一、紫杉醇生物合成酶的研究进展（论文文献综述）
刘婧[1]（2021）在《UV-B辐射对东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类成分的合成代谢调控机制初步研究》文中指出东北红豆杉（Taxus cuspidata Siebold&Zucc.）广泛分布于中国东北地区,伴随天然生长缓慢以及过度开发利用和生境破坏等原因,现已成为珍惜濒危的植物资源。紫杉烷类化合物是东北红豆杉的特征性活性成分,其中紫杉醇作为广谱抗癌特效药物已广泛应用于癌症患者的治疗;另外,东北红豆杉中的黄酮类化合物亦被报道具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多种健康益处。已有研究表明东北红豆杉的生理生化特性易受UV-B辐射影响,但是UV-B辐射对紫杉烷和黄酮类活性成分的深度合成代谢调控机制尚未有报道,因此开展这方面研究非常必要。基于转录组测序平台探究植物次生调控机制已经成为当前研究的热门手段,该方法具有灵敏度高、通量高、准确性好和适用于无参物种测序等优势。基于上述,本研究首先考察了 UV-B辐射处理下东北红豆杉组培苗中7种紫杉烷类（10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、7-木糖基-10-脱乙酰基紫杉烷、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇和7-表紫杉醇）和7种黄酮类（异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素、7-去甲基银杏双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素和紫杉双黄酮）目标活性成分的积累变化规律;然后利用转录组测序（RNA-seq）技术对UV-B辐射处理后东北红豆杉组培苗中的差异表达基因（DEGs）进行功能注释和代谢通路富集分析;最后筛选出了一些响应UV-B辐射的紫杉烷和黄酮生物合成候选酶基因,并进行实时定量PCR验证。本文的主要研究结果如下:1、建立了同时检测东北红豆杉中关键紫杉烷和黄酮类化合物的UHPLC-MS/MS分析方法系统优化了 UHPLC和MS/MS操作参数,建立了可同时检测7种紫杉烷和7种黄酮类化合物的UHPLC-MS/MS方法,该方法可在很短时间内（5分钟）实现对这14种目标化合物的定性和定量分析;方法学验证表明该方法的线性良好,且具有较高灵敏度、精密度和准确度;该方法将为后续研究UV-B辐射下东北红豆杉组培苗中紫杉烷和黄酮类成分含量变化规律提供可靠的检测技术手段。2、分析了 UV-B辐射对东北红豆杉组培苗中紫杉烷和黄酮类成分积累的影响（1）以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA为腋芽启动培养基,可高效促使腋芽的萌动和生长;以MS+0.4mg/L6-BA+ 1.0 mg/LNAA为不定芽增殖培养基,可有效促进新的不定芽出现和生长;以WPM+0.8 mg/LNAA+0.2 mg/LIBA为不定芽生根培养基,可诱导部分不定芽生根,将生根后的东北红豆杉不定芽转移到不含任何植物激素的WPM培养基中进行培养,发现其茎叶生长状态可有效恢复且主侧根根系发达。（2）利用UHPLC-MS/MS方法对UV-B辐射处理0 h、12 h和24 h下的东北红豆杉组培苗样本进行分析:发现7种紫杉烷类化合物的合成积累均得到了增强,其中的紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、7-表紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、7-木糖基-10-脱乙酰基紫杉烷和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的积累趋势呈24 h>12 h>0 h;三尖杉宁碱的含量则呈12 h>24 h>0 h的积累效果;整体而言,总紫杉烷的含量在UV-B辐射过程中持续积累,12 h和24 h时的含量分别为0h的1.49倍和1.71倍;同时,本研究发现7种黄酮类化合物的合成积累得到了不同程度的增强,其中的紫杉双黄酮、银杏黄素、7-去甲基银杏双黄酮和异槲皮苷的积累趋势呈24 h>12 h>0 h;槲皮苷和槲皮素的含量则呈12 h>24 h>0 h的积累效果;异银杏黄素含量则无太大变化;整体而言,总黄酮的含量在UV-B辐射过程中持续积累,12 h和24 h时的含量分别为0 h的1.25倍和1.40倍。本部分研究确定了 UV-B辐射处理0 h、12 h和24 h为东北红豆杉中目标紫杉烷和黄酮类成分积累量差异显着的关键时间点,这些含量差异显着的样本将有助于后续在转录组层面探索东北红豆杉这些关键次生代谢产物对UV-B辐射的合成响应机制。3、完成了东北红豆杉差异样本高通量转录组测序（1）使用转录组测序技术对UV-B辐射0h、12 h和24 h下的东北红豆杉组培苗样本进行检测,总共获得了 132026（N50:2656）个转录本和52755（N50:2340）个基因,其平均长度分别为1695 bp和1381 bp,最小转录本长度为301 bp。（2）总共识别出2570个DEGs,在UV-B辐射12 h vs.0 h中鉴定出1074个DEGs,其中489个基因表达上调,585个表达下调;UV-B辐射24 h vs.0 h鉴定出1929个DEGs,其中1008个基因表达上调,921个表达下调;UV-B辐射24 h vs.12 h获得640个DEGs,其中520个基因表达上调,120个表达下调。（3）GO聚类分析发现样本中的DEGs主要在“代谢过程”和“催化活性”术语处产生聚类,此外在“氧化还原过程”处也有较高的功能活性;KEGG通路富集发现有一定数量的DEGs富集于“二萜类生物合成”、“黄酮生物合成”以及“苯丙烷生物合成”的代谢路径。4、探究了 UV-B辐射对东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类化合物的合成代谢调控机制（1）基于转录组测序数据,我们筛选出了 UV-B辐射处理期间表达上调的黄酮类生物合成候选酶基因PAL1、PAL2、PAL3、C4H、CHS1、CHS2、FLS1和F3’5’H2以及高表达的紫杉烷类化合物生物合成候选酶基因TASY、BAPT1、BAPT2和T5αH。（2）将上述筛选出的12个候选酶基因进行实时定量PCR验证,发现所有测试基因在UV-B辐射期间均显着上调,这表明东北红豆杉组培苗中黄酮类和紫杉烷类生物合成酶基因能够显着响应UV-B辐射的刺激而发生转录激活,进而促进相应成分的积累,进一步支持了 RNA-seq数据的可靠性;此外,CHS2和FLS1与黄酮生物合成路径上的其它候选酶基因相比转录水平更高,表明这两者对UV-B辐射的响应效果更加显着;发现TASY、BAPT1和T5αH相对于其他候选酶基因表现出非常高的转录水平,表明这三者可能是东北红豆杉紫杉烷类生物合成通路中对UV-B辐射更为关键和敏感的基因。综上所述,本研究利用UV-B辐射促进了东北红豆杉组培苗中紫杉烷和黄酮类活性成分的积累;并利用转录组测序技术发现东北红豆杉组培苗中紫杉烷和黄酮类成分生物合成路径中相关酶基因的转录水平受UV-B辐射影响显着;最后利用实时定量PCR验证了这两大类药用活性成分生物合成路径中筛选到的12个候选酶基因表达水平,并发现了 CHS2、FLS1、TASY、BAPT1和T5αH对UV-B辐射较为敏感。本项研究初步明晰了UV-B辐射对东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类次生代谢产物的合成代谢调控机制,为未来利用基因工程技术提高紫杉烷和黄酮类化合物产量提供了一定的理论依据,并且为其他药用植物的生物合成关键酶基因筛选以及次生代谢调控机制研究提供了参考。
寇萍[2]（2021）在《东北红豆杉中紫杉烷对UV-B辐射的响应规律及其代谢调控分子机制解析》文中进行了进一步梳理东北红豆杉（Taxus cuspidata）中所含有的紫杉醇是世界公认的具有极高药用价值的二萜类化合物,由于其独特的抗癌机制已作为广谱抗癌特效药用于各类癌症的临床治疗,医药市场需求量巨大。受限于紫杉醇的其他来源和生产方式存在技术瓶颈,难以大规模应用,所以目前紫杉醇的供应仍然直接或间接的来源于红豆杉自然资源,其他紫杉烷类成分则可作为紫杉醇生物合成的前体物质及其半合成的原料,然而东北红豆杉植株生长缓慢且紫杉烷含量极低,且因人类过量砍伐而濒临灭绝。已有研究表明,紫杉醇的生物合成途径会受到多种生理生态因子的影响和调控,而UV-B作为一种重要的光生态因子,应用于药用植物次生代谢过程调控和活性成分诱导增量的研究已成为相关领域的研究热点。本文在建立了准确可靠的次生代谢物质量控制分析方法的基础上,探究了UV-B诱导对东北红豆杉叶片中紫杉烷类成分含量的影响规律,并结合生理生化指标及转录组测序分析初步探讨了诱导调控机制,之后对UV-B诱导下东北红豆杉中紫杉醇合成代谢通路的关键酶候选基因及调控因子进行了挖掘和表达验证,本研究的主要内容及结果如下:1、建立了红豆杉中靶向代谢物的UPLC-MS/MS质量控制分析方法,同时针对性的检测红豆杉针叶中14种主要紫杉烷及黄酮类成分（10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、7-表紫杉醇、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇、槲皮苷、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、芦丁、白果素、银杏双黄酮、金松双黄酮）。方法学验证表明各目标成分在检测范围内均呈现良好线性关系,并且该分析方法的灵敏度、精密度、重现性、准确性均较好。此外优化建立了基于高速匀质结合超声辅助提取法的红豆杉叶片样品制备工艺,为后续样品中目标活性成分的高通量准确检测分析提供了必要的技术基础。该质量控制分析方法用于三种红豆杉叶片样品的检测分析可达到预期定性定量的效果,可满足红豆杉中含量低且结构相似的靶向代谢物高通量检测分析的需要,为质量控制及后续相关研究提供了必要的检测手段与技术支持。2、探究了东北红豆杉针叶紫杉烷及黄酮成分对UV-B的代谢响应规律,首先通过使用不同强度的UV-B辐射处理东北红豆杉幼苗,并对辐射诱导后东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类化合物含量进行了 0至96 h的动态监测,以初步探究东北红豆杉针叶中紫杉烷和黄酮类成分对UV-B的次生代谢响应规律,结果发现东北红豆杉经UV-B辐射后针叶中主要紫杉烷类成分积累量普遍升高后降低,且辐射强度越大诱导增量效果越显着,各紫杉烷类成分含量主要是在48 h或72 h时达到最大值且各紫杉烷类成分之间普遍表现出显着的正相关性。此外UV-B辐射后针叶中主要黄酮类成分大多显着升高后降低,且胁迫强度越大诱导效果越显着,大部分黄酮类成分主要集中在48 h达到最大值。由UV-B诱导引起的次生代谢响应中黄酮类成分比紫杉烷类成分反应更敏感、更迅速,黄酮类成分的最大增量达到了紫杉烷类最大增量的1.81-3.21倍,且紫杉烷类和黄酮类成分含量之间呈现出显着的正相关性,表明东北红豆杉在自我防御时紫杉烷和黄酮类成分的生物合成过程很可能具有一定的协同作用。可为东北红豆杉的UV-B定向高效培育、紫杉烷类成分在基因水平的合成调控机制解析及高效利用东北红豆杉可再生的针叶资源提供重要数据参考和理论依据。3、为探究东北红豆杉针叶在生理生化层面对UV-B辐射的响应及调控规律,使用不同UV-B辐射时间诱导东北红豆杉幼苗。发现UV-B辐射会降低东北红豆杉叶片的生物量和相对含水量,辐射强度越大越不利于叶片生物量的积累且对细胞水分生理的影响越显着;UV-B辐射会引起东北红豆杉叶片气体交换参数的显着降低,在高强度辐射下净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率下降了 56.53%-77.68%;东北红豆杉叶片在UV-B诱导下叶绿素和类胡萝卜素含量大体呈现上升后下降的趋势;东北红豆杉会激活抗氧化酶系统以响应和防御UV-B辐射,SOD、CAT、POD酶活性在UV-B诱导前期呈显着上升趋势,之后随着辐射时间的增加而下降,且辐射强度越大对酶活的影响越大;丙二醛含量会随着UV-B处理时间的延长而逐渐显着升高,细胞膜逐渐受损。相关性和聚类分析表明UV-B辐射时气体交换参数和光合色素之间呈显着正相关性（p<0.05）,但与丙二醛含量之间存在极显着负相关关系（p<0.01）,抗氧化酶SOD、CAT和POD之间关系密切,可为UV-B对植物的调控作用研究、东北红豆杉的UV-B定向优质培育及可再生的针叶资源高效利用提供理论依据和重要的指导意义。4、通过DNBSEQ测序技术获得了 UV-B诱导前后的东北红豆杉针叶的转录组信息,经过组装后共获得102301个unigene,平均长度为1284 bp。挖掘筛选出UV-B诱导前后东北红豆杉针叶中的差异表达基因共5949个,其中上调表达4016个基因,下调表达1933个基因,可发现UV-B诱导后的上调表达基因数显着高于下调表达基因数。共鉴定注释到了 2119个unigene分布于57个转录因子家族,主要集中于MYB、AP2-EREBP、C3H、bHLH、Trihelix、mTERF、WRKY 和 NAC 家族。在 GO 分类富集功能分析重点关注的生物过程方面,差异基因主要集中于细胞过程、代谢过程、应激反应、生物调节和生物过程调节。