一、血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究（论文文献综述）
陆俊佳[1]（2013）在《TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建》文中研究指明目的：克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性。方法：设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区。将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶（Luc）报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luco报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、 HUVEC及NIT-1细胞系,48小时后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况。结果：构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确；转染四种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域（-2056～+1）具有较强的转录活性。结论：成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域（-2056～+1）具有较强的启动子活性。目的：构建小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet41b（+）一endostat in.方法：设计并合成引物,以重组质粒pUC57-endostatin为模板,PCR扩增获得小鼠及人类的内皮抑素基因。将扩增获得小鼠及人类的内皮抑素基因分别插入原核表达载体pet41b（+）中,构建小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet41b（+）-endostatin.通过转化大肠杆菌BL21（DE3）获得小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb（+）一endostatin的大量扩增,进行菌落PCR,挑选阳性菌液提取质粒进行酶切检测,并进行测序分析。结果：构建的小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb（+）一endostat in经酶切鉴定及测序分析都显示正确。结论：成功的构建了小鼠及人类的内皮抑素基因的原核表达载体pet4lb （+）-endostatin.
陆卫忠,肖飞,黄桂君,李玉英,李瑾,陈维中,钱桂生[2]（2011）在《人血管能抑素抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生》文中研究表明目的:探讨人血管能抑素（canstatin）对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移和血管新生的影响。方法:将pCMV-Script/canstatin及空载体pCMV-Script通过电穿孔的方法转染A549细胞,G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR检测转染后细胞中canstatin mRNA的表达,Western blotting检测转染后细胞中canstatin蛋白的表达。建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,观察pCMV-Script/canstatin组A549细胞培养上清对小鼠Lewis肺癌移植瘤的治疗作用,免疫组化检测各治疗组荷瘤小鼠移植瘤的微血管密度。结果:pCMV-Script/canstatin转染A549细胞在G418筛选后成功形成克隆,转染的A549细胞能有效表达can-statin mRNA和蛋白。pCMV-Script/canstatin治疗组小鼠肿瘤体积明显小于pCMV-Script组和NS组[（1.47±0.21）cm3vs（2.43±0.15）cm3、（2.53±0.18）cm3,P<0.01);pCMV-Script/canstatin组、pCMV-Script组和NS组的肺转移结节数分别为（3.00±1.00）、（7.80±1.48）、（7.60±2.41）个,pCMV-Script/canstatin组肿瘤转移受到显着的抑制（P<0.01）;pCMV-Script/canstatin组小鼠的肿瘤组织微血管数明显少于pCMV-Script组和NS组[（84.40±8.83）vs（188.68±11.15）、（190.24±12.91）个,P<0.01]。结论:pCMV-Script/canstatin能在A549细胞中表达并分泌至细胞外,canstatin可明显抑制Lewis肺癌移植瘤的生长、转移和血管新生。
