一、番鸭细小病毒琼扩抗原研制及初步应用（论文文献综述）
孔桂慧[1]（2021）在《鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究》文中指出鸭新型呼肠孤病毒病是由鸭新型呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）引起的一种鸭禽传染病,其典型病变特征为肝脏肿大出血、脾脏坏死、鸭只体重减轻。2017年11月,菏泽地区商品鸭场的10日龄樱桃谷鸭出现以肝脏肿大出血、脾脏坏死为特征的传染病,对养殖业造成了巨大损失。本研究为该病的有效防控提供了技术支持。主要内容包括:1.NDRV的分离鉴定无菌取菏泽地区10日龄商品代樱桃谷肉鸭的肝脏、脾脏并研磨,将病料过滤后分别接种SPF鸡胚、SPF鸭胚、鸭胚成纤维细胞（DEF细胞）和非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）,培养3～5 d后,收集死亡胚体尿囊液和病变细胞上清液使用NDRVσC基因特异性引物进行RT-PCR鉴定及测序分析。结果显示,分离到1株NDRV,命名为NDRV017株,该分离株与NCBI上9株NDRV参考毒株的相似性在95.3～99%之间。2.灭活疫苗的初步研制将病毒液接种到Vero细胞,待细胞病变程度达80%时,使用3‰甲醛灭活36h,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。3.灭活疫苗的免疫原性探究将种鸭二免后28 d的种蛋孵化出的1日龄雏鸭作为试验鸭,同时设同批次未免疫种鸭的后代作为阴性对照,人工感染用NDRV株为NDRV017E3株。阴性对照组腿肌接种灭菌PBS 0.8 m L,其余三组分别腿肌接种等体积8个ELD50的NDRV017E3株（病毒含量为4.50×105/羽）,攻毒10 d后处死动物并采集脾脏组织。以脾脏是否坏死作为判断指标,发现母源抗体对雏鸭的保护率为53.3%,卵黄抗体对雏鸭的保护率为40%,与阳性对照组相比,母源抗体可有效降低雏鸭感染NDRV风险（P<0.05）,对雏鸭具有较好地保护作用;统计各组体重的增重情况,结果显示,与阴性对照组相比,阳性对照组雏鸭体重降低16%（P<0.05）,母源抗体组、卵黄抗体组分别降低4.57%（P>0.05）、9.43%（P>0.05）。结果表明,樱桃谷种鸭免疫该疫苗28 d后,50%以上的后代雏鸭可通过携带的母源抗体获得保护,优于市场上商品疫苗的免疫保护效果。
刘臻臻[2]（2021）在《死胚和弱雏中新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定》文中研究指明新型鸭呼肠孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）病是我国养鸭业近几年较为常见的一种以肝脾不规则状坏死、出血为主要特点的疾病。雏鸭感染后出现精神萎靡,被毛粗乱,采食量饮水量下降等症状,并伴有死亡现象。NDRV是可垂直传播的免疫抑制性病原,感染后可造成机体的免疫力下降,易引发混合感染及继发感染,导致鸭群的死亡和淘汰,给我国养鸭业造成了严重的经济损失。本研究从泰安新希望六合孵化场定期采集新鲜病料,利用PCR技术检测NDRV的感染率,并在此基础上对采集病料中的10株NDRV的σC基因序列进行测序分析,选取一株致鸭胚病变明显且无其他病原感染的NDRV分离株进行致病性试验,以期为新型鸭呼肠孤病毒病的科学防控、疫苗研发提供可靠的理论依据。为了解该病在山东多地的流行情况,本研究分9个批次采集了497份新鲜病料,包括死胚332份,弱雏110份,未受精蛋55份,进行PCR检测,结果表明NDRV的总感染率为52.7%,其中死胚中的检出率为53.9%,弱雏中的检出率为26.3%,未受精蛋中的检出率最高,为98.2%。为确定新分离毒株与呼肠孤病毒已有毒株的亲缘性关系,本研究扩增了10株NDRV分离株的σC基因序列,并利用MEGA 7.0和Meg Align软件进行进化树的构建及同源性分析。分析结果显示NDRV、番鸭呼肠孤病毒（muscovy duck reovirus,MDRV）、禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）分别处于不同的进化分支,NDRV与MDRV同属于水禽源呼肠孤病毒。分离株中SD-22、SD-11、SD-62相互彼此靠近,与TH11毒株亲缘关系最近,其余7株彼此接近。10株分离株之间的同源性为94.1%～99.9%,与NDRV参考株的同源性为93.5%～97.4%,与ARV的同源性最低,仅为38.8%～43.2%。本研究从10株NDRV分离株中,选取致鸭胚病变明显且无其他病原感染的SD-32毒株,接种DF1细胞后可产生明显的细胞病变（cytopathic effect,CPE）,观察记录病变并测定其TCID50为10-6.052/0.1m L。将70只健康的1日龄樱桃谷鸭雏鸭随机分为两组,每组35只。感染组腿部肌肉注射0.2m L的病毒液,对照组注射等量的无菌生理盐水。监测其临床症状、剖检病变及体重变化,并在1DPI、3DPI、5DPI、7DPI、14DPI及21DPI,每组随机选取4只鸭子剖杀。检测免疫器官指数,各组织器官病毒载量,血清中IL-4、IL-6、IFN-ɑ、IFN-γ的含量等变化。结果表明,1日龄雏鸭感染后无自然死亡,出现精神不振、白色稀粪症状。剖检可见心、肝、脾不同程度的出血及坏死,胸腺肿大,针尖状出血,体重增长受到抑制。免疫器官指数结果表明,5DPI胸腺指数显着低于对照组,7DPI脾脏指数显着低于对照组,14DPI胸腺、法氏囊指数显着低于对照组。血清中在1DPI就能检测到病毒存在,3DPI出现第一个排毒高峰,21DPI出现第二个小高峰。各组织病毒载量结果显示,1DPI各组织均能检测到病毒的存在,脾中的病毒含量最高,各组织器官的病毒载量变化趋势与血清病毒载量变化趋势基本吻合。血清中细胞因子变化结果显示,IL-4、IL-6含量在5DPI极显着上调,IFN-ɑ、IFN-γ含量在5DPI显着上调,细胞因子表达形式多样。
陈雪明[3]（2021）在《鹅细小病毒单抗的制备及初步应用》文中指出小鹅瘟（Gosling plague）是由鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）引起的一月龄以内雏鹅、雏番鸭的一种急性、接触性、败血性传染病,该病传播速度快,病程短,死亡率高,死亡率在95%以上,严重时可达100%。临床以败血症、卡他性、纤维素性坏死性肠炎为主要特征。尽管在我国广泛使用各种鹅细小病毒疫苗进行免疫;但是,仍未完全控制该病在我国一些鹅群中暴发和流行,目前,该病依然严重威胁我国养鹅业的健康发展。近年来,肌肉注射具有中和活性的单克隆抗体已被证明是一种快速、有效的预防病毒等感染的方法,具有广阔的应用前景。本研究从病料中分离得到的病毒经PCR扩增、测序及基因进化分析后确定为鹅细小病毒,将其命名为DWY株。将DWY在鹅成纤维细胞上培养扩增,浓缩纯化后与弗氏佐剂混合乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。将骨髓瘤细胞（SP2/0）与免疫后小鼠的脾细胞在PEG的作用下进行细胞融合,采用间接ELISA方法对融合后的杂交瘤细胞进行筛选,并对OD450nm数值最高孔进行亚克隆。以获得的杂交瘤细胞培养上清作为一抗,SP2/0细胞培养上清作对照进行间接免疫荧光试验。利用获得的细胞株接种小鼠腹腔制备腹水,将收获的腹水纯化后对抗体亚型进行测定和微量细胞中和试验,确定单抗是否具有中和活性;按照100LD50的剂量对1日龄雏鹅进行攻毒,分别在攻毒后24 h、48 h按照10 mg/kg体重的剂量肌肉注射5H3用于治疗,并在攻毒后第5天取对照组与实验组雏鹅小肠,制作切片进行免疫组化试验。结果显示6株杂交瘤细胞分泌的抗体均为Ig G型,其中1A6、3F5、4D8重链为Ig G1型,2C5、5H3、6B9重链为Ig G2b,轻链均为λ链。6株单抗均能与鹅细小病毒接种的GEF发生特性反应,细胞核内出现特异性绿色荧光。中和试验表明5H3细胞株分泌的抗体具有中和活性,其腹水中和效价在1:104。雏鹅攻毒保护性试验表明,雏鹅感染鹅细小病毒48 h内按照10 mg/kg的剂量注射5H3单抗对发病雏鹅的保护率为100%。免疫组化显示,经过单抗治疗存活的雏鹅肠道内GPV基本上被完全清除,而未经单抗治疗的对照组雏鹅肠道内检测有大量抗原存在。在雏鹅感染鹅细小病毒48 h内按照10 mg/kg体重剂量肌注5H3对雏鹅具有100%的保护率。5H3不仅为鹅细小病毒病的防控提供了一种新方法和思路,同时也为GPV蛋白表位鉴定、蛋白空间结构和功能研究以及后续基因工程抗体的研究奠定了基础。