共有3141个差异表达基因经过KEGG分析主要归类到18个KEGG pathway类型,其中注释数目最多的为代谢通路。此外,紫杉醇萜类骨架生物合成通路基因受到UV-B诱导后有12个关键酶基因的表达量产生显着差异,其中1 1个MEP途径的关键酶基因均发生了上调表达,1个MVA途径的甲羟戊酸磷酸激酶基因受到混合模式调节,表明东北红豆杉紫杉醇生物合成上游通路关键酶基因受到UV-B的显着诱导与调控且转录水平都有显着提高。5、对UV-B调控东北红豆杉中紫杉醇合成通路的分子机制进行了解析,共挖掘筛选出17个紫杉醇生物合成关键酶基因,24个差异表达且序列完整的候选WRKY蛋白序列。对鉴定获得的24个TcWRKY转录因子进行生物信息学分析,保守结构域分析结果表明共分为三个大类:Ⅰ组5个成员;Ⅱ组18个成员,其中Ⅱ亚组4个成员,Ⅱb和He亚组分别4个和2个成员,Ⅱ亚组8个成员;Ⅲ组只有一个成员。保守基序和进化树分析共鉴定出5个保守基序且每个蛋白的基序种类和数量差异很可能与家族成员的特定功能有关,这些TcWRKY蛋白在生物进化过程中比较保守。采用qRT-PCR方法分析东北红豆杉中紫杉醇生物合成关键酶基因的表达模式,结果表明萜类骨架MEP途径的6个关键酶基因表达水平均受到了 UV-B的正向调控,其中TcDXS、TcMCS和TcHDS基因对UV-B的响应更敏感。筛选所得11个紫杉醇生物合成关键酶基因表达量随着UV-B处理时间的增加普遍呈现升高后递减规律,其中TcT13H、TcTBT、TcPAM和TcDBTNBT基因在48 h时对UV-B诱导的响应最敏感。对UV-B诱导下差异表达最显着的12个TcWRKY转录因子基因的转录表达水平进行了测定,发现UV-B会诱导东北红豆杉中TcWRKY基因表达水平的显着上调,但各基因具体的表达模式存在差异。TcWRKY1、TcWRKY4、TcWRKY11、TcWRKY12基因很可能在48 h对UV-B诱导的敏感性显着增强,并主要集中在诱导中后期响应UV-B来调控东北红豆杉中相关的防御过程。TcWRKY10、TcWRKY16、TcWRKY17基因可能在48 h时开始显着发挥各自的生物学功能以增强东北红豆杉的应激防御过程。本研究建立的高效准确的红豆杉针叶中紫杉醇等目标活性成分质量控制分析方法可为红豆杉中次生代谢产物相关研究提供科学基础和技术参考,系统性的研究了东北红豆杉的次生代谢产物含量、生理生态指标、次生代谢通路关键酶基因对UV-B辐射的响应规律,并基于转录组信息筛选分析紫杉醇合成通路酶基因和转录因子的表达模式,为后续东北红豆杉的UV-B定向优质培育体系的建立、紫杉醇的生物合成途径及调控机制的解析、以及红豆杉可再生的针叶资源的开发利用提供重要数据参考和理论依据。
李弘琨[3]（2021）在《东北红豆杉内生真菌多样性与紫杉烷积累的相关性规律解析及其高产菌株的应用》文中提出红豆杉是地球上濒临灭绝的天然抗癌植物,是经过了 250万年的古老孑遗树种,有植物界“活化石”之称。红豆杉植物中含有多种生物活性的代谢产物,如紫杉烷类、生物碱类、黄酮类、有机酸类、苯丙素类、木脂素类、萜类等,其中紫杉醇因活性强、抗癌机制独特成为世界各国医院首选的一线广谱抗癌药物的原料药。自然条件下红豆杉生长速度缓慢,再生能力差,并且红豆杉中紫杉醇浓度约为0.02-0.069%,市场供不应求,原料短缺问题日益严峻。自上世纪90年初Stierle等首次获得产紫杉醇的内生真菌,植物内生真菌成为筛选新的具有生物活性代谢产物的重要来源,以期代替繁琐而低效的“不可持续的资源利用方式”。据报道,内生真菌种群的生物多样性和产与宿主相同成分的次生代谢产物多样性,对宿主植物化合物的产生、积累及其他生命活动起着重要的作用。本研究以东北红豆杉（Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.）为研究对象,利用UPLC-Q Exactive Focus Orbitrap/MS技术对东北红豆杉的整体代谢成分进行快速、全面的成分分析。结合UPLC-MS/MS技术对东北红豆杉四个器官的紫杉烷标志性代谢物进行定量比较,并系统地研究内生真菌生物多样性及与宿主植物紫杉烷类代谢产物的相关性,建立新的策略来筛选具有产生生物活性的菌株并探究内生真菌在不同部位紫杉烷差异代谢形成中的作用,为东北红豆杉植物与内生真菌的进一步开发利用提供科学依据。本论文主要研究内容及结果如下:1、首次系统地对东北红豆杉不同器官内生真菌进行分类鉴定及种群多样性分析从东北红豆杉4个器官部位（根部、枝条、针叶、果实）共分离出内生真菌262株,其中根部内生真菌98株,枝条中内生真菌86株,针叶中内生真菌69株,果实中内生真菌9株,通过核糖体DNA中的内转录间隔区（ITS）序列Blast比对并对分离得到的内生真菌构建系统发育进化树,聚类到真菌界子囊菌门Ascomycota的4纲10目14科17属。器官对东北红豆杉内生真菌组成、优势类群（目、属、种水平上）的分布有显着的影响,其中仅4个种属为四个组织共有;果实中的内生真菌多样性及丰度最低,7个种属为根部、枝条、针叶三个组织共有;3个种属为根部和枝条两个器官共有;头孢菌属（Cephalosporium sp.）为仅枝条和针叶两个器官共有。本研究中木霉属Trichoderma表现出根部组织专一性;Eurotiales、Pleosporales和Hypocreales为最优势目;Penicillium、Aspergillus、Alternaria、Fusarium、Xylaria、Botrytis、Phoma和Trichoderma最优势属的分布具有显着的组织特异性。器官对东北红豆杉内生真菌多样性及丰度也有显着的影响,根部和枝条中内生真菌物种丰富度分别是针叶的1.91-2.36倍;果实的17.19-21.37倍;针叶的丰度约果实的9倍;多个优势菌种不同程度地体现出显着的组织特异性。2、植物代谢组学对东北红豆杉整体代谢成分的研究全面分析了东北红豆杉的代谢成分,结合一级、二级质谱及裂解规律确定了 12466个离子特征,对应5498个具有注释的潜在代谢物,初步鉴定了 239个化合物,包括紫杉烷类、黄酮类、萜类、生物碱类、有机酸类、苯丙素类、甾体类、糖类及氨基酸类等。主成分分析（PCA）表明根部和枝条间的代谢物差异较小,具有相同或相似的代谢成分;与针叶和果实间的代谢物差异明显。这些代谢产物参与了 80条代谢途径,主要包括柠檬酸循环（TCA循环）、氨基糖和核苷酸糖的生物合成途径、苯丙氨酸代谢途径、萜类骨架生物合成途径、脂肪酸生物合成途径、苯丙烷生物合成途径、甾体生物合成途径、花青素生物合成类黄酮生物合成途径、黄酮和黄酮醇生物合成途径、异喹啉生物碱生物合成途径等。东北红豆杉中紫杉烷总量最高,紫杉烷类化合物分布在红豆杉植物全身,且不同部位的含量和种类分布差异较大。对紫杉醇途径前体物质、中间产物和紫杉烷类代谢物进行差异分析,结合UPLC-MS/MS对器官的标志性代谢物进行定量比较,对7个目标紫杉烷类化合物进行分析检测,推测紫杉烷类物质在器官部位中合成,运输和积累的方式。3、东北红豆杉不同器官紫杉烷差异代谢物与内生真菌的相关性分析采用Pearson分析对东北红豆杉紫杉烷类化合物与内生真菌之间的相关性进行评估,东北红豆杉内生真菌菌群结构物种丰富度（H’）与宿主植物常见的七种紫杉烷类化合物的相关性显着,并且发现优势菌与含量之间存在正相关性;显着性差异的优势菌种对特有的紫杉烷代谢产物（紫杉醇途径前体物质、中间产物和其他紫杉烷类化合物等）中的21个差异化合物的峰面积之间存在一定的正相关和负相关关系,说明内生真菌对东北红豆杉化合物积累、产生及其他生命活动起着重要的影响作用;通过多元线性回归分析模型对东北红豆杉内生真菌优势菌属与紫杉醇等化合物含量进行评估,验证优势菌和紫杉烷含量的密切关系,建立新的策略来筛选具有产生物活性的菌株并探究内生真菌在不同部位紫杉烷差异代谢形成中的作用。4、东北红豆杉内生真菌R8-3-4的发酵工艺优化及应用通过PCR扩增生物合成关键酶基因和UPLC-MS/MS的MRM模式从东北红豆杉根部的内生真菌筛选出能产生与宿主相同次生代谢产物的目标菌株。以R8-3-4菌株为研究对象,考察不同因素对10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB）产量的影响,对发酵培养条件、发酵液中诱导子添加量进行优化。最优生产发酵条件为:PDB培养基、葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源,初始pH 6.0、温度30℃、转速160 r/min、培养14天、CuSO4 0.10 mg/L,水杨酸10 mg/L,乙酸钠8 g/L,发酵优化培养后R8-3-4菌株产10-DAB产量为983.41μg/L,是未优化前产量的2.96倍。利用磁固定化技术对优化后Penicillium oxalicum R8-3-4菌株进行半连续生产应用,经过五次循环在5 L生物反应器中10-DAB最终总浓度达到4873.08 μg,以使10-DAB的产量最大化,有望解决紫杉醇类药物的供需矛盾,从而在商业规模上实现巨大的经济可持续预期的可能性。
匡雪君[4]（2020）在《二萜类化合物紫杉醇和丹参酮的生物合成与调控研究》文中研究表明二萜类天然产物及其衍生物是药物开发的重要来源,紫杉醇和丹参酮是其中代表性化合物。紫杉醇是来源于红豆杉属植物的一种四环二萜类化合物,在治疗卵巢癌、乳腺癌等疾病方面效果显着,是目前销量最高的植物药之一;丹参酮属于松香烷型二萜醌类化合物,是大宗中药材丹参的主要有效成分之一,对心脑血管疾病具有显着的疗效。本论文通过高通量测序等技术对紫杉醇和丹参酮的生物合成及其转录和转录后调控机制进行了研究。为了研究紫杉醇的生物合成及其调控,分别利用Illumina和Pacbio测序平台对东北红豆杉（Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.）根、茎和叶的转录组进行测序,共获得58,602个unigenes,其中13,636个unigenes具有可变剪切事件,RT-PCR证实可变剪切基因存在组织特异性模式。通过基因功能注释发现139个细胞色素P450（CYP450）、31个BAHD酰基转移酶和1,940个转录因子（TF）。其中79个CYP450是首次从东北红豆杉中获得,66个为裸子植物特有CYP450;基于序列基序分析、进化分析和共表达分析,预测9个CYP450、7个BAHD酰基转移酶和6个TF可能参与紫杉醇的合成及调控。本研究建立了无参考基因组物种的三代转录组分析和次生代谢相关基因发掘的技术体系,为通过高通量测序技术研究次生代谢途径及可变剪切等转录后调控机制奠定了基础。前期丹参（Saalvia miltiorrhiza Bunge.）基因组测序研究发现丹参酮合成相关基因在基因组中可能以基因簇的形式存在。本研究通过构建和筛选丹参BAC文库,并利用Illumina和Pacbio平台联合测序技术获得了两条丹参酮生物合成基因簇,长度分别为374.44kb和464.46kb。两条基因簇均含有7个CYP450、3个萜类合酶、2个TF、1个F-box蛋白基因。基因簇上的CYP450、TF和F-box蛋白基因大多为串联重复基因,其中一些基因在两个基因簇中的拷贝数不同。这两条基因簇上均含有已鉴定功能的丹参酮骨架合成酶基因CPS1、CPS2和KSL1,及参与骨架修饰的基因CYP76AH1和CYP76AH3,证明了丹参生物合成基因簇的真实存在。克隆基因簇上的4个CYP450和3个已知功能的CYP450,在酿酒酵母中进行异源表达。用21个丹参酮类化合物测试这7个酶的催化活性,证实CYP71D410对铁锈醇,新隐丹参酮Ⅱ和20-去氧鼠尾草酚有催化活性。核磁共振结果表明CYP71D410使铁锈醇C-3位羟基化产生花柏酚。构建CYP71D410基因的毛状根RNA干扰体系进一步验证了其在丹参酮合成途径中的重要作用。丹参酮生物合成基因簇的发掘与鉴定为整个丹参酮途径的解析奠定了基础,并将进一步加深人类对于植物基因簇的一些基本生物学问题的认知。植物激素脱落酸（ABA）可以增加多种植物中次生代谢产物的积累。为了研究脱落酸对丹参有效成分的影响,本研究采用Nanopore PromethION平台对ABA处理前后的丹参的根和叶进行转录组测序,共获得了 63,213,822条clean reads,去冗余后得到58,487条转录本。大约50.0%基因的表达受ABA影响,其中参与花青素合成、糖基转移等基因表达量显着上调,参与黄酮合成、甲基转移等基因表达量显着下调。丹参中约61.0%的基因经历了可变剪切事件,其中内含子保留是主要类型。ABA诱导后剪切事件数目总体呈现减少的趋势,表明ABA可影响丹参的可变剪切。在5种可变剪切事件中,内含子保留事件受到ABA的影响最大。丹参叶中剪切事件受到ABA的影响比根中的大,证实了可变剪切事件对ABA的响应具有组织特异性的特点。参与ABA信号转导途径的一些基因受到ABA诱导后,产生的剪切异构体数目显着增多,推测可变剪切可能参与ABA信号转导途径的调控。丹酚酸途径基因受ABA诱导后上调表达,推测ABA能促进丹酚酸的合成;参与丹参酮生物合成的基因基本不受ABA的诱导。本研究表明ABA可以从转录和转录后调控等多个层次影响次生代谢产物的生物合成。紫杉醇和丹参酮的生物合成途径的解析为其合成生物学研究提供了有用的“元器件”,为通过构建“细胞工厂”合成紫杉醇、丹参酮及其中间产物,进而推动相关药物的生产和研发奠定了基础。同时,紫杉醇和丹参酮代谢途径调控机制的阐明可为分子育种研究提供“功能性”分子筛选标记,加速优良品种选育进程,推动相关中药产业的可持续发展。