傅文达[3]（2011）在《As2O3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究》文中进行了进一步梳理目的：通过重组canstatin蛋白、As203及二者联合方式分别干预人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和肿瘤血管内皮细胞（Td-EC）,探讨干预因素对HUVEC和Td-EC生物学影响,为As203联合用药方案抗肿瘤的可行性和有效性提供实验基础和理论依据。方法：1.分别培养稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒肝癌HepG2细胞、HepG2细胞72h,提取上清液经超滤浓缩后,用Western-blot鉴定上清液中canstatin蛋白表达情况；2、HUVEC分离培养及鉴定。3.用肝癌HepG2细胞培养上清液培养HUVEC 72h,收集细胞,RT-PCR检测TEM1和TEM8的表达情况。4.实验按干预因素不同分重组组（稳定转染pcDNA3. 1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒的肝癌HepG2细胞培养上清液）、As203组（2μmol/L）、联合组（重组canstatin与As203蛋白）、空白组（HepG2细胞培养上清液）,各因素分别干预HUVEC和Td-EC,通过绘制生长曲线、Transwell小室法、流式细胞术、内皮细胞成管实验等方法检测细胞生物学。结果：1.Western-blot检测重组质粒肝癌HepG2细胞培养上清液,可见大小约为26KD的Canstatin蛋白条带。2.培养的HUVEC经荧光免疫染色后,可见细胞质内有黄绿色荧光,表明人Ⅷ因子相关抗原存在;3.肝癌HepG2细胞培养上清液培养诱导HUVEC, RT-PCR扩增产物电泳显示约287 bp及460 bp的条带,提示细胞表达肿瘤血管内皮细胞标志物TEM1和TEM8,4.1.对细胞生长活力的影响：细胞每24h倒置显微镜下观察细胞生长情况、存活细胞计数,绘制细胞生长曲线；结果显示,HUVEC、Td-EC随培养时间延长,存活细胞数递减,呈时间依赖性,前后天存活细胞数比较p<0.05,实验组间比较p<0.05；重组组、As203组与对照组比较p<0.05,联合组与对照组比较p<0.01; Td-EC空白组存活细胞数增加比HUVEC空白组明显,二组间比较p<0.05; Td-EC实验各组存活细胞数减少比对应HUVEC实验各组明显,组间比较p<0.05。4.2对细胞凋亡的影响,凋亡率（HUVEC, Td-EC）,重组组（12.2±0.32%,16.43±0.27%）、As203组（9.76±0.17%,14.05±0.21%）和联合组（15.78±0.18%,20.69±0.23%）,空白组（6.30±0.13%,4.73±0.14%）,单一用药组间比较p<0.05,联合组分别与单一用药组比较p<0.01,实验各组与空白组比较p<0.01; Td-EC各组与对应的HUVEC各组比较p<0.05,空白组之间比较p<0.05。4.3对细胞迁移、管腔能力的影响,迁移细胞数（HUVEC, Td-EC）,重组组（29.20±1.30,27.60±0.55）、As203组（36.00±1.00,33.20±1.30）、联合组（24.33±1.36,21.00±1.26）、空白组（45.40±1.14,50.60±1.34）；管腔形成数（HUVEC, Td-EC）分别为,重组组（4.40±1.03,3.50±0.94）、As203组（6.00±1.14,4.96±0.93）、联合组（2.90±0.92,2.30±0.75）,空白组（13.23±0.89,14.13±1.28）,其中联合组迁移细胞数、管腔形成数最少,三组间比较p<0.05；实验各组与空白组比较p<0.01; Td-EC各组与对应的HUVEC各组比较p<0.05,两细胞空白组比较p<0.05。结论：1.稳定转染重组质粒的肝癌HepG2细胞培养上清液中有表达Canstatin蛋白.2. HUVEC经诱导鉴定为Td-EC.3. Td-EC比HUVEC具有更强细胞成活能力、血管形成能力及迁移能力。4.三个干预因素对内皮细胞有促进凋亡作用和抑制细胞成活能力、血管形成、迁移能力,并以联合组作用最强,同时Td-EC对上述作用的敏感性高于HUVEC.