姜煜晨[4]（2021）在《江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究》文中研究表明小鹅瘟（Gosling Plague,GP）是一种由鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起 1-20日龄雏鹅或雏番鸭的高度接触性、传播性、高致病性和高死亡率的急性或亚急性败血性传染病,严重危害养鹅业的发展。虽然小鹅瘟弱毒疫苗及卵黄抗体的使用对小鹅瘟的控制发挥了重要作用,但小鹅瘟依然有流行趋势。本研究在对江苏地区小鹅瘟分子流行情况初步了解基础上,对GPV-CZM、CZM-70和CZM-142进行了全基因序列分析,并对细胞适应毒CZM-142进行了动物攻毒保护实验相关的研究。1 2019-2020年江苏地区小鹅瘟分子流行调查为了解江苏地区小鹅瘟的流行情况,于2019年到2020年采集来自扬州大学动物医院的疑似小鹅瘟病例的肠道和肝脏等样品,共分离到30份GPV分离株。从流行季节来看,以春夏两季所得到的分离株较多;从临床脏器病变情况来看,主要以肠道症状为主。对所有GPV分离株的主要结构基因VP3进行测序,并对其基因序列、遗传进化、糖基化位点和基因重组测试进行分析研究。结果表明:30株GPV分离株的VP3全长均为1605bp,编码534个氨基酸,与GenBank中已发表的经典GPV-VP3序列同源性为95.2%-100%,氨基酸序列同源性为97.6%-100%,分离株集中分布在同一亚群中,与经典GPV株亲缘关系较近,说明遗传进化相对保守。所有分离株均有5个糖基化位点,比标准B株少505-508位NRTS糖基化位点。重组事件分析发现,现有分离株病毒没有重组情况的发生。2不同代次CZM株病毒全基因分析本研究选取GPV-CZM、CZM-70和CZM-142三株病毒进行了全基因测序和致病性试验。致病性试验结果表明,与其他代次毒株相比,CZM-142株在雏鹅的发病、致死率、体重等方面的影响是最小的,可以作为潜在的细胞弱毒疫苗候选株。全基因测序结果发现,三株病毒的全长均为5106bp。与GPV-CZM相比,CZM-142株基因存在79个核苷酸差异位点,其中,非编码区有32个核苷酸差异位点;编码区中有16个核苷酸差异位点位于NS片段,31个位于VP片段,不存在碱基的插入与缺失。氨基酸方面有8个位于NS蛋白,25个位于VP蛋白,其中部分氨基酸位点差异通过分析发现可能与细胞致弱机制有关。3细胞适应毒CZM-142动物攻毒保护实验为了解小鹅瘟细胞适应毒CZM-142对野毒攻毒保护的免疫效果,本研究将CZM-142适应毒分别以625、1250、2500和5000TCID50免疫剂量免疫1日龄雏鹅,并在免疫后第6天进行强毒100LD50的攻毒试验。结果发现,2500和5000TCID50剂量CZM-142适应毒免疫后不仅能产生较高抗体水平,而且均能有效保护雏鹅不发病,强毒对照组雏鹅全部发病死亡,说明2500个TCID50剂量的CZM-142适应毒就能有效保护100LD50的强毒感染,提示小鹅瘟细胞适应毒CZM-142株有望成为小鹅瘟病毒细胞弱毒疫苗候选株并应用于小鹅瘟的防控。
罗丹[5]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立》文中进行了进一步梳理新型鸭呼肠孤病毒病是由新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）引起的以雏鸭肝脾出血或坏死为主要特征的免疫抑制病。自2017年以来,该病在我国养鸭主产省份及地区相继暴发,其发病率和死亡率迅速上升并持续扩散,给水禽养殖业造成严重经济损失。目前,NDRV分离株较少,关于其分子生物学特性及致病性方面的研究鲜有报道。为了丰富NDRV毒株资源库,本研究利用鸡胚传代方法从病鸭组织内成功分离到9株纯净性良好的NDRV毒株。研究表明,9株分离病毒均能100%致死鸡胚,且在Vero细胞中良好增殖;除SD19/6202外,其余8株分离病毒均能在鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast,CEF）中产生明显细胞病变（Cytopathic effect,CPE）。进一步σC基因遗传演化分析显示,9株分离病毒与已报道中国NDRVs均位于水禽呼肠孤病毒基因2型分支,该分支可分为2个不同的亚群;其中,SD19/6201和7株分离病毒与其他38株已报道中国流行NDRVs遗传距离较近,位于Ⅰ亚群,具有一定的代表性;而SD19/6202与DE150/China和HN5d/China-HN/2013则位于II亚群,与大多数已报道的中国NDRVs遗传距离较远。σC氨基酸序列比对发现,CEF适应病毒代表株SD19/6201和CEF非适应病毒SD19/6202之间共存在13个氨基酸差异位点。将SD19/6201和SD19/6202感染1日龄雏鸭后,呈现与临床自然发病鸭相似的病症,发病鸭脾脏出血/坏死,病毒载量最高,而其他脏器则无明显病变,病毒载量较低,脾脏出血/坏死可以作为NDRV感染雏鸭的发病指标。为进一步了解NDRV的基因组特征,我们测定了复制特性存在明显差异的两株病毒（SD19/6201和SD19/6202）的全基因组序列,结果显示,2株病毒具有典型NDRV基因组结构特点,均属于水禽呼肠孤病毒基因2型。随后,我们对流行代表毒株SD19/6201的体外增殖特性进行研究,结果显示该毒株在细胞（Vero和CEF）和禽胚（鸡胚和鸭胚）中均可良好增殖,且对鸡胚和鸭胚呈高致死性。同时,我们建立了NDRV在14日龄和21日龄雏鸭上的感染模型,确定了NDRV在14日龄雏鸭上的推荐感染剂量为105.0ELD50/0.1 m L,21日龄雏鸭推荐感染剂量为106.0 ELD50/0.1 m L,推荐剖检时间均为感染后第7 d,此时脾脏病变比率均为80%（8/10）。NDRV流行株增殖特性的明确和动物感染模型的建立,为NDRV疫苗研发及免疫效果评价提供了理论基础。σB蛋白是NDRV外衣壳蛋白的主要成分,其携带群特异型中和抗原决定簇,能够诱导机体产生群特异性中和抗体,可作为靶蛋白制备诊断试剂。鉴于目前国内尚无商品化的NDRV ELISA抗体检测试剂盒,本研究以原核表达系统表达的NDRVσB蛋白作为包被抗原,建立了NDRV ELISA抗体检测方法。该方法与其他外源病毒阳性血清均无交叉反应,特异性良好;与IFA相比,本研究建立的NDRV检测方法具有更高的敏感性;使用该方法与IFA共检测368份临床血清,两者符合率为99.40%;该方法的成功建立,为我国NDRV的流行病学调查以及疫苗的评价提供了有效的技术手段。
张旭杰[6]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用》文中研究说明近几年来,我国多个省份广泛流行由新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）感染引起的以脾脏坏死为主要特征的传染性疾病。NDRV感染会对雏鸭脾脏和其他免疫器官造成损害,抑制免疫系统,导致雏鸭对其他病原体易感性增强,诱发混合感染。该病毒可感染多个品种的雏鸭,日龄越小,发病率和死亡率越高。患病雏鸭临床常表现为精神倦怠、喜卧、拉稀、发育受阻、生长缓慢,饲料返还率大幅降低。本研究使用鸡胚肝细胞对实验室保存的新型鸭呼肠孤病毒SDYC株进行病毒扩增,获得大量抗原液后制备灭活疫苗免疫开产蛋鸡,收集卵黄样品制备新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体,为NDRV的预防和治疗提供支持和保障。新型鸭呼肠孤病毒SDYC株接种鸡胚肝细胞,病毒感染36h后收取细胞病毒液,离心后取上清液作为制备灭活疫苗的抗原液。对抗原液进行毒力效价、纯净度检测和动物回归试验,均符合疫苗制备要求。选择终浓度为0.2%甲醛溶液37°C灭活抗原液24h,灭活后与Tween-80按94:6的比例混合配制疫苗水相。无菌操作加入2份水相、3份油相乳化疫苗,制成油乳剂灭活疫苗。