王馨[5]（2020）在《不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类成分合成代谢影响与初步机制解析》文中指出东北红豆杉主要生长于我国东北吉林老爷岭、张广才岭及长白山等地区。红豆杉中主要次生代谢产物是紫杉烷类化合物,紫杉醇是其中最具代表性的活性化合物,是世界公认的广谱抗癌药物。红豆杉生长极为缓慢且紫杉烷成分含量低,从自然资源中获取的传统方式满足不了国内外市场对其日益增长的需求,应用生物技术手段获得紫杉烷类成分已经成为目前研究的热点,该方法具有培养周期短、条件可人为控制,不受季节、地区的影响等优点。利用诱导技术处理红豆杉组织细胞培养体系获得紫杉烷类成分是目前可行的技术手段,目前LED光照已成为提高植物组织培养体系中次生代谢活性产物产量的一种极具前途技术手段。基于上述,本研究优化并建立了东北红豆杉愈伤组织培养体系,并使用5种不同光质（红光,蓝光,绿光,红蓝绿混合光和白光）的LED灯对愈伤组织进行照射处理,以暗培养作为对照,分析了不同光质照射下愈伤组织中7个紫杉烷类化合物（紫杉醇、巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇和7-表紫杉醇）的积累变化规律,并利用qRT-PCR技术分析愈伤组织中6个与紫杉烷生物合成密切相关基因（TXS、T7βOH、DBAT、ACL、BAPT和DBTNBT）的表达水平变化规律。本论文的主要研究结果如下:1、优化并建立了东北红豆杉愈伤组织培养体系以东北红豆杉嫩茎作为外植体,自来水冲洗4小时后使用75%酒精消毒30 s,再使用0.1%的HgCl2溶液消毒15 min,无菌滤纸吸干茎段表面水分,使用剪刀将叶片剪掉,茎段剪至0.5 cm长度,接种在MS+2 mg/LNAA+0.1 mg/LKT的培养基上诱导愈伤组织,诱导30天后,从外植体剥离愈伤组织至MS+2 mg/LNAA+0.1%活性炭的培养基上进行愈伤组织增殖。2、考察了不同光质对紫杉烷类化合物积累的影响使用不同光质（红光、绿光、蓝光、红蓝绿混合光和白光）的LED灯对东北红豆杉愈伤组织进行照射处理,以暗培养作为对照,利用UPLC-MS/MS对7个目标紫杉烷类化合物进行分析检测,结果发现不同光质对于紫杉烷类化合物的积累呈现出不同的影响效果,但5种光质均可促使紫杉烷类化合物积累增强,同时确定红光为最佳光质,其可使总紫杉烷含量增加2.17倍,紫杉醇含量增加2.84倍。此外,以红光照射处理东北红豆杉愈伤组织30天为周期,发现紫杉烷类化合物含量随着时间的增加均呈现逐渐升高后降低的趋势,25天时所有目标化合物含量均达到最高,此时总紫杉烷含量为61837.78±4893.59 ng/g DW,紫杉醇含量为 21385.07±2484.95 ng/g DW。3、研究了不同光质对紫杉烷类化合物生物合成相关基因表达的影响利用qRT-PCR技术对不同光质照射处理下东北红豆杉愈伤组织中6个紫杉烷类生物合成相关基因表达水平变化进行了研究。以暗培养为对照,发现几乎所有的光照对于6个基因的表达均有促进作用,这表明不同光质触发了这些紫杉烷生物合成酶基因的转录表达,进而促进了紫杉烷次生代谢成分的合成和积累。特别是在红光下,除T7βOH基因外,其他基因均达到了最高的表达量,特别是ACL基因在红光下表现出最大的转录丰度,可达12.51,这可能也是红光下紫杉烷类化合物积累比在其他光质下更多的内在原因。以红光照射处理东北红豆杉愈伤组织30天为周期,发现大部分基因呈现出逐渐升高后降低的趋势,这种变化趋势与紫杉烷类成分变化趋势相一致,这同样证明了红光诱导合成酶基因的表达上调是紫杉烷类化合物生物合成和积累增强的内在原因。其中,TXS、DBAT、ACL基因在第21天的时候表达量最高,T7βOH、BAPT和DBTNBT基因在第13天的时候达到最高水平,这些基因的最高表达水平均早于紫杉烷最大积累所需的时间点（25天）,这一现象符合基因转录表达早于产物合成的代谢组学规律。同时,本研究初步证实了 TXS、T7βOH、DBAT和ACL可能是紫杉烷类化合物生物合成的潜在关键基因。此外,本研究发现ACL基因在21天的转录丰度（可达36.08）明显高于其他目标基因,表明该基因对红光LED诱导紫杉烷类化合物合成更为敏感和关键。综上述所,本研究确定了红光照射可以有效增强东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物的积累量,该方法操作简单,无污染,成本低,具有潜在的工业化应用价值。此外,本研究初步明确了光质调控紫杉烷类化合物生物合成的内在分子机制,发现ACL基因对红光调控紫杉烷类化合物生物合成较为敏感和关键,为未来利用代谢工程技术手段高产紫杉烷类化合物提供了一定的理论依据。
刘盼[6]（2019）在《枝霉MD2的转录组测序及两个紫杉醇合成相关候选基因的过表达分析》文中研究指明紫杉醇（Taxol）是临床应用的高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是获取紫杉醇的重要药源途径之一。目前,已有55个属200多株内生真菌被报道可产紫杉醇,但是真菌中紫杉醇产量低且不稳定,尚无一株可应用于产业化生产。基于真菌紫杉醇代谢途径的定向遗传改造,构建稳定高产的基因工程菌株是实现其产业化应用的主要途径之一。筛选真菌中紫杉醇生物合成相关基因,并验证其功能,是阐明真菌紫杉醇合成的分子机制以及构建高产工程菌株的关键。本研究分析了枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides;简称:枝霉）MD2的转录组信息,初步推测了枝霉MD2的紫杉醇合成途径,获得49个与其紫杉醇合成相关的unigenes;克隆了两个候选基因A05868和A02976,分别对其进行了生物信息学分析,构建其过表达载体及转基因菌株,并分析了过表达这两个候选基因对枝霉MD2紫杉烷类合成的影响。主要研究成果如下:1)采用Illumina Hiseq?2500高通量测序技术对枝菌MD2的转录组进行测序并进行系统的生物信息学分析。Trinity de novo组装得到16603个unigenes,分别在NR、NT、PFAM、Swiss Prot、GO、KOG和KEGG数据库进行BLAST注释,共有12479个unigenes至少可在一个数据库进行注释,1593个unigenes可被七个数据库进行注释。8425个unigenes可进行GO功能注释,归属到生物过程、细胞成分和分子功能三大类共57个功能组。3350个unigenes可进行KEGG注释,归属到262个KEGG代谢途径。在此基础上,推测了枝霉MD2中潜在的紫杉醇生物合成途径及其基因信息,包括参与萜类骨架生物合成的9个unigenes和参与紫杉烷类生物合成的40个unigenes。2)克隆了候选基因A05868,该基因DNA和cDNA序列分别为1425 bp和1260 bp;其编码蛋白包含419个氨基酸,与Pseudocercospora fijiensis CIRAD86的溶血磷脂酸酰基转移酶吞蛋白（lysophosphatidic acid acyltransferase endophilin）有57%的一致性,C端有Bin Amphiphysin RVS（BAR）结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A05868并转化枝霉MD2,通过抗性筛选获得14株A05868/MD2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得8株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株（A05868/MD2-A8、B1、B6、C1）进行qRT-PCR分析,发现A05868/MD2-B6转基因菌株的候选基因的表达量最高,为对照（未转基因）菌株的3倍（5天）;进一步提取该菌株的紫杉烷类并进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中未检测到紫杉醇、巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇和多烯紫杉醇4种紫杉烷类物质;而转基因菌株A05868/MD2-B6的10-去乙酰巴卡亭III产量（14.621±0.186μg/g）和10-去乙酰紫杉醇产量（1.564±1.025μg/g）相比对照菌株（18.321±0.045μg/g,3.213±0.063μg/g）分别下降了20.195%和51.323%,该结果初步说明过表达A05868对枝霉MD2的10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇的代谢合成有抑制作用。3)克隆了候选基因A02976,该基因DNA和cDNA序列分别为1685 bp和1518 bp;其编码蛋白包含505个氨基酸,与Fusarium oxysporum的单端孢霉烯3-O-乙酰转移酶（trichothecene 3-O-acetyltransferase）有43%的一致性,C端有转移酶结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A02976并转化枝霉MD2,通过抗性筛选获得14株A02976/MD2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得10株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株（A02976/MD2-A6、A8、C1、D8）进行qRT-PCR分析,发现A02976/MD2-C1转基因菌株的候选基因的表达量最高,是对照菌株的A02976候选基因表达量的3.2倍（10天）。选择A02976/MD2-C1进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中均未检测到紫杉醇、巴卡亭III和多烯紫杉醇3种紫杉烷类物质。转基因A02976/MD2-C1中未检测到10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇,而对照菌株可检测到;转基因A02976/MD2-C1可以检测到7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇,其产量为4.253±0.017μg/g,但对照菌株未检测到该物质。该结果初步说明过表达A02976对枝霉MD2中10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇的代谢合成有抑制作用,对7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇的合成有促进作用。
陈一鸣[7]（2019）在《南方红豆杉野生型和变异品系‘金锡杉’针叶代谢组和转录组比较研究》文中认为南方红豆杉（Taxus wallichiana var.mairei）作为重要的药源植物,因其体内高价值的天然抗癌物质紫杉醇及其它活性成分而受到全世界科学家的广泛关注。‘金锡杉’（Taxus wallichiana var.mairei cv.‘Jinxishan’）为南方红豆杉自然变异品系,假种皮黄色,含有丰富的紫杉醇,对其代谢及调控机理的研究,能为南方红豆杉种质资源的综合开发和利用提供理论基础。本文以南方红豆杉野生型及其变异品系‘金锡杉’为研究材料,通过广泛靶向代谢组比较两者针叶中代谢物含量差异,分析‘金锡杉’特殊代谢模式;利用转录组测序鉴定‘金锡杉’针叶中调控紫杉醇生物合成的关键影响因子。主要研究结果如下:1.利用广泛靶向代谢组学结合HPLC的方法对相同生境下野生型及变异品系‘金锡杉’针叶中代谢物含量差异进行分析。共获得689种代谢物,其中71种代谢物在两种红豆杉中的含量差异显着。这些差异代谢物主要富集在糖代谢、脂质合成等初生代谢途径,以及黄酮类合成等次生代谢途径中。在‘金锡杉’针叶中,大多数氨基酸（5种）和黄酮类代谢物（10种）含量远高于野生型,而糖代谢（3种）、脂类合成（4种）及TCA循环（3种）途径中的差异代谢物含量均远低于野生型。黄酮类次生代谢物含量的升高与其上游3-O-对-香豆酰奎尼酸含量的升高有关,说明黄酮代谢物升高的原因可能归因于苯丙氨酸和酪氨酸代谢途径的协同调控,从而增强‘金锡杉’对外界环境的适应性;而‘金锡杉’中低含量的糖代谢、脂类生物合成以及TCA循环等途径中代谢物造成的能量供应不足,则通过合成大量的氨基酸类物质来维持平衡。2.为了揭示‘金锡杉’中调控紫杉醇生物合成的关键因子,利用转录组测序技术比较南方红豆杉野生型和‘金锡杉’针叶的转录表达。结果显示,相比于野生型,‘金锡杉’中有2,889个差异表达基因上调,有2,347个下调;其中编码紫杉醇合成路径中羟基化和酰基化反应步骤的基因（TAT、T5H、T10OH和DBBT）在‘金锡杉’中上调表达可能是造成紫杉醇含量升高的主要原因。此外,本研究中由于编码COI1和JAZ的基因表达上调从而导致‘金锡杉’针叶中茉莉酸（JA）信号转导途径的激活,同时JA与赤霉素（GA）、生长素（AUXIN）和乙烯（ET）激素信号途径中相关基因（如DELLA、ERF1、ARF等）之间存在的交互作用最终导致紫杉醇含量的升高解释了紫杉醇生物合成途径中DEGs表达的上调的原因。而编码TFs的ERF、bHLH、MYB和WRKY家族基因的差异表达进一步表明激素信号对紫杉醇生物合成基因的调控是通过转录因子（TFs）所介导的。