傅文达,王雪雯[4]（2010）在《canstatin抗肿瘤作用研究现状》文中研究表明肿瘤的生长及转移均依赖于血管新生[1]。抗血管生成治疗已成为肿瘤的治疗热点,目前以内源性血管生成抑制因子研究为主。血管能抑素（canstatin）是新近发现的一种来源于IV型胶原蛋白的内源性抗血管新生抑制因子,具有较强的抗血管新生作用而受到重视,现综述其抗肿瘤研究现状。
孟丽娜,董晓光,王晔,刘廷,张珊珊[5]（2010）在《血管能抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究》文中研究说明目的观察血管能抑素真核表达质粒（pCMV-HA）对小鼠视网膜新生血管RNV形成的抑制作用。方法将鼠龄为7d的56只C57BL/6J新生小鼠随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变（OIR）模型组、治疗组和空载体组,每组14只。后3组小鼠置于（75±2）%浓度的氧环境中饲养5d后,回到正常空气环境中建立氧诱导的RNV动物模型。治疗组小鼠在出生后第12天出氧箱时行玻璃体腔注射血管能抑素pCMV-HA,空载体组注射等量空质粒。出生后第17天行伊凡思蓝（Evansblue）灌注血管造影视网膜铺片观察血管变化。石蜡切片行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。结果视网膜铺片结果显示,治疗组较OIR模型组和空载体组视网膜血管分布均匀,新生血管和无灌注区显着减少。治疗组突破内界膜的内皮细胞核数与OIR模型组及空载体组比较,差异有统计学意义（F=39.006,P<0.001）。结论血管能抑素pCMV-HA对氧诱导的RNV有显着的抑制作用。
赵贵先[6]（2010）在《人canstatin基因转染及其对体外培养肝癌HepG2细胞凋亡及迁移的影响》文中进行了进一步梳理目的：构建含有canstatin基因的分泌型表达重组质粒并转染肝癌HepG2细胞,观察表达产物对体外培养肝癌细胞迁移能力和调亡的影响。方法：实验分为三部分。第一部分为含有canstatin重组质粒的构建,包括：1. Canstatin基因从胎盘组织中获取,RT-PCR扩增Canstatin cDNA及切胶回收并纯化,酶切pcDNA3. 1（-）-3flag载体质粒后,采用DNA定向连接技术构建含有canstatin的重组质粒pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin;2. pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α；3.重组质粒的扩增及提取质粒DNA；4.质粒DNA经酶切鉴定及筛选后阳性质粒制成甘油菌送往公司测序；第二部分为pcDNA3.1（-）-3flag/canstatin重组质粒DNA转染至肝癌HepG2细胞及mRNA和蛋白水平表达的鉴定,包括：1.脂质体法共转染肝癌HepG2细胞,G418筛选稳定转染的肝癌HepG2细胞；2.实时定量PCR检测并比较canstatin在稳转后的肝癌HepG2细胞的表达;3. Western blot检测重组质粒转染后肝癌HepG2细胞的上清液中canstatin蛋白的表达；4.收集含有canstatin的重组质粒稳定转染后的肝癌HepG2细胞的上清液；第三部分为cantatin蛋白对体外培养的肝癌HepG2细胞凋亡和迁移能力的影响的检测,包括：1.实验分组：空质粒转染的上清液组,重组质粒转染表达的上清液组,稳转后肝癌HepG2细胞组,未转染肝癌HepG2细胞组（空白对照组）；2.各组作用于培养的肝癌HepG2细胞；3.流式细胞仪检测凋亡细胞、凋亡率；4. Trance well小室和划痕实验测定转染细胞对重组基底膜的迁移能力。。结果：1.于胎盘组织获得684bp人canstatin基因,测序证明canstatin cDNA编码序列与基因库中登录的中国人canstatin序列比较,符合率百分之百。