对疫苗的安全性、剂型、物理性状、储存条件进行检测,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。灭活疫苗免疫开产蛋鸡,连续免疫4次,每次免疫间隔14d,4次免疫后每隔1周收集蛋黄样品进行ELISA抗体效价检测。结果显示免疫蛋卵黄抗体水平不断升高,至第三周达到最大值后抗体水平逐渐下降。收取免疫蛋经蛋壳消毒、蛋黄分离、一次灭活、醋酸酸化、辛酸萃取、二次灭活、粗滤、除菌细滤、超滤浓缩、三次灭活、除菌细滤后制备成防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体。对卵黄抗体的物理性状、p H值、安全性、抗体效价进行检测,均符合抗体生产标准。进行动物免疫保护试验检验新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体对雏鸭的保护效力,结果显示雏鸭注射抗体后机体抗体水平迅速升高,第4d左右机体抗体水平达到最高峰。雏鸭注射1.0 m L卵黄抗体后第21d检测血清抗体效价仍呈阳性,卵黄抗体持续保护时间完全覆盖雏鸭整个易感期,可大大降低新型鸭呼肠孤病毒对雏鸭的感染率。健康雏鸭人工感染新型鸭呼肠孤病毒后当天开始排毒,临床表现反应迟缓、喜卧、扎堆、饮食量下降。剖检发病雏鸭,脾脏坏死、肝脏出血症状明显。患病雏鸭注射卵黄抗体后,排毒雏鸭数量不断减少直至患病雏鸭不再排毒,精神状态良好,采食量、饮水量恢复正常。剖检雏鸭发现肝脏出血和脾脏坏死症状明显减轻,部分雏鸭恢复正常。综上所述,新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体制作流程简单、成本较低、安全性好、保护效果明显、治愈率高,可以有效用于预防和治疗鸭群爆发的以脾脏坏死为主要症状的新型鸭呼肠孤病毒感染,对新型鸭呼肠孤病毒感染的预防及治疗极具应用价值。
刘仙琦[7]（2021）在《禽腺病毒四型重组病毒和鸭腺病毒三型重组病毒的构建》文中研究指明禽腺病毒血清四型（FAdV-4）是肝炎-心包积水综合征（HPS）的主要病原,HPS引起感染鸡心包积水和肝脏坏死,具有发病率高、无季节性、死亡率高的特点,近年来在我国多省均有报道,且感染率逐年上升。因此研究FAdV-4的基因功能、致病机制和减毒机理,为构建更安全有效的禽腺病毒载体疫苗奠定基础具有现实意义。本研究以2015年分离得到的FAdV-4高致病性毒株CH/HNJZ/2015为亲本株,构建了在其基因组1966 bp缺失突变处插入炎症因子IL-1β的受体拮抗剂IL-1Ra基因的重组质粒,将重组质粒转染鸡肝癌细胞,成功拯救出重组病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966。对比重组病毒和亲本毒株的复制动态,IL-1Ra基因的插入不影响重组病毒的体外复制,同时免疫印迹实验和连续传代结果表明成功构建了能稳定表达IL-1Ra蛋白的重组禽腺病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966。2014年,在我国广东一番鸭厂发生了以肝脏出血、肿大和坏死为特征的新型疫病,从发病番鸭体内纯化到一株病毒CH-GD-12-2014,全基因组序列分析和进化树分析表明该病毒属于禽腺病毒属,纤维蛋白基因和六邻体基因比对结果表明该病毒是一种新型的鸭腺病毒,命名为鸭腺病毒三型（DAdV-3）。近年来,D AdV-3在我国多地传播,虽致死率较低,但其在鸭群中阳性比例高、易二次感染,给家禽养殖行业造成重大经济损失,因此急需开发安全有效的防控手段以预防D AdV-3的感染。鸭甲型病毒性肝炎（DVHA）由鸭甲型肝炎病毒（DHAV）引起,DHAV感染情况复杂,常与其它鸭源病毒混合感染。目前DHAV广泛传播,不断出现新的变异株,为DVHA的防治带来了巨大挑战,实际生产中多在雏鸭感染后注射卵黄抗体来防控DHAV。因此开发安全有效的病毒载体疫苗以控制DVHA具有广阔的发展前景。本研究以DAdV-3毒株CH-GD-12-2014为亲本株,构建了表达DHAV-VP1蛋白的重组质粒,并成功拯救出重组病毒rDAdV3-DHAV-VP1。对比 rDAdV3-DHAV-VP1 和 CH-GD-12-2014 的生长曲线,DHAV-VP1 的插入对重组病毒在感染初期的复制有一定影响,还需要进一步的实验来验证。免疫印迹实验结果验证了 DHAV-VP1蛋白的表达,连续传代结果证明rDAdV3-DHAV-VP 1具有良好的遗传稳定性。番鸭细小病毒病（MPVD）是由番鸭细小病毒（MDPV）引起的雏番鸭病毒性疾病,在我国南方多省均有发生,感染该病的雏鸭生长发育迟缓,给番鸭养殖场带来巨大的损失。MPVD的防控和免疫目前依靠灭活疫苗、弱毒疫苗的接种,因此在规避传统疫苗的缺点的基础上开发一种安全有效的病毒载体疫苗对MDPV进行有效防治,仍具有现实意义。本研究以DAdV-3毒株CH-GD-12-2014为亲本株,构建了表达MDPV-VP3蛋白的重组质粒,并成功拯救出重组病毒。重组病毒rDAdV3-MDPV-VP3的最高病毒滴度与亲本相近,免疫印迹实验验证了重组病毒中MDPV-VP3蛋白的表达。结果表明,成功构建了表达MDPV-VP3蛋白的重组鸭腺病毒rDAdV3-MDPV-VP3。
李丽琴,程雪娇,王宇鹏,孙珊珊,石青青,宋秀梅,于海超,王建[8]（2020）在《鸭短喙侏儒综合征精制蛋黄抗体的制备及应用效果评价》文中提出为了有效预防鸭短喙侏儒综合征,采用新型鸭细小病毒毒株（SD03株）制备了一种鸭短喙侏儒综合征精制蛋黄抗体。采用琼脂扩散试验和中和试验进行蛋黄抗体效价的测定,分析蛋黄抗体的消长规律,确定最佳免疫程序、收蛋时间和临床应用效价标准,并对制备的3批供试品进行临床应用效果评价。结果表明:该研究成功制备了一种鸭短喙侏儒综合征精制蛋黄抗体,该抗体琼扩效价和中和效价均在三免15 d达到高峰,分别为1∶64和1∶640,由此确定高免蛋收集时间为三免15 d;基础免疫完成后,最佳加强免疫时间为每隔30 d进行一次加强免疫,可使抗体效价一直维持在较高水平;确定了抗体琼扩效价≥1∶32或中和效价≥1∶320为临床应用效价标准。3批供试品临床应用试验结果表明,该鸭短喙侏儒综合征精制蛋黄抗体安全性好,对鸭短喙侏儒综合征有良好的预防和紧急预防效果。
朱奎[9]（2020）在《鸭胚肌肉细胞永生化建系及病毒亲嗜性探索》文中研究指明细胞基质是病毒疫苗研发的重要材料,因其成本低,成分明确,病毒产量高的优点,成为逐步取代鸡胚病毒培养法的方法。关于禽类细胞基质的研究,起步较晚,其中鸭源细胞的研发甚少。而鸭源细胞在水禽病毒学、疫苗学研究方面发挥着重要作用。故开发鸭源细胞对于水禽病毒的研究具有非常重大的意义。鹅细小病毒病和鸭细小病毒病是目前严重危害水禽养殖业的主要疫病,水禽烈性传染病病原包括鸭短喙矮小综合征病毒（short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV）和高致死率的番鸭细小病毒（muscovy duck parvovirus,MPV）.这两种疫病的易感群体为雏鸭,并且在病鸭肌肉细胞中均有病毒分离研究,故本研究通过慢病毒系统在鸭胚肌肉细胞中导入人源端粒酶逆转录酶（hTERT）的方式,解决原代鸭胚肌肉细胞无法传代的问题,实现鸭胚肌肉细胞永生化建系,并对两种细小病毒进行病毒嗜性的探索。本研究通过NCBI的conserved domains数据库分别获得人端粒酶逆转录酶（hTERT）和三种禽类端粒酶逆转录酶的蛋白质序列信息及其关键结构域:端粒RNA结合结构域和逆转录酶结构域,通过比对发现hTERT的关键结构域在禽类上是十分保守的。并通过第二代慢病毒表达系统,获得永生化的鸭胚肌肉细胞系（immortalized duck muscle cell line,iDEM）。之后通过RT-PCR,PAS染色及更昔洛韦（ganciclovir,GCV）诱导凋亡等试验对iDEM细胞系进行特性的鉴定。发现iDEM中稳定表达hTERT,并且通过添加GCV诱导细胞调亡试验佐证了外源基因表达情况。PAS染色结果显示iDEM中富含糖原,qPCR结果显示iDEM中肌肉卫星细胞特异基因表达水平极低,说明了iDEM是依赖于hTERT永生的鸭胚肌肉细胞系,而非肌卫星细胞系。在此基础上通过对iDEM的培养体系进行了筛选,从21种添加成分中筛选出碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）和小分子化合物Y27632两种添加成分,通过二者的联合使用大大提高了iDEM的增殖速度。并且发现优化体系中Y27632的添加解决了iDEM培养过程中失巢凋亡的问题。鸭短喙矮小综合征病毒（SBDSV）和番鸭细小病毒（MPV）在iDEM上进行侵染试验,以原代鸭胚混杂细胞群体为对照,发现病毒侵染后,iDEM组虽然没有观察到明显病变,但是PCR结果显示番鸭细小病毒能够在iDEM上有效的繁殖。本研究确定了hTERT关键结构域在禽类上的保守性,并通过慢病毒表达系统导入hTERT后,获得了鸭胚肌肉永生化细胞系,并筛选出了其适宜的培养成条件,本研究证明iDEM病毒细胞能够有效繁殖番鸭细小病毒。
