓移植小鼠的制备 |
| 3.2.4 JEV感染C57BL/6 小鼠 |
| 3.2.5 脑组织浸润细胞的分离 |
| 3.2.6 脾脏摘除实验 |
| 3.2.7 总RNA的提取 |
| 3.2.8 基因克隆与质粒构建 |
| 3.2.9 质粒转染 |
| 3.2.10 慢病毒包装与感染 |
| 3.2.11 荧光定量PCR检测 |
| 3.2.12 体外细胞共培养实验 |
| 3.2.13 巨噬细胞的体外诱导 |
| 3.2.14 小鼠CCL2蛋白的纯化 |
| 3.2.15 过氧亚硝酸的制备 |
| 3.2.16 硝基化蛋白质的制备 |
| 3.2.17 细胞钙流检测 |
| 3.2.18 统计学分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 乙型脑炎脑组织浸润细胞的鉴定 |
| 4.1.1 乙型脑炎脑组织浸润细胞的分离 |
| 4.1.2 乙型脑炎脑组织浸润细胞主要为M-MDSCs并向CD3 阳性巨噬细胞进一步分化 |
| 4.2 外周组织中MDSCS的分析 |
| 4.2.1 JEV P3 感染增加了脾脏组织中MDSCs的比例 |
| 4.2.2 脾脏及脑组织中的MDSCs均对T细胞增殖具有抑制作用 |
| 4.2.3 JEV感染诱导的MDSCs主要由骨髓产生且对JEV P3 株致病性至关重要 |
| 4.3 JEV诱导MDSCS产生的研究 |
| 4.3.1 JEV不同突变体的构建 |
| 4.3.2 JEV不同突变体的拯救 |
| 4.3.3 JEV的 NS1'和NS5 蛋白共同诱导了MDSCs的产生 |
| 4.3.4 JEV诱导MDSCs的转录组学分析 |
| 4.4 JEV通过IRF7 通路诱导MDSCS产生的研究 |
| 4.4.1 JEV诱导MDSCs中 ZBP1、IRF7、PHF11b等基因的上调表达 |
| 4.4.2 IRF7-V1 的过表达诱导了MDSCs的产生及相关基因的上调表达 |
| 4.4.3 IRF7 缺失影响了JEV对 MDSCs的诱导作用 |
| 4.5 JEV P3 诱导ZBP1及IRF7 表达的研究 |
| 4.5.1 JEV P3 NS1、NS1'及NS5 蛋白的克隆 |
| 4.5.2 JEV P3的NS5 具有ZBP1及IRF7 的启动子活性 |
| 4.6 N-CCL2的检测及生物学活性分析 |
| 4.6.1 JEV诱导了脑组织中CCL2及N-CCL2 的产生 |
| 4.6.2 乙型脑炎模型中CCL2主要来源于星形胶质细胞 |
| 4.6.3 CCL2的制备 |
| 4.6.4 过氧亚硝酸的制备 |
| 4.6.5 硝基化蛋白质的制备 |
| 4.6.6 N-CCL2 具有对CCR2~+细胞的生物学活性 |
| 4.7 JEV P3 诱导CD3 阳性巨噬细胞分化的研究 |
| 4.7.1 发病小鼠脑匀浆上清诱导了CD3阳性巨噬细胞的分化 |
| 4.7.2 发病小鼠脑匀浆上清诱导了T细胞相关信号通路的活化 |
| 4.7.3 CD3阳性巨噬细胞的转录组学分析 |
| 4.7.4 M-CSF与 IL-2、IL-6、IFN-γ可诱导CD3 阳性巨噬细胞的产生 |
| 4.7.5 小鼠脑组织中M-CSF、IL-2、IL-6、IFN-γ的检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 JEV引发的免疫逃逸 |
| 5.2 MDSCS对 T细胞免疫应答的调控 |
| 5.3 MDSCS与感染性疾病的关系 |
| 5.4 IRF7与MDSCS的产生 |
| 5.5 CD3阳性巨噬细胞的产生 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、HLA表型与肿瘤逃逸（论文参考文献）
- [1]HLA-Ⅰ类在肺癌免疫治疗中相关研究进展[J]. 王静,魏素菊. 中国免疫学杂志, 2021(19)
- [2]西黄丸抑制乳腺癌上皮间质转化和免疫逃逸的分子机制[D]. 杨忖卿. 中国中医科学院, 2021
- [3]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
- [4]ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸[D]. 李青. 山东大学, 2021(10)
- [5]肝癌免疫微环境空间异质性研究[D]. 郑博. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [6]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
- [7]ILT4诱导EGFR活化非小细胞肺癌免疫抑制微环境的机制及参与免疫治疗的研究[D]. 陈小徵. 山东大学, 2021(10)
- [8]因多基因遗传疾病发生风险评估而构建的STR分析模型及实验基础[D]. 綦霞. 大连医科大学, 2021(01)
- [9]基于机器学习对膀胱癌免疫分子亚型和微环境特征的综合分析[D]. 曹金龙. 兰州大学, 2021(12)
- [10]乙型脑炎病毒诱导髓源抑制性细胞及CD3阳性巨噬细胞分化的研究[D]. 张楠. 华中农业大学, 2020(04)
标签：肿瘤论文; 淋巴瘤论文; 西黄丸论文; 弥漫大b细胞淋巴瘤论文; 肿瘤免疫论文;