构建的分泌型真核表达载体pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin经酶切可得到5000bp和700bp两个条带,与pcDNA3. 1（-）-3flag载体质粒5400bp和canstatin684bp相符合。2.将构建好的重组质粒pcDNA3. 1（-）-3f lag/canstatin转染肝癌HepG2细胞并用400μg/mlG418浓度筛选得到可以稳定传代的转染肝癌HepG2细胞,RT-PCR证实质粒pcDNA3.1（-）-3flag/canstatin已成功转染进入肝癌HepG2细胞,实时定量PCR结果显示转染后基因拷贝数为842128, Western blot检测转染后的细胞裂解液和上清液,在SDS-PAGE凝胶上均得到一条约26KD的新蛋白,与canstatin蛋白大小相接近。3.重组质粒转染后的细胞上清液作用的肝癌HepG2细胞组和转染后肝癌HepG2细胞组的凋亡率（分别为15.50±0.77和13.33±0.92）明显高于空质粒转染的细胞上清液作用组和正常培养的未转染组的凋亡率（分别为0.48±0.05和0.36±0.09）p<0.01,并且重组质粒转染后的细胞上清液作用组的凋亡率也高于稳定转染后肝癌HepG2细胞组的凋亡率（p<0.01）；而以上各组细胞24h和48h的迁移率之间都没有统计学的差异（p>0.05）。结论：1.成功购建重组质粒pcDNA3. 1（-）-3flag/canstatin;2. pcDNA3. 1-Canstatin-3Flag重组质粒经脂质体法转染到肝癌HepG2细胞获得了canstatin基因在m RNA水平表达,并且细胞培养的上清液获得了canstatin蛋白表达。3.转染了pcDNA3.1-Canstatin-3Flag重组质粒的肝癌HepG2细胞的上清液促进了体外培养的肝癌HepG2细胞的凋亡,而对肝癌HepG2细胞的迁移没有影响。
赵贵先,王雪雯[7]（2010）在《癌抑素（canstatin）在肿瘤治疗中的研究现状》文中提出癌抑素（canstatin,Cans）是继血管生成抑素（angiostatin）、内皮抑素（endostatin）和肿瘤抑素（tumstatin）之后,新近发现的一种内源性肿瘤血管生成抑制因子,因其具有高效的抗肿瘤血管形成活性而成为肿瘤治疗中的研究热点。本文就Cans的结构、功能、作用机制及在肿瘤治疗中的研究进展作一综述。
朱宝菊[8]（2009）在《hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究》文中研究说明目前无论治疗与否,晚期卵巢癌患者的预后都不佳。在美国,每年大约有26 600例卵巢癌新患者,而每年直接死于卵巢癌的患者约14 500例。据统计,全世界卵巢癌总发病人数大约每年19.1万,而由于卵巢癌疾病的隐匿性,仅仅只有23%的卵巢癌患者能在病变早期被诊断出来。晚期卵巢癌患者虽然接受了综合治疗,但是从确诊之日起,5年存活率不超过30%,所以卵巢癌又通常被称为无声杀手（silent killer）。因此临床上迫切需要特异有效的治疗方法,以期改善晚期卵巢癌患者的预后。研究认为,血管形成（Angiogenesis）在肿瘤的生长和转移过程中起着关键的作用。如果没有肿瘤的血管系统发生,实体肿瘤超过几个毫米将不能生长。此外,血管形成的越密集,肿瘤生长的速度就越快,转移的可能性就越大。在血管生成过程中,Ⅳ型胶原（TypeⅣcollagen）扮演重要角色。Ⅳ型胶原是构成血管基底膜的主要成分之一,能促进细胞的黏附、迁徙、分化、生长。研究认为,Ⅳ型胶原是一个可以调节肿瘤血管形成的潜在治疗靶点。人血管能抑素Canstatin,是继endostatin之后新发现的一个内源性血管生成抑制因子（endogenous inhibitor of angiogenesis）,来源于血管基底膜Ⅳ型胶原α2链C末端球形非胶原区（noncollagenous domain of collagen typeⅣα2-chains,non-collagenous1,NC1）。