袁佐清,吴庆海,曹铮,王思贵[10]（2020）在《番鸭细小病毒病近年研究进展》文中提出番鸭细小病毒病是一种急性传染性病毒病,以1～3周龄的雏番鸭最为易感,给我国番鸭养殖业造成巨大损失,该病的主要病原为番鸭细小病毒。文章从病原学、临床症状、流行病学以及实验室诊断方法等多个方面对番鸭细小病毒的研究成果进行综述,以期为后续研究提供参考。
二、番鸭细小病毒琼扩抗原研制及初步应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、番鸭细小病毒琼扩抗原研制及初步应用（论文提纲范文）
（1）鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究（论文提纲范文）
| 符号及缩略词说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 呼肠孤病毒发展 |
| 1.2 DRV的病原学特点 |
| 1.2.1 形态和结构 |
| 1.2.2 宿主 |
| 1.2.3 理化特性及血凝性 |
| 1.3 DRV的致病性 |
| 1.3.1 流行病学特点及临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 DRV的诊断 |
| 1.4.1 分离与鉴定 |
| 1.4.2 分子生物学鉴定 |
| 1.4.3 血清学诊断 |
| 1.5 呼肠孤病毒病防控的研究进展 |
| 1.5.1 弱毒疫苗 |
| 1.5.2 灭活疫苗 |
| 1.5.3 其他生物制品 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料背景 |
| 2.1.2 试验用胚、试验动物 |
| 2.1.3 试验毒株 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 试验相关溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物的合成 |
| 2.2.2 分离与鉴定 |
| 2.2.3 RT-PCR检测及测序分析 |
| 2.2.4 生物学及理化特性研究 |
| 2.2.5 一步生长曲线的绘制 |
| 2.2.6 灭活疫苗的研制 |
| 2.2.7 灭活疫苗的检验 |
| 2.2.8 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测 |
| 2.2.9 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 3.1.1 病毒的分离与传代 |
| 3.1.2 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 测序结果与分析 |
| 3.1.4 生物学及理化特性鉴定结果 |
| 3.1.5 一步生长曲线的绘制 |
| 3.2 灭活疫苗的研制 |
| 3.2.1 病毒液的制备 |
| 3.2.2 病毒液的纯净性检验 |
| 3.2.3 病毒含量(TCID_(50))的测定 |
| 3.2.4 疫苗的制备 |
| 3.2.5 灭活疫苗的检验 |
| 3.3 疫苗的免疫原性探究 |
| 3.3.1 灭活疫苗免疫父母代种鸭后抗体水平检测结果 |
| 3.3.2 母源抗体对商品代雏鸭的被动保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的分离与鉴定 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 灭活疫苗的免疫原性探究 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）死胚和弱雏中新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒的病原学概述 |
| 1.2.1 呼肠孤病毒的历史及分类 |
| 1.2.2 形态学和理化特征 |
| 1.2.3 培养特性 |
| 1.2.4 分子生物学特征 |
| 1.2.5 病毒的复制周期 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学特征 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 剖检病变及病理组织学变化 |
| 1.4 NDRV的致病机理 |
| 1.5 NDRV的诊断方法 |
| 1.5.1 血清学诊断 |
| 1.5.2 分子生物学诊断 |
| 1.6 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.6.1 实时荧光定量PCR的原理 |
| 1.6.2 实时荧光定量PCR的分类 |
| 1.6.3 实时荧光定量PCR的定量方法及应用 |
| 1.7 细胞因子的检测 |
| 1.7.1 细胞因子的检测方法 |
| 1.7.2 部分细胞因子功能 |
| 1.8 NDRV的防治 |
| 1.9 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌(毒)株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 相关试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样品的检测 |
| 2.2.1.1 病料的采集处理 |
| 2.2.1.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.1.3 RNA反转录 |
| 2.2.1.4 引物的设计与合成 |
| 2.2.1.5 PCR检测 |
| 2.2.1.6 电泳检测 |
| 2.2.1.7 病毒的分离与增殖 |
| 2.2.2 σC基因序列测定及分析 |
| 2.2.2.1 PCR扩增 |
| 2.2.2.2 PCR产物凝胶电泳 |
| 2.2.2.3 目的片段胶回收 |
| 2.2.2.4 胶回收产物T载体连接 |
| 2.2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.2.6 重组质粒的提取鉴定 |
| 2.2.2.7 阳性质粒的序列测定及分析 |
| 2.2.3 SD-32 毒株的致病性试验 |
| 2.2.3.1 毒株的选择 |
| 2.2.3.2 荧光定量引物的设计与合成 |
| 2.2.3.3 细胞致病性试验 |
| 2.2.3.4 TCID_(50)的测定 |
| 2.2.3.5 动物试验的建立 |
| 2.2.3.6 攻毒后临床症状监测 |
| 2.2.3.7 攻毒后剖检病变观察及免疫器官指数检测 |
| 2.2.3.8 攻毒后病理组织学观察 |
| 2.2.3.9 攻毒后病毒血症检测 |
| 2.2.3.10 攻毒后病毒载量检测 |
| 2.2.3.11 攻毒后细胞因子检测 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 NDRV的流行病学调查结果及分析 |
| 3.1.1 PCR检测结果 |
| 3.1.2 PCR结果分析 |
| 3.2 NDRV的分离鉴定结果及分析 |
| 3.2.1 NDRV的鸭胚分离结果 |
| 3.2.2 σC基因扩增结果 |
| 3.2.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.4 σC基因序列分析 |