卞光凯[8]（2017）在《萜类化合物生物合成元件的挖掘与产物的高效合成》文中研究表明萜类化合物是一类广泛存在于自然界中具有高度结构多样性的化合物,在人类日常生活中发挥着举足轻重的作用。目前研究人员已通过代谢工程及组合生物合成策略,利用微生物发酵方式实现了多种萜类化合物的商业化生产。其中一些化合物被广泛应用于香水生产行业、保健品行业、农业生产领域以及医疗行业。在自然界中,萜类化合物可经2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP）和甲羟戊酸（mevalonate,MVA）途径合成,生物体可利用这两个途径以及异戊烯基焦磷酸异构酶（Idi）合成萜类化合物前体物质异戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate,IPP）和烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate,DMAPP）,随后经异戊烯转移酶（prenyltransferases,PT）催化合成不同链长的异戊二烯单元。并经萜类合酶（terpene synthases,TPSs）催化,合成不同类型的萜类化合物。因而构建一个高效的IPP和DMAPP合成平台是实现萜类化合物高效合成的关键。为此,我们利用课题组开发的定向代谢工程策略,通过过表达MVA途径,在大肠杆菌（Escherichia coli）体内构建了合成萜类化合物的平台。并以紫杉二烯为研究对象,通过一步构建,成功地在 E.coli体内实现了紫杉二烯的高效合成。为其它二萜类化合物在E.coli体内的高效合成奠定了基础。随后将这一策略应用到丝状真菌交链格孢（Alternaria alternata）中,实现了紫杉二烯的稳定合成。在构建A.alternata萜类化合物合成平台之前,我们首先建立了基于农杆菌转化（ATMT）的A.alternata TPF6遗传操作系统。该系统的建立使得我们对其进行代谢工程改造成为可能。为了实现对外源基因的表达进行较为精确的控制,我们借助于荧光显微镜以及RT-PCR研究了 TPF6体内6个外源启动子的强度。随后将其应用于TPF6的代谢工程改造工作中去,在过表达了外源的Idi、tHMG1以及TS后,我们在突变株A.alternata GB127中成功地检测到了 61.9±6.3μg/L的紫杉二烯。这是首次报道在丝状真菌体内实现紫杉二烯的稳定合成,为利用微生物合成紫杉醇提供了一个新的思路。ATMT方法的建立以及外源启动子强度的验证为我们对其进行进一步的代谢工程改造提升紫杉烷类化合物产量奠定了基础。此外,我们还构建了高效供给萜类化合物前体物质的在酿酒酵母（Saccharommyces cerevisiae）平台,为萜类化合物在S.cerevisiae体内的高效合成奠定了基础。为了拓展定向代谢工程指导的高产萜类化合物平台的应用范围,我们进而将该平台用于萜类化合物的挖掘。萜类环化酶（terpene cyclase）能够催化含有不同链长异戊二烯单元的底物合成单环或者多环的萜类化合物。随后这些合成的萜类化合物骨架在不同的部位经一系列的加氧酶、甲基转移酶,酰基转移酶以及糖基转移酶等酶催化一系列后修饰步骤形成数以千计的萜类化合物。因而,挖掘新的萜类环化酶是拓展萜类化合物结构多样性的一个决定性步骤。然而,目前人们对该元件以及萜类化合物生物合成途径中的其它元件的挖掘还远远不足,这也直接阻碍了那些高附加值的萜类化合物的代谢工程研究和商业化生产。基因组测序及注释为研究人员提供了大量未知功能的萜类合酶。这其中许多萜类环化酶具有底物和反应杂泛性（promiscuous）,能够接受不同链长的底物合成种类丰富的萜类化合物。然而,传统的基因组挖掘（genome mining）方法通常受限于异源表达宿主的产物合成能力,仅能对其中主要的产物进行挖掘鉴定,这在很大程度上掩盖了这些萜类环化酶的生物合成潜力。因而,开发一个高效的萜类化合物生物合成元件及其产物挖掘平台,对一些潜在的新的萜类环化酶进行研究从而发现新的萜类化合物是加速萜类化合物研究进程的关键所在。为此,本研究对丝状真菌禾谷镰刀菌J1-012菌株（Fusariumgraminearum J1-012）的基因组信息进行生物信息学分析,从基因组中挖掘I型多功能萜类环化酶。对其进行克隆并开展体外实验对其生物学功能进行验证。结果显示,FgMS和FgGS两个酶具有显着的底物和反应杂泛性,能够以GPP、FPP、GGPP以及GFPP为底物合成多种类型的萜类化合物。为了充分了解这两个具有底物及反应杂泛性的萜类合成酶的萜类化合物合成能力,我们构建了一个含有3个不同模块的萜类化合物生物合成平台。第一个模块为基于MVA途径高产平台,该平台能够提供尽可能多的IPP和DMAPP,用于后续不同类型萜类化合物的生物合成。第二个模块为含有不同来源的能高效合成聚异戊烯焦磷酸的法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）,香叶基香叶基焦磷酸合成酶（GGPPS）以及香叶基法尼基焦磷酸合成酶（GFPPS）的文库。第三个模块为多功能的萜类合酶。以此为基础,我们构建了 6个突变株来充分挖掘FgMS和FgGS的萜类化合物合成能力。最终结果显示,他们能够合成多达52种单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜。我们对其中的12个产物进行鉴定,结果显示,其中化合物1、2、5,7-10为新的二萜和二倍半萜化合物,这其中包含有3个新骨架化合物。显示了这两个酶强大的萜类化合物合成能力以及该组合生物合成平台的高效性。随后,为了进一步增加产物的多样性,我们对其中的FgMS进行同源建模,并对其活性口袋附近的潜在的非保守的氨基酸位点进行分析及定点突变。体外研究结果显示F65L和F159G能够合成6个潜在的新的二倍半萜化合物。随后我们通过体内发酵实验获得了化合物56并鉴定其为新的二倍半萜类化合物。这一组合生物合成结合酶的理性改造策略使得我们充分地挖掘了 FgMS和FgGS的生物合成潜力,加速了新的萜类化合物的挖掘进程。此外,我们还开发了基于酿酒酵母平台的萜类化合物生物合成元件及产物挖掘的方法。为此,我们以过表达了 tHMG1的S.cerevisiaeYZL141为平台,过表达了法尼基焦磷酸合成酶（ERG20）和F.graminearum J1-012来源的另一个具有底物和反应杂泛性的萜类合酶FgFS,使其能够高效合成FgFS的产物。发酵结果显示,FgFS能够合成10种倍半萜化合物。对其中8个主要产物进行鉴定,结果显示,化合物1-3为新骨架化合物,其中化合物2和3为顺反异构体体。化合物4为具有重要应用价值的橙花叔醇。同时,结合同位素标记实验阐明了新骨架化合物1-3的合成机理。这一系统的代谢工程辅助天然产物挖掘工作的开展为其它萜类合酶的功能验证以及新骨架化合物的挖掘提供了一个成熟的解决方案。上述实验表明,将组合生物合成、代谢工程、酶的理性改造等策略用于萜类化合物生物合成有关基因的功能验证及产物的挖掘是一个非常有意义的工作,这将在很大程度上加快萜类环化酶元件及其产物的挖掘速度并以及加深我们对萜类环化酶的认识。
张蒙[9]（2016）在《中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式研究》文中研究指明茉莉酸（Jasmonate,JA）是植物体中广泛存在并且具有高效调节作用的内源激素之一,尤其对萜类、生物碱类和黄酮类的次级代谢产物的生物合成具有重要的调控作用。但由于JA信号激素能够同时引起细胞凋亡等一系列副反应,从而限制了其实际应用。因此,通过阐释JA信号通路调控植物次级代谢产物的模式,并以此为基础构建转基因细胞系,不仅能够提高目标产物的含量,而且能够有效地避免副反应损害。紫杉醇是中国红豆杉体内一类重要的二萜类物质,对于治疗乳腺癌和卵巢癌具有良好的疗效。但是,由于其生物体内含量低且合成步骤复杂,从而严重制约了其商业化生产。本文对中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式进行研究,以期为构建紫杉醇高产细胞系奠定基础。本文首先通过对中国红豆杉中紫杉醇合成酶基因启动子上的顺式作用元件进行克隆和分析,然后以关键的JA信号响应元件为诱饵,筛选与其相互作用的转录因子,从而阐明JA信号通路调控紫杉醇合成的下游模式。同时,鉴定中国红豆杉中的JA信号通路中的关键节点JAZ（Jasmonate-ZIM domain）和MYC2因子,以研究中国红豆杉中JA信号通路上游响应的调控方式及其与下游响应之间的相互作用。结合以上结果,从而能够阐明JA信号调控紫杉醇生物合成的模式。取得的主要结果如下:（1）JA调控紫杉醇合成模式中的的靶点筛选。对TASY,T5H,T10H,T13H,TAT和T7H 6个紫杉醇合成酶基因的启动子进行了克隆和研究,发现E-box,G-box和T/G-box等JA-responsive顺式作用元件广泛存在于紫杉醇合成酶基因启动子上,表明MYC2是响应JA信号并调控紫杉醇生物合成的重要转录因子。其中,紫杉醇合成酶TASY基因启动子与PR（Pathogen-Related）、STR（Strictosidine synthase）、PMT2（putrescine N-methyltransferase 2）等JA响应基因的启动子具有相同结构,即近端分布的T/G-box及串联的G-box和GCC-box顺式作用元件,说明TASY是JA调控紫杉醇合成模式中的的重要靶点,同时也表明了ERF（Ethylene Responsive Factor）和MYC2转录因子在JA调控紫杉醇合成模式中具有重要作用。因此,本文以筛选调控tasy基因表达的erf和myc2为切入点,然后进一步揭示两类转录因子在ja信号调控紫杉醇合成模式中发挥的作用。（2）与jre元件相互作用的tcerfs的克隆与功能分析。启动子活性分析表明t/g-box、cgtca-motif和gcc-box是tasy基因响应ja的功能元件,其中gcc-box发挥了最关键作用。根据gcc-box能够特异与erf类转录因子相互作用的特性,从中国红豆杉转录组中筛选获得94个ap2/erebp转录因子。进一步研究发现其中23个蛋白序列具有erf的特征碱基。分析meja处理前后两个细胞系的转录组发现,表达量发生显着变化的有13个:其中4个表达量显着上升,9个表达量显着下调。利用序列分析等筛选得到两个erf类转录因子tcerf12和tcerf15,两者分别编码典型的b1和b3类gcc-box-bindingerf转录因子。酵母单杂交、红豆杉细胞体内共表达及超表达实验均表明,tcerf12和tcerf15能够通过结合gcc-box而分别抑制和激活tasy基因的表达。（3）ja信号途径上游基因tcmyc2的克隆及功能验证。在中国红豆杉转录组数据库中筛选得到具有完整的myc2转录因子特征结构的tcmyc2,其蛋白序列与atmyc2、ntmyc2和crmyc2具有极高的相似性,进化分析也表明它们具有极近的亲缘关系,意味着tcmyc2在红豆杉中有相似的作用。tcmyc2与tasy启动子顺式作用元件的相互作用实验证明,tcmyc2能够与t/g-box、g-box相互作用并进而激活tasy基因表达。而且,tcmyc2不仅能够激活tasy,t5h,tat,bapt,t13h等紫杉醇合成酶基因,还能够激活tcerf12和tcerf15的表达。以上结果表明,tcmyc2对于响应ja信号并调控植物次级代谢产物合成具有重要作用。（4）ja信号途径上游基因tcjaz的克隆及功能验证。通过对红豆杉中tcjaz基因的研究发现,除groupv亚家族外,其他的jaz蛋白在裸子植物与被子植物中具有不同的进化路径。因此,挑选groupv亚家族中的tcjaz3作为研究红豆杉中ja信号通路的目标因子。酵母双杂交实验证明,tcmyc2能够与tcjaz3相互作用,tcjaz3能够在红豆杉体内与tcmyc2结合从而抑制其活性。表明中国红豆杉体内同样存在jaz-myc沉默体的调控模式。综上,本文初步总结了以tcerf12/15、tcmyc2和tcjaz3为核心的ja信号调控中国红豆杉紫杉醇生物合成的模式,为构建高产转基因细胞系或植株奠定了基础。同时,本文初次报道了TcERF12响应JA信号并负调控植物次级代谢产物合成的现象,为完善JA信号调控网络奠定了基础。