NC1区参与α链的组装,对Ⅳ型胶原三聚体的形成起关键作用,影响着血管基底膜的形成,而血管基底膜对于新血管形成是非常重要的。关于canstatin基因的研究已阐明,canstatin能抑制血管内皮细胞的生长和迁移,诱导肿瘤细胞凋亡,通过抑制肿瘤血管形成而有效抑制肿瘤移植瘤的生长。有关研究表明,肿瘤移植瘤内系统注射canstatin基因重组子能有效的抑制体内异体胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌移植瘤的生长。然而,Canstatin基因对人卵巢上皮性癌是否有效,国内外尚未见报道。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物,在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。研究认为,人端粒酶逆转录酶（humantelomerase reverse transcriptase,hTERT）基因的活性在肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要作用,并且在癌症的基因治疗中已经成为一个新的治疗靶点。有大量的证据表明hTERT基因核心启动子作为启动子可以调控治疗多种实体肿瘤,包括结肠癌、肺癌、肝癌及前列腺癌、卵巢癌等。研究表明hTERT启动子调控的腺病毒复制主要集中在肿瘤细胞内,而对端粒酶阴性的正常细胞不起作用。为了探讨canstatin基因对人卵巢上皮性癌移植瘤的疗效,并使canstatin基因治疗具有靶向性,该课题构建hTERT基因核心启动子调控的Canstatin基因重组腺病毒（Adxsi-GFP-hTERT-Canstatin,AdhTERT-Can）,体外通过Lipofectamin介导转染卵巢上皮性癌HO8910PM细胞株,研究其对卵巢癌细胞生长的影响,同时建立裸鼠移植瘤动物模型,研究重组腺病毒AdhTERT-Can对卵巢上皮性癌移植瘤的抑制作用,以期为卵巢癌canstatin基因靶向治疗提供理论依据。本实验分为以下两部分:第一部分人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子canstatin基因重组腺病毒载体的构建方法1.从卵巢浆液性囊腺癌组织中提取总RNA和基因组DNA,采用RT-PCR方法扩增canstatin基因片段,PCR方法扩增hTERT基因片段。2.XhoI酶切Canstatin和hTERT扩增片段,使其形成粘性末端,在T4 DNA连接酶的作用下,与pMD18T载体进行连接,将canstatin基因片段和hTERT基因片段同时克隆入pMD18T载体中,获得pMD18T-hTERT-Canstatin载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,抗生素筛选,摇菌,提取,酶切、电泳鉴定及测序,将核苷酸序列与基因库进行比较。3.将hTERT-Canstatin片段从pMD18T-hTERT-Canstatin载体切下连接到pShuttle-EGFP-BGHPolyA穿梭载体上,转化感受态大肠杆菌DH5α,抗生素筛选,摇菌,提取,进行酶切、电泳鉴定。4.将hTERT-Canstatin片段从pShuttle-hTERT-canstatin穿梭载体上转移到腺病毒pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-hTERT-Canstatin（pAdhTERT-Can）重组腺病毒载体,转化感受态细菌DH5α,抗生素筛选,摇菌,提取,酶切、电泳鉴定。5.复苏人胚肾细胞株HEK293细胞,进行培养、传代;线性化处理重组腺病毒载体pAdhTERT-Can,在Lipofectamin介导下转染HEK293细胞,反复冻融,获得重组腺病毒颗粒AdhTERT-Can,借助绿色荧光蛋白（GFP）的表达观察重组腺病毒的表达。