| 3.3 SD-32 毒株的致病性分析 |
| 3.3.1 纯净度检测结果 |
| 3.3.2 细胞致病性 |
| 3.3.2.1 细胞病变 |
| 3.3.2.2 TCID_(50)测定结果 |
| 3.3.3 动物攻毒试验结果 |
| 3.3.3.1 临床症状 |
| 3.3.3.2 剖检病变 |
| 3.3.3.3 病理组织学变化 |
| 3.3.3.4 体重及免疫器官指数 |
| 3.3.3.5 标准曲线的建立 |
| 3.3.3.6 血清病毒载量 |
| 3.3.3.7 组织病毒载量 |
| 3.3.3.8 细胞因子变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 NDRV的流行病学调查 |
| 4.2 NDRV的分离鉴定 |
| 4.3 SD-32毒株致病性研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）鹅细小病毒单抗的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鹅细小病毒病概述 |
| 1.2 鹅细小病毒的病原学特征 |
| 1.2.1 GPV的分类 |
| 1.2.2 GPV的形态结构及理化特性 |
| 1.2.3 GPV的培养特性 |
| 1.3 GPV分子生物学特征 |
| 1.3.1 GPV基因组结构 |
| 1.3.2 GPV的末端倒置重复序列(ITR) |
| 1.3.3 GPV非结构蛋白 |
| 1.3.4 GPV结构蛋白 |
| 1.4 GPV流行病学特征 |
| 1.5 鹅细小病毒病的诊断 |
| 1.5.1 临床症状 |
| 1.5.2 病理变化 |
| 1.5.3 病毒的分离鉴定 |
| 1.5.4 鹅细小病毒的分子生物学诊断 |
| 1.5.5 GPV的血清学诊断 |
| 1.6 鹅细小病毒病的防治 |
| 1.7 单克隆抗体的研究现状 |
| 1.8 研究的目的及意义 |
| 第二章 鹅细小病毒DWY分离鉴定及基因组序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病毒的接种 |
| 2.2.3 鹅胚尿囊液的收集 |
| 2.2.4 病毒核酸的提取 |
| 2.2.5 PCR扩增鉴定 |
| 2.2.6 病毒基因组扩增测序 |
| 2.2.7 系统进化分析 |
| 2.2.8 动物回归试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 DWY株 PCR鉴定结果 |
| 2.3.2 DWY株全基因组测序结果 |
| 2.3.3 临床症状及病理变化 |
| 2.3.4 组织病理学变化 |
| 2.3.5 DWY株进化树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 鹅细小病毒单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株、细胞、实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 GEF细胞的制备 |
| 3.2.2 GPV的培养 |
| 3.2.3 GPV的浓缩纯化 |
| 3.2.4 GPV的 TCID_(50)测定 |
| 3.2.5 小鼠免疫程序 |
| 3.2.6 ELISA方法的建立 |
| 3.2.7 SP2/0 细胞的复苏 |
| 3.2.8 饲养层细胞的制备 |
| 3.2.9 细胞融合 |
| 3.2.10 阳性细胞株的筛选 |
| 3.2.11 阳性细胞株亚克隆 |
| 3.2.12 腹水的制备 |
| 3.2.13 腹水的纯化 |
| 3.2.14 阳性杂交瘤细胞的冻存 |
| 3.2.15 抗体亚型鉴定 |
| 3.2.16 效价测定 |
| 3.2.17 间接免疫荧光试验 |
| 3.2.18 中和活性测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GPV电镜检测结果 |
| 3.3.2 GPV的TCID_(50)的测定结果 |
| 3.3.3 抗体亚型鉴定结果 |
| 3.3.4 抗体效价测定结果 |
| 3.3.5 间接免疫荧光(IFA)鉴定 |
| 3.3.6 纯化后的抗体SDS-PAGE分析结果 |
| 3.3.7 中和活性测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 中和活性单克隆抗体的初步应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒株、实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 DWY株半数死量(LD_(50))的测定 |
| 4.2.2 单抗的保护性试验 |
| 4.2.3 单抗有效治疗时间的确定 |
| 4.2.4 雏鹅小肠抗原免疫组化分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 DWY株 LD_(50)测定结果 |
| 4.3.2 单抗保护性试验结果 |
| 4.3.3 单抗有效治疗时间结果 |
| 4.3.4 免疫组化结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鹅细小病毒基本特征 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 宿主范围和培养特性 |
| 2 基因分子特征 |
| 2.1 GPV基因组结构 |
| 2.2 非结构蛋白 |
| 2.3 结构蛋白 |
| 3 临床特点 |
| 3.1 流行病学 |
| 3.2 临床症状和病理变化 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病毒分离与鉴定 |
| 4.2 分子生物学诊断 |
| 4.3 血清学诊断 |
| 5 防治 |
| 本研究的目的及意义 |
| 研究内容一 2019-2020年江苏地区小鹅瘟分子流行调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 病毒鉴定 |
| 2.3 PCR产物的纯化 |
| 2.4 与pGEM-T Easy载体的连接 |
| 2.5 连接产物的转化 |
| 2.6 质粒DNA的提取 |
| 2.7 酶切鉴定 |
| 2.8 重组质粒序列测定及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 接种鹅胚结果 |
| 3.2 HA试验结果 |
| 3.3 PCR鉴定结果 |
| 3.4 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.5 流行情况分析 |
| 3.6 GPV-VP3序列分析 |
| 3.7 氨基酸序列分析 |
| 3.8 VP3潜在糖基化位点分析 |
| 3.9 重组分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容二 不同代次CZM株病毒全基因分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株、细胞及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代GEF细胞制备 |
| 2.2 病毒传代 |
| 2.3 不同代次CZM株半数组织细胞感染量的测定 |
| 2.4 不同代次CZM株鹅胚半数感染量和半数致死量的测定 |
| 2.5 不同代次CZM株雏鹅致病性实验 |
| 2.6 全基因PCR扩增 |
| 2.7 构建重组质粒 |
| 2.8 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 2.9 重组质粒序列测定及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV-CZM、CZM-70和CZM-142的TCID_(50)试验结果 |
| 3.2 GPV-CZM、CZM-70和CZM-142的EID_(50)和ELD_(50)试验结果 |