牟燕[10]（2015）在《内生真菌Dzf12螺二萘类化合物Palmarumycins C12和C13的生产调控》文中研究表明植物内生真菌能够产生多种结构新颖的次生代谢产物,是新型天然活性物质的重要来源,在农业、医药业和食品工业等领域具有潜在的应用价值。有效提高内生真菌中活性物质的产量,对于代谢产物的开发和利用具有重要意义。本论文主要围绕药用植物盾叶薯蓣内生真菌Dzf12中螺二萘类化合物,通过金属离子、固-液两相培养系统、液-液两相培养系统等途径促进内生真菌Dzf12中螺二萘类化合物的合成,并对生产调控过程中产生的螺二萘类化合物进行了分离鉴定和生物活性评价。同时,为了研究内生真菌Dzf12中螺二萘类化合物生物合成途径,对内生真菌Dzf12进行了基因组测序,预测其次生代谢产物基因。主要研究结果如下:1、为了研究金属离子对内生真菌Dzf12产螺二萘类化合物的影响,首先建立和优化了内生真菌Dzf12中Palmarumycins C12和C13的提取方法以及HPLC定量分析条件。通过单因素方差法,对8种金属离子（Na+、Ca2+、Ag+、Co2+、Cu2+、A13+、Zn2+和Mn4+）进行初筛,明确利于内生真菌 Dzf12 生产 Palmarumycins C13 的金属离子为 Ca2+、Cu2+和 A13+。Ca2+、Cu2+和Al3+的添加量和添加时间对内生真菌Dzf12菌丝生物量及其Palmarumycins C12和C13产量有重要的影响。Ca2+对内生真菌Dzf12菌丝生物量及其Palmarumycins C12和C13产量的促进作用最大时,其最佳添加时间为第3天、最佳添加量取值范围为5.0～10.0 mmol/L;Cu2+对内生真菌Dzf12菌丝生物量及其Palmarumycins C12和C13产量的促进作用最大时,其最佳添加时间为第3天,最佳添加量取值范围为1.0～2.0mmol/L;Al3+对内生真菌Dzf12菌丝生物量及其Palmarumycins C12和C13产量的促进作用最大时,其最佳添加时间为第6天,最佳添加量取值范围为 1.5～2.5 mmol/L。进一步研究了 Ca2+、Cu2+和Al3+的复合效应对内生真菌Dzf12菌丝生物景及其Palmarumycins C12和C13产量的影响。利用CCD和RSM分析分别建立了 Ca2+、Cu2+和A13+与菌丝生物量和Palmarumycin C13 产量的二次多项式回归模型。当 Ca2+为 12.38 mmol/L、Cu2+为 1.62 mmol/L、Al3+为1.50 mmol/L时,所得到的内生真菌Dzf12菌丝生物量的实际最大值为8.95 g dw/L,为对照（6.39 g dw/L）的 1.40 倍;当 Ca2+为 7.58 mmol/L、Cu2+为 1.36 mmol/L、Al3+为 2.05 mmol/L 时,所得到的Palmarumycin C13产量的实际最大值为203.85 mg/L,为对照（33.98 mg/L）的6.00倍。2、采用大孔吸附树脂研究了固-液两相培养系统对内生真菌Dzf12产螺二萘类化合物的影响,在 10 种大孔吸附树脂（D-101、D1300、HPD-100、X-5、AB-8、DM130、ADS-17、DA-201、NKA-9和S-8）中,X-5、AB-8和ADS-17对内生真菌Dzf12菌丝生长有轻微的促进作用;HPD100、AB-8和DA-201能同时提高Palmarumycins C12和C13的产量,其中DA-201的促进作用最为显着。进一步研究了大孔吸附树脂DA-201的添加量对内生真菌Dzf12生长及其Palmarumycins C12和C13产量的影响。当树脂DA-201的添加量为4.17%（g/mL）时,Palmarumycin C12和Palmarumycin C13各自的总产量均达到最大值144.64 mg/L和48.30 mg/L,分别为对照（2.18和30.37 mg/L）的66.34 和 1.59 倍。在明确了 DA-201树脂最佳添加量的基础上,研究了树脂DA-201的添加时间对内生真菌Dzf12生长及其Palmarumycins C12和 C13产量的影响。当4.17%（g/mL）的树脂DA-201于第11天加入内生真菌Dzf12发酵培养基中,共培养至第15天收获,Palmarumycins C12和C13各自的总产量均达到最大值149.86和55.78 mg/L,分别为对照（2.12和30.70 mg/L）的70.69和1.82倍,其中 95.81%的 Palmarumycin C12 和 87.20%的Palmarumycin C13 被吸附至树脂 DA-201 中。3、为了研究液-液两相培养系统对内生真菌Dzf12产螺二萘类化合物的影响,通过单因素试验从10种有机化合物中筛选出三十二烷、正十六烷、1-十六烯、液体石蜡、邻苯二甲酸二丁酯、汕酸丁醋和油酸,均能不同程度促进内生真菌Dzf12中Palmarumycin C12或C13的合成。通过研究7种有机化合物的添加量和添加时间的复合效应发现:①正十六烷、1-十六烯和液体石蜡可以促进内生真菌Dzf12菌丝的生长,其中1-十六烯的促进作用最大。当5%（v/v）1-十六烯于第6天添加,菌丝生物量最大为9.60gdw/L,相比对照（6.20gdw/L）提高了 1.55倍;②邻苯二甲酸二丁酯、油酸丁酯和油酸3种有机化合物能够吸附螺二萘类化合物,主要利于Palmarumycin C12的合成,其中油酸的促进作用最大。当5%（v/v）油酸在第0天添加,Palmarumycin C12的产量最大为184.74 mg/L,约为对照的45倍;③正十二烷、正十六烷、1-十六烯和液体石蜡4种有机化合物不能吸附螺二萘类化合物,主要有利于Palmarumycin C13的合成,其中液体石蜡的促进作用最大。当液体石蜡在第0天添加10～15%、在第3天添加10%或在第6天添加5%时,Palmarumycin C13在菌丝和培养液中的总产量均能达到130mg/L以上,约为对照的4.22倍。在内生真菌Dzf12发酵培养基中添加1-十六烯后,从共培养液中分离、纯化和鉴定得到两个螺二萘类化合物Palmarumycins C2和C3,这是首次从内生真菌Dzf12中分离得到。通过活性测定,Palmarumycins C2和C3表现出了很好的抗细菌活性,对稻瘟病菌孢子的萌发也有较强的抑制作用,其抗氧化活性较弱。同时,为了最大限度地促进内生真菌Dzf12中Palmarumycins C2和C3的合成,优化了 1-十六烯的最佳添加条件:当在第6天添加10%（v/v）1-十六烯,Palmarumycin C2产量达到最大值0.40 g/L,为对照（0.01 g/L）的40.00倍,Palmarumycin C3的产量达到最大值1.19 g/L,为对照（0.02g/L）的59.50倍。1-十六烯是首次用作两相培养系统的第二相,能有效促进次生代谢产物的合成。4、对内生真菌Dzf12进行了基因组测序,预测其次生代谢产物基因。在内生真菌Dzf12基因组中共有35个次生代谢产物合成基因,其中包括19个PKS基因,1个PKS-like基因,7个NRPS基因,6个NRPS-like基因和2个TS基因。通过与文献比对,推测g5855基因可能为螺二萘类化合物合成的相关酶基因。本论文研究有效提高了内生真菌Dzf12中螺二萘类化合物的产量,为阐明螺二萘类化合物的生物合成途径,以及内生真菌Dzf12大规模工业化生产螺二萘类化合物提供了依据。
二、紫杉醇生物合成酶的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、紫杉醇生物合成酶的研究进展（论文提纲范文）
（1）UV-B辐射对东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类成分的合成代谢调控机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 东北红豆杉研究进展 |
| 1.1.1 东北红豆杉概述 |
| 1.1.2 东北红豆杉的主要活性成分 |
| 1.1.3 东北红豆杉的主要药理活性 |
| 1.2 东北红豆杉组织培养技术的研究进展 |
| 1.3 UV-B辐射对植物次生代谢的影响研究进展 |
| 1.3.1 UV-B辐射对植物次生代谢产物合成积累的影响 |
| 1.3.2 植物响应UV-B辐射的次生代谢防御调控机制 |
| 1.4 转录组测序技术在植物次生代谢产物生物合成和调控领域的研究进展 |
| 1.4.1 转录组测序技术在次生代谢产物生物合成关键基因挖掘方面的应用 |
| 1.4.2 转录组测序技术在阐明次生代谢产物生物合成调控机制方面的应用 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 UHPLC-MS/MS检测东北红豆杉中关键紫杉烷和黄酮类化合物分析方法的建立 |
| 2.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 标准品溶液的配制 |
| 2.2.2 UHPLC-MS/MS分析检测 |
| 2.2.3 方法学考察 |
| 2.2.4 数理统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 UHPLC-MS/MS色谱条件的优化 |
| 2.3.2 UHPLC-MS/MS质谱条件的优化 |
| 2.3.3 方法学验证 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 UV-B辐射对东北红豆杉组培苗中紫杉烷和黄酮类成分积累水平的影响 |
| 3.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 东北红豆杉组培体系的建立及UV-B辐射处理 |
| 3.2.2 标准品溶液的配制 |
| 3.2.3 样品溶液的制备 |
| 3.2.4 UHPLC-MS/MS分析检测 |
| 3.2.5 数理统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 东北红豆杉组培苗体系的建立 |
| 3.3.2 UV-B辐射对东北红豆杉组培苗中紫杉烷类含量变化的影响 |
| 3.3.3 UV-B辐射对东北红豆杉组培苗中黄酮类含量变化的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 不同UV-B辐射时长处理的东北红豆杉样品转录组测序 |
| 4.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 实验样品制备 |
| 4.2.2 总RNA提取和cDNA文库制备 |
| 4.2.3 转录组测序和序列拼接聚类 |
| 4.2.4 基因功能注释和CDS预测 |
| 4.2.5 参考序列比对和基因表达水平分析 |
| 4.2.6 差异基因鉴定和GO、KEGG富集分析 |
| 4.2.7 数理统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 东北红豆杉无参转录组测序及数据质量评估 |
| 4.3.2 基因功能注释分析 |
| 4.3.3 参考序列比对和基因表达水平分析 |
| 4.3.4 转录组测序差异基因鉴定和表达富集分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 UV-B辐射对东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类成分的合成代谢调控机制解析 |
| 5.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 代谢路径相关基因分析 |
| 5.2.2 候选酶基因qRT-PCR分析 |
| 5.2.3 数理统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 黄酮类化合物生物合成路径中差异基因分析及候选酶基因筛选 |
| 5.3.2 紫杉烷类化合物生物合成路径中差异基因分析及候选酶基因筛选 |
| 5.3.3 候选酶基因qRT-PCR分析验证 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）东北红豆杉中紫杉烷对UV-B辐射的响应规律及其代谢调控分子机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 东北红豆杉研究进展 |
| 1.1.1 东北红豆杉简介 |
| 1.1.2 东北红豆杉主要化学成分 |
| 1.1.3 东北红豆杉主要药理活性 |
| 1.2 UV-B对植物的影响 |
| 1.2.1 UV-B简介 |
| 1.2.2 UV-B对植物生理生态特征的影响 |
| 1.2.3 UV-B对植物次生代谢产物的影响与调控 |
| 1.3 紫杉醇的生物合成通路及代谢调控 |
| 1.3.1 紫杉醇生物合成通路关键酶基因研究进展 |
| 1.3.2 紫杉醇生物合成通路中转录因子的调控 |
| 1.4 转录组学研究 |
| 1.4.1 转录组测序技术优势 |
| 1.4.2 转录组学在植物次生代谢产物生物合成调控的研究进展 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 红豆杉靶向代谢物的质量控制分析方法的研究 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器与试剂 |
| 2.1.3 标准溶液的配制 |
| 2.1.4 样品溶液的制备 |
| 2.1.5 UPLC-MS/MS分析检测 |
| 2.1.6 数理统计分析 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 UPLC-MS/MS分析方法的优化 |
| 2.2.2 方法学验证 |
| 2.2.3 样品制备工艺的优化 |
| 2.2.4 红豆杉样品的测定 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 东北红豆杉针叶紫杉烷及黄酮成分对UV-B的代谢响应 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 实验仪器与试剂 |
| 3.1.2 实验材料及处理 |
| 3.1.3 样品制备 |
| 3.1.4 UPLC-MS/MS检测分析 |
| 3.1.5 数理统计分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 UV-B辐射对东北红豆杉针叶紫杉烷类化合物积累的影响 |
| 3.2.2 UV-B辐射下紫杉烷类成分相关性分析 |
| 3.2.3 UV-B辐射对东北红豆杉针叶黄酮类化合物积累的影响 |