重复感染、收集、冻融步骤,扩增重组腺病毒颗粒AdhTERT-Can,用空斑形成实验测定病毒滴度,以pfu（空斑形成单位）计量病毒滴度。结果1.Canstatin和hTERT基因片段扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外线透射仪下观察,约684bp处可见清晰条带,与目的基因canstatin cDNA长度一致;332bp处可见清晰条带,与目的基因hTERT核心启动子DNA长度一致。2.将canstatin基因片段和hTERT基因片段同时克隆入pMD18T载体中,经过细菌转化和抗生素筛选,阳性克隆经过双酶切,电泳获得二条条带:pMD18T载体和目的基因canstatin-hTERT的连接片段。证实扩增片段已插入载体中。经过DNA测序鉴定目的基因序列和基因库的基因序列完全同源。3.将hTERT-Canstatin片段从pMD18T-hTERT-Canstatin载体连接到pShuttle-EGFP-BGHPolyA载体上,经过细菌转化和抗生素筛选,酶切,电泳鉴定,得到1kbp/4.5 kbp两条带,说明穿梭载体构建成功。4.将hTERT-Canstatin片段从pShuttle-hTERT-Canstatin转移到pAdxsi载体上,经过细菌转化和抗生素筛选,酶切,电泳鉴定,得到14Kbp/11.8Kbp/5.1Kbp/2.47Kbp/1.45Kbp/0.6Kbp/0.49Kbp七条特异性条带,说明已得到pAdhTERT-Can重组腺病毒载体。线性化处理pAdhTERT-Can,在Lipofectamin介导下转染HEK293细胞,用荧光显微镜观察,借助报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达,可见大部分包装细胞发出绿色荧光。提示hTERT基因启动子调控的canstatin基因腺病毒载体AdhTERT-Can已成功构建。经过HEK293细胞扩增后,最终获得1.6×1011PFU/ml的病毒,能够满足接下来的体内外实验。第二部分重组腺病毒AdhTERT-Can体外感染卵巢上皮性癌细胞株HO8910PM实验及其体内抑瘤实验方法1.重组腺病毒AdhTERTCan感染卵巢上皮性癌HO8910PM细胞,借助GFP的荧光表达,用荧光显微镜观察卵巢癌细胞转染情况。2.收集转染细胞,RT-PCR扩增,电泳检测感染HO8910PM细胞中canstatin基因的表达情况。3.用流式细胞仪检测AdhTERT-Can病毒感染对HO8910PM细胞生长周期的影响。4.建立裸鼠卵巢上皮性癌移植瘤动物模型,当肿瘤直径长至约5mm×5mm时,将荷瘤裸鼠随机分3组:AdhTERT-Can（尾静脉注射AdhTERT-Can上清夜）、Ad-Can（尾静脉注射Ad-Can上清夜）和PBS组（尾静脉注射PBS）,每组6只。共注射2次,间隔72小时。5.测量肿瘤长径和短径,计算肿瘤体积。用肿瘤的体积大小作为评价靶基因抑制肿瘤生长效果的指标。6.实验结束时处死荷瘤裸鼠,取出移植瘤,行免疫组化（Flk-1、caspase-3、CD105）和HE染色检查。caspase-3和Flk-1用做探讨cantatin基因抑制肿瘤生长机制的指标。7.CD105用做检测微血管密度的指标。8.统计学处理:计量资料均采用均数±标准差表示（（?）±s）,免疫组化数据的统计分析采用x2检验。组间计量资料比较采用ANOVA分析,应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,检验标准α=0.05。结果1.重组腺病毒AdhTERT-Can感染卵巢上皮性癌HO8910PM细胞,用绿色荧光显微镜观察,可见大部分卵巢上皮性癌细胞在荧光激发下,发出绿色荧光,提示卵巢癌细胞感染成功。2.收集感染HO8910PM细胞,RT-PCR扩增后,经2%琼脂糖凝胶电泳,约684bp处可见清晰扩增条带,证实卵巢癌细胞感染成功。3.