| 3.3 不同代次CZM株对雏鹅致病性实验结果 |
| 3.4 GPV全基因PCR扩增结果 |
| 3.5 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.6 GPV全基因序列分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容三 细胞适应毒CZM-142动物攻毒保护实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 GPV强毒株的筛选 |
| 2.2 强毒对雏鹅半数致死量的测定 |
| 2.3 母源抗体检测 |
| 2.4 CZM-142免疫剂量选择试验 |
| 2.5 攻毒保护试验 |
| 2.6 攻毒保护重复性试验 |
| 2.7 泄殖腔排毒检测和体重称量 |
| 2.8 血清的分离 |
| 2.9 不同剂量免疫水平检测 |
| 2.10 组织器官病变情况 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV强毒株筛选结果 |
| 3.2 强毒对雏鹅半数致死量测定结果 |
| 3.3 母源抗体检测结果 |
| 3.4 CZM-142免疫剂量选择结果 |
| 3.5 攻毒保护试验结果 |
| 3.6 攻毒保护重复性试验结果 |
| 3.7 PCR检测泄殖腔排毒情况 |
| 3.8 免疫后鹅体重变化 |
| 3.9 不同免疫剂量抗体水平检测结果 |
| 3.10 组织器官病变情况 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（5）新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 新型鸭呼肠孤病毒的病原学 |
| 1.1.1 NDRV的形态结构 |
| 1.1.2 NDRV的理化特性 |
| 1.2 新型鸭呼肠孤病毒的分子生物学特性 |
| 1.3 新型鸭呼肠孤病毒的流行病学 |
| 1.3.1 NDRV的流行情况 |
| 1.3.2 NDRV的致病性 |
| 1.4 新型鸭呼肠孤病毒的诊断方法 |
| 1.4.1 病毒分离鉴定 |
| 1.4.2 血清学诊断方法 |
| 1.4.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 新型鸭呼肠孤病毒的生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、鸡胚及实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 临床样品检测 |
| 2.2.2.1 临床病料及处理 |
| 2.2.2.2 样品RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.2.3 PCR |
| 2.2.3 NDRV的分离鉴定 |
| 2.2.3.1 NDRV的分离培养与传代 |
| 2.2.3.2 NDRV分离株的电镜观察 |
| 2.2.3.3 NDRV分离株的外源病毒检测 |
| 2.2.3.4 NDRV分离株的间接免疫荧光检测 |
| 2.2.3.5 NDRV分离株的σC基因扩增及遗传进化分析 |
| 2.2.3.6 动物回归实验 |
| 2.2.4 NDRV全基因组序列的扩增与遗传进化分析 |
| 2.2.5 NDRV流行株体外复制动力学研究 |
| 2.2.6 NDRV流行株对鸡胚和鸭胚致死率的测定 |
| 2.2.7 NDRV动物感染模型的建立 |
| 2.2.7.1 试验分组与设计 |
| 2.2.7.2 脾脏指数统计 |
| 2.2.7.3 脾脏组织病理学观察 |
| 2.2.7.4 脾脏组织病毒载量检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NDRV临床样品的检测结果 |
| 2.3.2 NDRV的分离鉴定结果 |
| 2.3.2.1 分离毒株鸡胚传代及细胞病变观察 |
| 2.3.2.2 分离毒株的电镜观察 |
| 2.3.2.3 分离毒株的外源病毒检测 |
| 2.3.2.4 分离毒株的IFA鉴定结果 |
| 2.3.2.5 分离毒株的σC基因扩增及遗传进化分析 |
| 2.3.2.6 动物回归实验结果 |
| 2.3.3 NDRV全基因组序列及分析 |
| 2.3.4 NDRV流行株体外复制动力学研究结果 |
| 2.3.5 NDRV流行株对鸡胚和鸭胚致死率的测定结果 |
| 2.3.6 NDRV动物感染模型的建立 |
| 2.3.6.1 临床症状与剖检结果 |
| 2.3.6.2 脾脏指数 |
| 2.3.6.3 脾脏组织病理变化结果 |
| 2.3.6.4 脾脏组织病毒载量检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 NDRV的分离鉴定 |
| 2.4.2 SD19/6201 和SD19/6202 基因组特征及遗传进化特点 |
| 2.4.3 SD19/6201 增殖特性及动物感染模型建立 |
| 第三章 新型鸭呼肠孤病毒ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与血清 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 NDRVσB重组蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.2.1.1 引物设计与合成 |
| 3.2.1.2 σB基因的扩增及重组载体的构建 |
| 3.2.1.3 融合蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 3.2.2 NDRV间接ELISA检测方法术式的确定 |
| 3.2.2.1 蛋白最佳包被浓度和包被时间试验 |
| 3.2.2.2 最佳封闭液和封闭时间试验 |
| 3.2.2.3 最佳待检样品稀释度及作用条件试验 |
| 3.2.2.4 最佳酶标二抗稀释度及作用条件试验 |
| 3.2.2.5 最佳底物反应条件试验 |
| 3.2.2.6 临界值确定试验 |
| 3.2.3 NDRV间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.2.4 间接ELISA方法的特异性试验 |
| 3.2.5 间接ELISA方法的敏感性试验 |
| 3.2.6 间接ELISA方法的重复性试验 |
| 3.2.7 间接ELISA方法对临床样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NDRVσB重组蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.3.1.1 σB基因的扩增及重组载体的构建 |
| 3.3.1.2 融合蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 3.3.2 NDRV间接ELISA检测方法术式的确定 |
| 3.3.2.1 蛋白最佳包被浓度和包被时间的确定 |
| 3.3.2.2 最佳封闭液和封闭时间的确定 |
| 3.3.2.3 最佳待检样品稀释度及作用条件的确定 |
| 3.3.2.4 最佳酶标二抗稀释度及作用条件的确定 |
| 3.3.2.5 最佳底物反应条件的确定 |
| 3.3.2.6 间接ELISA反应程序的确定 |
| 3.3.2.7 临界值的确定 |
| 3.3.3 NDRV间接免疫荧光方法的建立 |
| 3.3.4 间接ELISA方法的特异性试验结果 |
| 3.3.5 间接ELISA方法的敏感性试验结果 |
| 3.3.6 间接ELISA方法的重复性试验结果 |
| 3.3.7 间接ELISA方法对临床样品的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 呼肠孤病毒历史及分类 |
| 1.1.2 病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 病毒培养特性 |
| 1.2 鸭呼肠孤病毒的基因组及主要蛋白 |