| 3.2.4 紫杉烷及黄酮成分对UV-B的代谢响应的相关性及比较分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 东北红豆杉对UV-B辐射的生理生态响应 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器与试剂 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 数理统计分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 UV-B辐射对东北红豆杉叶片生物量及相对含水量的影响 |
| 4.2.2 UV-B辐射对东北红豆杉气体交换参数的影响 |
| 4.2.3 UV-B辐射对东北红豆杉光合色素含量的影响 |
| 4.2.4 UV-B辐射对东北红豆杉抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响 |
| 4.2.5 UV-B对东北红豆杉生理生化指标影响的相关性分析 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 UV-B处理东北红豆杉的转录组测序及数据分析 |
| 5.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 东北红豆杉mRNA文库构建 |
| 5.2.2 测序分析流程 |
| 5.2.3 数据过滤及序列Denovo组装 |
| 5.2.4 CDS预测 |
| 5.2.5 基因比对和注释 |
| 5.2.6 基因表达水平分析 |
| 5.2.7 差异表达基因分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 RNA质量检测 |
| 5.3.2 测序数据质量及组装结果分析 |
| 5.3.3 基因功能注释 |
| 5.3.4 基因表达水平分析 |
| 5.3.5 差异表达基因分析 |
| 5.3.6 差异基因GO及KEGG分析 |
| 5.3.7 东北红豆杉中紫杉醇合成通路KEGG注释分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 UV-B调控东北红豆杉中紫杉醇合成通路的机制解析 |
| 6.1 实验部分 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器与试剂 |
| 6.1.3 东北红豆杉总RNA提取 |
| 6.1.4 cDNA合成 |
| 6.1.5 东北红豆杉紫杉醇生物合成关键酶基因及WRKY转录因子筛选鉴定 |
| 6.1.6 东北红豆杉中WRKY转录因子的生物信息学分析 |
| 6.1.7 东北红豆杉紫杉醇合成途径关键酶基因及调控因子的引物设计 |
| 6.1.8 实时荧光定量PCR分析 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 UV-B诱导东北红豆杉中紫杉醇合成途径基因表达模式分析 |
| 6.2.2 东北红豆杉WRKY转录因子的筛选与鉴定 |
| 6.2.3 东北红豆杉WRKY转录因子的生物信息学分析 |
| 6.2.4 UV-B诱导东北红豆杉中WRKY基因的表达模式分析 |
| 6.3 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（3）东北红豆杉内生真菌多样性与紫杉烷积累的相关性规律解析及其高产菌株的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 红豆杉研究概况 |
| 1.1.1 红豆杉简介 |
| 1.1.2 红豆杉化学成分研究进展 |
| 1.1.3 代谢组学在红豆杉的研究进展 |
| 1.2 植物内生真菌研究概况 |
| 1.2.1 植物内生真菌简介 |
| 1.2.2 内生真菌与植物互作关系研究 |
| 1.2.3 内生真菌在药用植物研究中的应用 |
| 1.2.4 内生真菌种属分布与宿主生物活性物质的相关性研究 |
| 1.3 红豆杉内生真菌产紫杉烷的分子机制 |
| 1.4 研究的目的意义 |
| 1.5 本课题的研究内容及技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 东北红豆杉内生真菌的分离与多样性分析 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 东北红豆杉来源 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 实验材料及试剂 |
| 2.1.4 培养基以及试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 东北红豆杉内生真菌的分离 |
| 2.2.2 东北红豆杉内生真菌的鉴定 |
| 2.2.3 东北红豆杉内生真菌多样性 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 东北红豆杉内生真菌的分离结果 |
| 2.3.2 东北红豆杉植物不同器官内生真菌多样性分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 东北红豆杉不同器官代谢组学研究 |
| 3.1 实验仪器与材料 |
| 3.1.1 植物样品 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 东北红豆杉植物样品处理及制备 |
| 3.2.2 UPLC-MS/MS对标志性紫杉类化合物定量分析 |
| 3.2.3 非靶向代谢组学对不同部位东北红豆杉代谢组学研究 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 标志性紫杉类化合物定量分析 |
| 3.3.2 UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS对东北红豆杉整体代谢物的鉴定 |
| 3.3.3 紫杉醇途径前体物质、中间产物和紫杉烷类代谢物差异分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 东北红豆杉内生真菌与宿主的相关性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 东北红豆杉内生真菌分类和鉴定 |
| 4.1.2 东北红豆杉紫杉类化合物的含量分析 |
| 4.1.3 内生真菌菌群结构与宿主紫杉类化合物的相关性 |
| 4.1.4 内生真菌产与宿主相同紫杉烷类成分的筛选与鉴定 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 内生真菌菌群结构与紫杉类化合物的相关性 |
| 4.2.2 内生真菌与紫杉醇通路及其他紫杉类化合物的相关性 |
| 4.2.3 内生真菌与紫杉烷类化合物含量的相关性 |
| 4.2.4 内生真菌产与宿主紫杉烷化合物的筛选 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 东北红豆杉内生真菌R8-3-4的发酵工艺优化及应用 |
| 5.1 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 实验材料及试剂 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 内生真菌R8-3-4的发酵条件单因素优化 |
| 5.2.2 诱导子对内生真菌R8-3-4发酵优化 |
| 5.2.3 磁性固定化内生真菌R8-3-4发酵产10-DAB |
| 5.2.4 统计学处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 内生真菌R8-3-4发酵条件单因素优化 |
| 5.3.2 添加诱导子对内生真菌R8-3-4发酵优化 |
| 5.3.3 磁性固定化10-DAB半连续发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（4）二萜类化合物紫杉醇和丹参酮的生物合成与调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 植物二萜类化合物生物合成研究进展 |
| 1.1 植物来源的二萜类化合物生物合成途径 |
| 1.2 紫杉醇生物合成途径及调控 |
| 1.3 丹参酮生物合成途径及调控 |
| 2 植物次生代谢基因簇研究进展 |
| 2.1 原核生物的操纵子与真核生物基因簇 |
| 2.2 基因簇中的“信号”基因和“剪裁”基因 |
| 2.3 植物基因簇的一般特征 |
| 2.4 植物基因簇形成的分子机制 |
| 3 天然产物的生物合成途径解析策略 |
| 3.1 代谢途径的推测 |
| 3.2 候选基因的筛选 |
| 3.3 候选基因的功能鉴定 |
| 4 参与二萜代谢的植物细胞色素P450 |
| 4.1 参与二萜代谢的植物细胞色素P450的分布 |
| 4.2 参与二萜代谢的植物细胞色素P450的底物特异性 |
| 4.3 参与半日花烷型二萜代谢的细胞色素P450 |
| 5 脱落酸及其信号转导途径研究进展 |
| 5.1 脱落酸合成途径 |
| 5.2 脱落酸信号转导途径 |
| 5.3 脱落酸与植物非生物胁迫应答 |
| 5.4 脱落酸与植物次生代谢调控 |
| 6 研究目的和意义 |
| 7 参考文献 |
| 第二章 基于高通量测序的紫杉醇生物合成及调控研究 |
| 1 材料、试剂与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA的提取 |
| 2.2 Pacbio Sequel cDNA文库构建及上机测序 |
| 2.3 Iso-Seq数据分析 |
| 2.4 RNA-Seq测序与数据分析 |
| 2.5 基因功能注释和差异表达分析 |
| 2.6 紫杉醇途径候选基因的筛选 |
| 2.7 系统进化分析 |
| 2.8 实时荧光定量PCR |
| 2.9 RT-PCR |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RNA的提取与质量检测 |
| 3.2 高通量转录组测序 |
| 3.3 基因功能注释 |
| 3.4 差异表达分析 |
| 3.5 紫杉醇途径候选细胞色素P450的筛选 |
| 3.6 紫杉醇途径候选BAHD酰基转移酶的筛选 |
| 3.7 调控紫杉醇生物合成的转录因子候选基因的筛选 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 基于BAC测序的丹参酮合成基因簇研究 |
| 1 材料、试剂与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 培养基与缓冲液 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BAC的筛选、高通量测序与组装 |
| 2.2 实时荧光定量PCR |
| 2.3 载体的构建 |
| 2.4 目的基因的表达 |
| 2.5 丹参毛状根的制备和培养 |
| 2.6 产物的化学检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BAC文库的构建 |
| 3.2 目标BAC克隆的筛选 |
| 3.3 目标BAC克隆的高通量测序 |
| 3.4 BAC的组装 |
| 3.5 丹参酮合成基因簇的特征 |
| 3.6 细胞色素P450的鉴定研究 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 脱落酸对丹参次生代谢的调控研究 |
| 1 材料、试剂与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA的提取 |
| 2.2 Nanopore PromethION文库构建及上机测序 |
| 2.3 数据下机后的处理 |
| 2.4 参与脱落酸合成和信号转导途径的基因的筛选 |
| 2.5 参与丹参酮和丹酚酸途径合成与调控基因的筛选 |
| 2.6 顺式作用元件分析 |
| 2.7 RT-PCR |
| 3 实验结果 |
| 3.1 转录组测序和数据处理 |
| 3.2 脱落酸诱导下差异表达基因分析 |
| 3.3 脱落酸诱导下可变剪切分析 |
| 3.4 脱落酸合成与信号转导途径基因对脱落酸的响应 |
| 3.5 脱落酸对丹参酮与丹酚酸合成途径的调控作用 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 结论 |
| 缩略词 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类成分合成代谢影响与初步机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 东北红豆杉的研究进展 |
| 1.1.1 东北红豆杉简介 |
| 1.1.2 东北红豆杉中主要化学成分简介 |
| 1.1.3 东北红豆杉的主要药理活性研究进展 |
| 1.2 紫杉烷类化合物药源途径研究 |
| 1.2.1 植物提取法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 生物发酵法 |