| 1.3 流行病学及病理变化 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 临床特征 |
| 1.3.3 病理学变化 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.5 鸭呼肠孤病毒灭活疫苗 |
| 1.6 禽蛋的一般特性 |
| 1.6.1 卵黄的结构和组成 |
| 1.6.2 卵黄的乳化性 |
| 1.7 卵黄抗体 |
| 1.7.1 卵黄抗体技术发展简史 |
| 1.7.2 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的优势 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 细胞及雏鸭 |
| 2.1.3 种毒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒的扩增与检测 |
| 2.2.2 油乳剂灭活苗的研制 |
| 2.2.2.1 新型鸭呼肠孤病毒灭活条件研究 |
| 2.2.2.2 油相的制备 |
| 2.2.2.3 水相的制备 |
| 2.2.2.4 乳化 |
| 2.2.3 灭活疫苗的质量检验 |
| 2.2.3.1 剂型检验 |
| 2.2.3.2 离心稳定性检验 |
| 2.2.3.3 无菌检验 |
| 2.2.3.4 粘度检验 |
| 2.2.3.5 保存期检验 |
| 2.2.3.6 疫苗安全性检验 |
| 2.2.3.7 灭活疫苗对蛋鸡的免疫程序 |
| 2.2.3.8 ELISA抗体测定 |
| 2.3 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.1 卵黄抗体制造 |
| 2.3.2 卵黄抗体效价测定 |
| 2.3.3 卵黄抗体性状检验 |
| 2.3.4 卵黄抗体pH值检测 |
| 2.3.5 无菌检验和安全实验 |
| 2.3.5.1 无菌检验 |
| 2.3.5.2 安全检验 |
| 2.4 雏鸭免疫保护试验 |
| 2.4.1 雏鸭卵黄抗体保护试验 |
| 2.4.2 雏鸭卵黄抗体治疗试验 |
| 2.4.3 卵黄抗体消长规律试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 新型鸭呼肠孤病毒扩增与检测结果 |
| 3.1.1 病毒扩增结果 |
| 3.1.2 扩增病毒纯净度检测结果 |
| 3.1.3 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定结果 |
| 3.1.4 新型鸭呼肠孤病毒动物回归试验 |
| 3.2 油乳剂灭活疫苗的研制结果 |
| 3.2.1 确定抗原液最佳灭活条件 |
| 3.2.2 灭活疫苗的理化性状检验结果 |
| 3.2.2.1 灭活疫苗的剂型 |
| 3.2.2.2 灭活疫苗的稳定性 |
| 3.2.2.3 灭活疫苗的粘度 |
| 3.2.2.4 灭活疫苗无菌检验 |
| 3.2.2.5 保存期检验 |
| 3.2.2.6 灭活疫苗安全性检验 |
| 3.2.2.7 免疫蛋卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.8 卵黄抗体效价测定 |
| 3.2.2.9 卵黄抗体物理性状检验结果 |
| 3.2.2.10 卵黄抗体p H值检测结果 |
| 3.2.2.11 卵黄抗体无菌检验结果 |
| 3.2.2.12 卵黄抗体安全性检验结果 |
| 3.2.2.13 雏鸭卵黄抗体保护效果 |
| 3.2.2.14 雏鸭卵黄抗体治疗试验结果 |
| 3.2.2.15 抗体消长规律结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 新型鸭呼肠孤病毒 |
| 4.2 灭活疫苗的制备 |
| 4.3 卵黄抗体的制备 |
| 4.4 新型鸭呼肠孤卵黄抗体的保护效力检验 |
| 4.5 新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体应用前景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）禽腺病毒四型重组病毒和鸭腺病毒三型重组病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽腺病毒血清四型 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 形态结构 |
| 1.1.3 基因组结构 |
| 1.1.4 流行病学 |
| 1.2 重组禽腺病毒研究进展 |
| 1.2.1 重组禽腺病毒载体研究进展 |
| 1.2.2 重组禽腺病毒疫苗研究进展 |
| 1.3 鸭腺病毒血清三型 |
| 1.4 白介素-1家族 |
| 1.4.1 白介素-1家族组成 |
| 1.4.2 白介素-1β |
| 1.4.3 白介素-1受体拮抗剂 |
| 1.5 鸭甲型肝炎病毒 |
| 1.6 番鸭细小病毒 |
| 1.7 Red/ET同源重组工程 |
| 1.7.1 Red/ET同源重组工程简介 |
| 1.7.2 Red/ET同源重组工程原理 |
| 1.7.3 Red/ET同源重组工程应用 |
| 1.8 立题依据和意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 第二章 表达白细胞介素-1受体拮抗剂的重组禽腺病毒的构建 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒、毒株及细胞 |
| 2.1.2 主要仪器及试剂 |
| 2.1.3 培养基和溶液 |
| 2.1.4 寡核苷酸合成及测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应 |
| 2.2.2 苯酚/氯仿/异戊醇抽提与酒精沉淀 |
| 2.2.3 大肠杆菌的电转化方法 |
| 2.2.4 大肠杆菌质粒的小量提取与酶切鉴定 |
| 2.2.5 质粒pCI-neo-CMV-IL-1Ra-SV40pA构建 |
| 2.2.6 质粒pR6K-CMV-IL-1Ra-SV40pA-ampccdB构建 |
| 2.2.7 重组病毒质粒p15A-cm-HNJZ-IL-1Ra-1966构建 |
| 2.2.8 重组病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966拯救 |
| 2.2.9 重组病毒中IL-1Ra基因的PCR鉴定 |
| 2.2.10 重组病毒中IL-1Ra蛋白表达检测 |
| 2.2.11 重组病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966的体外复制动态研究 |
| 2.2.12 重组病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966的遗传稳定性评价 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 质粒pCI-neo-CMV-IL-1Ra-SV40pA构建 |
| 2.3.2 质粒pR6K-CMV-IL-1Ra-SV40pA-ampccdB构建 |
| 2.3.3 重组病毒质粒p15A-cm-HNJZ-IL-1Ra-1966构建 |
| 2.3.4 重组病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966拯救 |
| 2.3.5 蛋白IL-1RA在重组病毒中的表达 |
| 2.3.6 重组病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966的体外复制动态 |
| 2.3.7 重组病毒rHNJZ-IL-1Ra-1966的遗传稳定性鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达鸭甲型肝炎病毒VP1或番鸭细小病毒VP3的重组鸭腺病毒的构建 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒、毒株及细胞 |
| 3.1.2 主要仪器及试剂 |
| 3.1.3 培养基和溶液 |
| 3.1.4 寡核苷酸合成及测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒pCI-neo-CMV-DHAV-VP1-SV40pA和pCI-neo-CMV-MDPV-VP1-SV40pA构建 |
| 3.2.2 质粒pR6K-CMV-DHAV-VP1-SV40pA-cmccdB和pR6K-CMV-MDPV-VP3-SV40pA-cmccdB的构建 |
| 3.2.3 重组病毒质粒p15A-amp-DAdV3-DHAV-VPI和p15A-amp-DAdV3-MDPV-VP3构建 |
| 3.2.4 重组病毒的拯救 |
| 3.2.5 重组病毒中外源基因的PCR鉴定 |
| 3.2.6 外源蛋白在重组病毒中的表达检测 |
| 3.2.7 重组病毒的体外复制动力学研究 |
| 3.2.8 重组病毒的遗传稳定性评价 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 质粒pCI-neo-CMV-DHAV-VP1-SV40pA和pCI-neo-CMV-MDPV-VP3-SV40pA的构建 |
| 3.3.2 质粒pR6K-CMV-DHAV-VP1-SV40pA-cmccdB和质粒pR6K-CMV-MDPV-VP3-SV40pA-cmccdB构建 |
| 3.3.3 重组病毒质粒p15A-amp-DAdV3-DHAV-VP1和p15A-amp-DAdV3-MDPV-VP3构建 |
| 3.3.4 重组病毒的拯救 |
| 3.3.5 外源蛋白在重组病毒中的表达 |
| 3.3.6 重组病毒的体外复制动态 |
| 3.3.7 重组病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）鸭短喙侏儒综合征精制蛋黄抗体的制备及应用效果评价（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 试验鸡、鸭及养殖场 |
| 1.3 试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.1.1 抗原的制备 |
| 2.1.1. 1 接种 |
| 2.1.1.2孵育和观察 |
| 2.1.1. 3 收获 |
| 2.1.2 抗原的检验 |
| 2.1.2. 1 无菌检验 |
| 2.1.2. 2 病毒含量 |
| 2.1.2. 3 抗原的浓缩与灭活 |
| 2.1.2. 4 灭活抗原检验 |
| 2.1.3 免疫原的制备 |
| 2.1.3. 1 水相制备 |
| 2.1.3. 2 油相制备 |
| 2.1.3. 3 乳化 |
| 2.2 蛋鸡免疫 |
| 2.2.1 高免蛋鸡的选择 |
| 2.2.2 免疫程序 |
| 2.2.3 高免蛋收集 |
| 2.3 蛋黄抗体的制备与纯化 |
| 2.4 采用琼脂扩散试验检测蛋黄抗体效价 |
| 2.5 中和试验 |
| 2.6 临床应用效果的评价 |
| 2.6.1 对雏鸭的安全性考查 |
| 2.6.1. 1 单剂量使用临床安全性考查 |
| 2.6.1. 2 多倍剂量使用临床安全性考查 |
| 2.6.1. 3 多次使用临床安全性考查 |
| 2.6.2 对雏鸭的预防效果考查 |
| 2.6.2. 1 预防效果考查 |
| 2.6.2. 2 紧急预防效果考查 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫后蛋黄抗体的消长规律 |
| 3.1.1 免疫后蛋黄抗体琼扩效价消长规律 |
| 3.1.2 免疫后蛋黄抗体中和效价消长规律 |
| 3.1.3 高免蛋收集时间、最佳加强免疫时间和间隔时间的确定 |
| 3.2 临床应用效果评价试验结果 |
| 3.2.1 对雏鸭的安全性试验结果 |
| 3.2.2 对雏鸭的预防效果考查 |
| 4 讨论 |
（9）鸭胚肌肉细胞永生化建系及病毒亲嗜性探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细胞基质 |
| 1.1.1 细胞基质发展简史 |
| 1.1.2 禽类永生化细胞基质 |
| 1.2 禽类肌肉细胞研究进展 |
| 1.2.1 禽类肌肉细胞发育 |
| 1.2.2 肌卫星细胞 |
| 1.2.3 肌细胞发育相关重要通路 |
| 1.2.4 禽类肌肉细胞应用 |
| 1.3 永生化的研究进展 |
| 1.3.1 永生化方法 |
| 1.3.2 永生化细胞存在的问题 |
| 1.4 鸭肌肉细胞永生化的应用前景 |
| 第二章 鸭胚肌肉永生化细胞系的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 hTERT核心结构域保守性分析 |
| 2.2.2 鸭胚肌肉永生化细胞的建立 |
| 2.2.3 iDEM特性鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 iDEM培养条件优化 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 iDEM体系筛选 |
| 3.2.2 Y27632显着提高iDEM存活率 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 细小病毒细胞嗜性探索 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新点与进一步研究的课题 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）番鸭细小病毒病近年研究进展（论文提纲范文）
| 1 病原学 |
| 1.1 理化特性 |
| 1.2 分子生物学特征 |
| 1.3 生物学特征 |
| 2 病理与流行病学研究 |
| 2.1 临床症状 |
| 2.2 病理组织学 |
| 2.3 流行病学 |
| 3 新型实验室检测方法 |
| 3.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.2 分子生物学检测方法 |
| 3.2.1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) |
| 3.2.2 核酸探针技术 |
| 3.2.3 环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) |
| 4 小结 |
四、番鸭细小病毒琼扩抗原研制及初步应用（论文参考文献）
- [1]鸭新型呼肠孤病毒的分离鉴定及其免疫原性初步探究[D]. 孔桂慧. 山东农业大学, 2021
- [2]死胚和弱雏中新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定[D]. 刘臻臻. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]鹅细小病毒单抗的制备及初步应用[D]. 陈雪明. 中国农业科学院, 2021
- [4]江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究[D]. 姜煜晨. 扬州大学, 2021
- [5]新型鸭呼肠孤病毒流行株生物学特性研究及ELISA抗体检测方法的建立[D]. 罗丹. 中国农业科学院, 2021
- [6]新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的制备及应用[D]. 张旭杰. 山东农业大学, 2021(01)
- [7]禽腺病毒四型重组病毒和鸭腺病毒三型重组病毒的构建[D]. 刘仙琦. 山东大学, 2021(12)
- [8]鸭短喙侏儒综合征精制蛋黄抗体的制备及应用效果评价[J]. 李丽琴,程雪娇,王宇鹏,孙珊珊,石青青,宋秀梅,于海超,王建. 畜牧与饲料科学, 2020(06)
- [9]鸭胚肌肉细胞永生化建系及病毒亲嗜性探索[D]. 朱奎. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [10]番鸭细小病毒病近年研究进展[J]. 袁佐清,吴庆海,曹铮,王思贵. 黑龙江畜牧兽医, 2020(15)