| 1.2.4 组织培养法 |
| 1.3 植物组织培养技术在药用活性成分生产中的研究进展 |
| 1.3.1 植物细胞培养技术 |
| 1.3.2 植物器官培养技术 |
| 1.4 光质在植物组培体系应用中的研究进展 |
| 1.4.1 光质在植物组培快繁中的应用研究进展 |
| 1.4.2 光质在增强植物组培体系生产次生代谢活性产物中的应用研究进展 |
| 1.5 红豆杉组织培养生产紫杉烷类活性成分的研究进展 |
| 1.6 紫杉烷化合物生物合成途径关键酶及基因 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 2 东北红豆杉愈伤组织培养体系的建立 |
| 2.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 外植体的制备 |
| 2.2.2 外植体消毒处理过程的优化 |
| 2.2.3 愈伤组织诱导及增殖培养条件的优化 |
| 2.2.4 抗褐化剂的优化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 外植体消毒处理的优化 |
| 2.3.2 愈伤组织诱导及增殖条件的优化 |
| 2.3.3 抗褐化剂的优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物积累量的影响 |
| 3.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 光源的选择 |
| 3.2.2 不同光质处理过程 |
| 3.2.3 样品溶液的制备 |
| 3.2.4 UPLC-MS/MS分析检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物积累量的影响 |
| 3.3.2 红光照射时长对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物积累量的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 LED光对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物生物合成相关基因表达的影响 |
| 4.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 cDNA的制备 |
| 4.2.3 qRT-PCR分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物生物合成酶基因表达水平的影响 |
| 4.3.2 红光照射时长对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类化合物酶基因表达水平的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）枝霉MD2的转录组测序及两个紫杉醇合成相关候选基因的过表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 药用植物内生菌 |
| 1.1.1 药用植物内生菌的研究价值 |
| 1.1.2 药用植物内生菌的研究进展 |
| 1.1.3 典型药用植物的内生菌 |
| 1.2 产紫杉醇内生菌 |
| 1.2.1 分离自红豆杉的产紫杉醇内生菌 |
| 1.2.2 分离自非红豆杉植物的产紫杉醇内生菌 |
| 1.2.3 紫杉醇的生物合成途径 |
| 1.3 紫杉醇合成途径中的酰基转移酶 |
| 1.3.1 紫杉二烯-5α-醇-O-乙酰转移酶 |
| 1.3.2 紫杉烷2α-苯甲酰基转移酶 |
| 1.3.3 10β-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基转移酶 |
| 1.3.4 巴卡亭Ⅲ3-氨基-3-苯丙醇基转移酶 |
| 1.3.5 3 '-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇N-苯甲酰基转移酶 |
| 1.4 本研究的内容、目的与意义 |
| 第二章 枝霉MD2的转录组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与主要仪器 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 总RNA的提取 |
| 2.3.2 cDNA文库的构建和测序 |
| 2.3.3 转录组的de-novo组装分析 |
| 2.3.4 转录组基因的功能注释 |
| 2.3.5 潜在的真菌紫杉醇生物合成途径分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 枝霉MD2 转录组的测序与组装 |
| 2.4.2 转录组unigenes的功能注释 |
| 2.4.3 Unigenes的 GO和 KOG功能注释 |
| 2.4.4 Unigenes的 KEGG通路分析 |
| 2.4.5 枝霉MD2 中紫杉醇生物合成途径的预测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 候选基因的生物信息分析及其转基因菌株的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与主要仪器 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 候选基因A05868和A02976 的克隆和生物信息分析 |
| 3.3.2 候选基因超表达载体的构建 |
| 3.3.3 转基因菌株的构建 |
| 3.3.4 转基因菌株的抗性基因hpt II分子检测及平板验证 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 候选基因的生物信息学分析 |
| 3.4.2 过表达载体的构建及转基因菌株的筛选 |
| 3.4.3 转基因菌株的抗性基因检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 A05868 超表达转基因菌株的验证与分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与主要仪器 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 A05868/MD2 转基因菌株的Southern blot检测 |
| 4.3.2 A05868/MD2 转基因菌株的q RT-PCR分析 |
| 4.3.3 A05868/MD2 转基因菌株的紫杉烷类的提取和HPLC检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 A05868/MD2 转基因菌株的目标基因的拷贝数分析 |
| 4.4.2 A05868/MD2 转基因菌株的目标基因的表达分析 |
| 4.4.3 A05868/MD2 转基因菌株的紫杉烷类检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 A02976 超表达转基因菌株的验证与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与主要仪器 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 A02976-MD2 转基因菌株的Southern blot检测 |
| 5.3.2 A02976/MD2 转基因菌株的目标基因的表达分析 |
| 5.3.3 A02976/MD2 转基因菌株的紫杉烷类检测 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 A02976/MD2 转基因菌株的目标基因的拷贝数分析 |
| 5.4.2 A02976/MD2 转基因菌株的目标基因表达分析 |
| 5.4.3 A02976/MD2 转基因菌株的紫杉烷类检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表学术论文及专利申请 |
| 致谢 |
（7）南方红豆杉野生型和变异品系‘金锡杉’针叶代谢组和转录组比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词及其英汉对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 南方红豆杉概述 |
| 1.1 南方红豆杉介绍 |
| 1.2 南方红豆杉重要的应用价值 |
| 2 紫杉醇生物合成方法和途径 |
| 2.1 紫杉醇合成方法 |
| 2.2 紫杉醇生物合成途径 |
| 3 红豆杉代谢组学的研究 |
| 3.1 代谢组学技术 |
| 3.2 代谢组学在红豆杉研究中的应用 |
| 4 红豆杉转录组学的研究 |
| 4.1 转录组学技术 |
| 4.2 转录组学在红豆杉研究中的应用 |
| 5 本研究目的、意义及主要研究内容 |
| 5.1 本研究目的及意义 |
| 5.2 研究内容 |
| 第二章 南方红豆杉野生型与变异品系‘金锡杉’针叶代谢物的比较分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集和提取方法 |
| 1.2 LC-ESI-MS/MS液相色谱电离串联质谱分析 |
| 1.3 数据分析与差异代谢物筛选 |
| 1.4 紫杉醇含量测定 |
| 1.5 数据分析及图片处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 代谢物定性定量分析 |
| 2.2 统计分析 |
| 2.3 南方红豆杉野生型和变异品系‘金锡杉’之间代谢物的差异分析 |
| 2.4 显着差异代谢物KEGG通路富集分析 |
| 2.5 南方红豆杉野生型和‘金锡杉’紫杉醇含量差异分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 南方红豆杉野生型与变异品系‘金锡杉’针叶转录组的比较分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 紫杉醇含量测定 |
| 1.3 RNA提取 |
| 1.4 文库的建立和测序 |
| 1.5 原始数据组装及unigene基本功能注释 |
| 1.6 差异表达基因的鉴定 |
| 1.7 荧光实时定量分析验证 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 南方红豆杉野生型和变异品系‘金锡杉’紫杉醇含量 |
| 2.2 Illumina测序、序列组装和unigene的基本注释 |
| 2.3 差异基因GO功能注释和KEGG pathway显着性富集分析 |
| 2.4 参与紫杉醇生物合成途径中的DEGs |
| 2.5 参与植物激素信号转导途径中的DEGs |
| 2.6 南方红豆杉野生型和变异品系‘金锡杉’针叶中转录因子调控表达 |
| 2.7 差异表达基因qRT-PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 南方红豆杉中紫杉醇提取工艺的优化 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）萜类化合物生物合成元件的挖掘与产物的高效合成（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 萜类化合物的生物合成 |
| 1.1.1 萜类化合物简介 |
| 1.1.2 萜类化合物的生物合成途径 |
| 1.1.3 MEP和MVA途径在萜类化合物代谢工程改造中的应用 |
| 1.2 代谢工程与萜类化合物的高效合成 |
| 1.2.1 代谢工程简介 |
| 1.2.2 代谢工程增加萜类化合物产量的策略 |
| 1.2.2.1 平衡萜类化合物生物合成途径中各个酶组分的表达 |
| 1.2.2.2 碳代谢及能量代谢的平衡 |
| 1.2.2.3 细胞膜与萜类化合物的高效合成 |
| 1.3 代谢工程在萜类化合物生物合成领域的应用 |
| 1.3.1 代谢工程改造E.coli合成紫杉烷类化合物 |
| 1.3.2 代谢工程改造E.coli和S. cerevisiae合成青蒿酸 |
| 1.3.3 代谢工程改造丝状真菌合成萜类化合物 |
| 1.4 萜类化合物生物合成元件及其产物的挖掘 |
| 1.4.1 传统的萜类化合物挖掘手段 |
| 1.4.2 基因组测序辅助萜类化合物挖掘 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 第二章 实验材料与研究方法 |
| 2.1 培养基 |
| 2.1.1 大肠杆菌及根癌农杆菌常用培养基 |
| 2.1.2 丝状真菌常用培养基 |
| 2.1.3 酿酒酵母常用培养基 |
| 2.2 仪器及试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌基因组总DNA的提取 |
| 2.3.2 丝状真菌基因组总DNA的提取 |
| 2.3.3 丝状真菌RNA的提取 |
| 2.3.4 反转录单链cDNA |
| 2.3.5 小量PCR产物的纯化及凝胶回收DNA片段 |
| 2.3.6 DNA的酶切反应 |
| 2.3.7 DNA的酶连反应 |
| 2.3.8 Simple Cloning方法组装载体 |
| 2.3.9 大肠杆菌质粒DNA的少量提取 |
| 2.3.10 Gibson方法组装载体 |
| 2.3.11 大肠杆菌组氨酸标签重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.12 大肠杆菌组氨酸标签重组蛋白的纯化 |
| 2.3.13 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.3.14 DNA assemble方法在S.cerevisiae体内构建重组质粒 |
| 2.3.15 LiAc法转化S.cerevisiae |
| 2.3.16 根癌农杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 2.3.18 Real-Time检测荧光蛋白的表达情况 |
| 2.3.19 萜类合酶的体外反应 |
| 2.3.20 萜类合酶的体外酶动力学检测 |
| 2.3.21 萜类化合物的GC-MS检测 |
| 2.3.22 ECD谱计算化合物绝对构型 |
| 2.3.23 基因组,转录组测序和组装 |
| 2.3.24 基因组注释 |
| 2.3.25 同源建模 |
| 第三章 基于MVA途径的萜类化合物合成平台的搭建及紫杉二烯的合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 质粒 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 E.coli体内高产萜类化合物平台的构建及紫杉二烯的合成 |
| 3.3.2 A.alternata TPF6遗传操作系统的建立及外源启动子强度的研究 |
| 3.3.3 A.alternata TPF6体内萜类化合物合成平台的搭建及紫杉二烯的合成 |
| 3.3.4 高产萜类化合物 S.cerevisiae平台的构建 |
| 3.3.4.1 改造MVA途径质粒的构建 |
| 3.3.4.2 高产萜类化合物 S.cerevisiae平台的构建 |
| 3.4 本章小结与展望 |
| 第四章 基于组合生物合成策略的不同类型萜类化合物合成平台的搭建及产物挖掘 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 质粒 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 F.graminearum J1-012基因组测序及组装 |
| 4.3.2 Ⅰ型萜类合酶的挖掘 |
| 4.3.3 F.graminearum J1-012来源萜类化合物的挖掘及组合生物合成 |
| 4.3.4 基于组合生物合策略的FgMS以及FgGS生物合成潜力挖掘 |
| 4.3.5 理性改造FgMS拓展其产物合成能力 |
| 4.3.6 FgMS和FgGS产物合成化学机理的推测 |
| 4.3.7 真菌来源clade Ⅲ分支Ⅰ型萜类合酶系统发育分析 |
| 4.4 本章小结与展望 |
| 第五章 搭建S.cerevisiae平台挖掘倍半萜合酶及其新骨架化合物 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株及质粒 |
| 5.2.2 引物 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 FgJ03939蛋白纯化底物识别能力研究 |
| 5.3.2 酵母高产倍半萜平台及其在真菌天然产物挖掘领域的应用 |
| 5.3.3 FgFS新骨架化合物的化学合成机理 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 本研究工作总结 |
| 6.2 本研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
（9）中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 紫杉醇的研究进展 |
| 1.2 植物体内JA信号传导机理的研究进展 |
| 1.3 JA-responsive转录因子的研究概况 |
| 1.4 JA信号调控药用植物次级代谢产物合成模式的研究进展 |
| 1.5 本文的研究目的和内容 |
| 2 中国红豆杉中紫杉醇合成酶基因启动子的鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 TASY基因启动子的分析及功能鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 与JRE元件相互作用的TcERFs的克隆与功能分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 JA信号途径上游基因的克隆及功能验证 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 本文的主要创新点 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 攻读博士期间发表文章 |
| 附录Ⅱ 主要引物序列 |
| 附录Ⅲ 基因扩增及载体构建图片 |
| 附录Ⅳ 主要缩略词 |
（10）内生真菌Dzf12螺二萘类化合物Palmarumycins C12和C13的生产调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| Abbreviation |
| 第1章 前言 |
| 1.1 影响次生代谢产物生物合成因素的研究概况 |
| 1.1.1 金属离子对次生代谢产物生物合成的影响 |
| 1.1.2 两相培养系统对次生代谢产物生物合成的影响 |
| 1.1.3 前体对次生代谢产物生物合成的影响 |
| 1.1.4 展望 |
| 1.2 螺二萘类化合物生物合成研究进展 |
| 1.2.1 螺二萘类化合物的种类及其生物活性 |
| 1.2.2 螺二萘类化合物的化学/生物合成途径 |
| 1.2.3 螺二萘类化合物生物合成前体相关酶基因的研究 |
| 1.2.4 展望 |
| 1.3 内生真菌Dzf12及其次生代谢产物的研究概况 |
| 1.3.1 内生真菌Dzf12 |
| 1.3.2 内生真菌Dzf12次生代谢产物及其生物活性 |
| 1.3.3 内生真菌Dzf12次生代谢产物的生产调控 |
| 1.3.4 展望 |
| 1.4 论文设计 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究目的和意义 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 1.4.4 技术路线 |
| 第2章 金属离子对Dzf12生长及Palmarumycins C_(12)和C_(13)生产的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 内生真菌Dzf12 |
| 2.1.2 仪器设备和试剂 |
| 2.1.3 内生真菌Dzf12的培养条件 |
| 2.1.4 金属离子溶液的应用 |
| 2.1.5 内生真菌Dzf12菌丝生物量的测定 |
| 2.1.6 Palmarumycins C_(12)和C_(13)的提取 |
| 2.1.7 Palmarumycins C_(12)和C_(13)的定量分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 八种金属离子的影响 |
| 2.2.2 Ca~(2+)添加量与添加时间的影响 |
| 2.2.3 Cu~(2+)添加量与添加时间的影响 |
| 2.2.4 Al~(3+)添加量与添加时间的影响 |
| 2.2.5 Ca~(2+)、Cu~(2+)和Al~(3+)的复合效应 |
| 2.3 本章小结 |
| 第3章 固-液两相培养系统对Dzf12生长及Palmarumycins C_(12)和C_(13)生产的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 内生真菌Dzf12 |
| 3.1.2 仪器设备和试剂 |
| 3.1.3 内生真菌Dzf12的培养条件 |
| 3.1.4 大孔吸附树脂的应用 |
| 3.1.5 内生真菌Dzf12菌丝生物量的测定 |
| 3.1.6 Palmarumycins C_(12)和C_(13)的提取 |
| 3.1.7 Palmarumycins C_(12)和C_(13)的定量分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 十种大孔吸附树脂的影响 |
| 3.2.2 大孔吸附树脂DA-201添加量的影响 |
| 3.2.3 大孔吸附树脂DA-201添加时间的影响 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 液-液两相培养系统对Dzf12生长及螺二萘类化合物生产的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 内生真菌Dzf12 |
| 4.1.2 仪器设备和试剂 |
| 4.1.3 培养基与发酵条件 |
| 4.1.4 有机相的应用 |
| 4.1.5 Palmarumycins C_2和C_3的分离及其活性测定 |
| 4.1.6 内生真菌Dzf12菌丝生物量的测定 |
| 4.1.7 螺二萘类化合物的提取 |
| 4.1.8 螺二萘类化合物的定量分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 十种有机相的影响 |
| 4.2.2 七种有机相对内生真菌Dzf12菌丝生物量的影响 |
| 4.2.3 邻苯二甲酸二丁酯对Palmarumycins C_(12)和C_(13)产量的影响 |
| 4.2.4 油酸丁酯对Palmarumycins C_(12)和C_(13)产量的影响 |
| 4.2.5 油酸对Palmarumycins C_(12)和C_(13)产量的影响 |
| 4.2.6 正十二烷对Palmarumycins C_(12)和C_(13)产量的影响 |
| 4.2.7 正十六烷对Palmarumycins C_(12)和C_(13)产量的影响 |
| 4.2.8 液体石蜡对Palmarumycins C_(12)和C_(13)产量的影响 |
| 4.2.9 1-十六烯对螺二萘类化合物合成的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 第5章 内生真菌Dzf12的基因组分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 内生真菌Dzf12 |
| 5.1.2 仪器设备和试剂 |
| 5.1.3 内生真菌Dzf12的培养 |
| 5.1.4 基因组DNA的提取 |
| 5.1.5 基因组测序与拼接 |
| 5.1.6 基因预测与次生代谢产物合成基因的注释 |
| 5.1.7 系统发育分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 内生真菌Dzf12的基因组特征 |
| 5.2.2 内生真菌Dzf12基因组次生代谢相关基因分析 |
| 5.3 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 讨论 |
| 6.3 创新点 |
| 6.4 不足之处 |
| 6.5 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、紫杉醇生物合成酶的研究进展（论文参考文献）
- [1]UV-B辐射对东北红豆杉中紫杉烷和黄酮类成分的合成代谢调控机制初步研究[D]. 刘婧. 东北林业大学, 2021
- [2]东北红豆杉中紫杉烷对UV-B辐射的响应规律及其代谢调控分子机制解析[D]. 寇萍. 东北林业大学, 2021
- [3]东北红豆杉内生真菌多样性与紫杉烷积累的相关性规律解析及其高产菌株的应用[D]. 李弘琨. 东北林业大学, 2021
- [4]二萜类化合物紫杉醇和丹参酮的生物合成与调控研究[D]. 匡雪君. 北京协和医学院, 2020(05)
- [5]不同光质对东北红豆杉愈伤组织中紫杉烷类成分合成代谢影响与初步机制解析[D]. 王馨. 东北林业大学, 2020(02)
- [6]枝霉MD2的转录组测序及两个紫杉醇合成相关候选基因的过表达分析[D]. 刘盼. 中南民族大学, 2019(08)
- [7]南方红豆杉野生型和变异品系‘金锡杉’针叶代谢组和转录组比较研究[D]. 陈一鸣. 南京农业大学, 2019(08)
- [8]萜类化合物生物合成元件的挖掘与产物的高效合成[D]. 卞光凯. 武汉大学, 2017(06)
- [9]中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式研究[D]. 张蒙. 华中科技大学, 2016(08)
- [10]内生真菌Dzf12螺二萘类化合物Palmarumycins C12和C13的生产调控[D]. 牟燕. 中国农业大学, 2015(05)