流式细胞仪上机检测分析,AdhTERT-Can组和Ad-Can组和空白组细胞生长周期比较无明显变化,说明AdhTERT-Can病毒在体外对卵巢上皮性癌细胞生长周期无明显影响。4.裸鼠皮下注射HO8910PM细胞14d后,可观察到接种部位皮下长出小米粒大小硬结,成瘤率100%,提示人卵巢上皮性癌裸鼠异体移植瘤动物模型已成功建立。5.治疗后第8天肿瘤体积开始出现明显差异,AdhTERT-Can组肿瘤体积最小,随后差异越来越明显,P＜0.01。结果提示:通过尾静脉注射,重组腺病毒AdhTERT-Can不但能明显地抑制裸鼠卵巢上皮性癌移植瘤的生长,而且对裸鼠卵巢上皮性癌移植瘤生长的抑制作用具有靶向性。6.AdhTERT-Can治疗组caspase-3的表达明显高于Ad-Can和PBS,而Flk-1的表达明显低于Ad-Can和PBS,P＜0.05,说明重组腺病毒AdhTERT-Can抑制人卵巢上皮性癌移植瘤生长的作用机制可能是:诱导肿瘤组织表达凋亡效应因子caspase-3,增加肿瘤细胞的凋亡;降低Flk-1的表达,抑制肿瘤的血管生成。7.CD105阳性颗粒主要定位于毛细血管、小静脉和小动脉血管内皮细胞膜或细胞浆,成棕黄色颗粒状,MVD计数AdhTERT-Can、Ad-Can和PBS组分别为9.86±3.21/mm2、15.54±4.67/mm2、18.43±6.55/mm2（P＜0.05）。血管主要位于肿瘤的边缘部位。CD105表达在AdhTERT-Can治疗组明显减少,微血管密度降低,提示:重组腺病毒AdhTERT-Can能够通过抑制肿瘤的血管生成而抑制卵巢癌移植瘤的生长。8.HE染色病理切片观察到各组肿瘤细胞均可见明显液化和坏死,尤其以AdhTERT-Can治疗组最为明显,多呈囊性,心、肝、肾等重要脏器组织形态学观察未发现明显异常。9.体内实验还证实重组腺病毒AdhTERT-Can通过静脉注射对人卵巢癌移植瘤生长的抑制作用为持续性,直到注射后30天处死时,肿瘤仍然处于抑制状态。结论1.成功地构建了hTERT基因核心启动子调控canstatin基因重组腺病毒AdhTERT-Can。2.构建的重组腺病毒AdhTERT-Can能够感染卵巢上皮性癌细胞,为进一步研究canstatin基因治疗卵巢上皮性癌移植瘤提供了一个良好的载体。3.体外实验证实重组腺病毒AdhTERT-Can对卵巢上皮性癌细胞的生长周期无明显影响。4.体内实验证实重组腺病毒AdhTERT-Can不但能明显抑制卵巢上皮性癌移植瘤的生长,而且对卵巢上皮性癌移植瘤的抑制作用具有靶向性。5.重组腺病毒AdhTERT-Can能够通过抑制肿瘤的血管生成而抑制卵巢上皮性癌移植瘤的生长。6.canstatin基因抑制卵巢上皮性癌移植瘤生长的作用机制可能是:诱导肿瘤组织高表达凋亡效应因子caspase-3,增加卵巢肿瘤细胞的凋亡;降低Flk-1的表达,抑制肿瘤的血管生成。7.重组腺病毒AdhTERT-Can在治疗卵巢上皮性癌移植瘤的同时,对心、肝、肾等重要脏器组织无明显影响。本研究创新点:1首次应用分子克隆技术将canstatin基因构建于hTERT启动子下游,使canstatin的治疗作用受hTERT启动子的调控,并成功地构建了hTERT启动子调控的canstatin基因重组腺病毒载体AdhTERT-Can。2体内实验证实重组腺病毒AdhTERT-Can不但能明显抑制卵巢上皮性癌移植瘤的生长,而且对卵巢上皮性癌移植瘤的抑制作用具有靶向性。3发现了canstatin基因抑制卵巢上皮性癌移植瘤生长的作用机制可能与凋亡效应因子caspase-3和Flk-1的异常表达有关。
孟丽娜,董晓光[9]（2009）在《血管能抑素抑制新生血管生成的研究进展》文中研究表明血管能抑素是最新发现的一种内源性血管抑制因子,来源于IV型胶原。实验证明其在体外能显着抑制血管内皮细胞的增生和迁移,诱导其凋亡,在体内能抑制肿瘤新生血管生成。血管能抑素作为抗血管生成治疗的新策略,在眼科基因治疗方面有很好的应用前景,尤其是视网膜新生血管。本文就血管能抑素的发现、命名、生物学特性、作用机制及在眼科应用前景作一综述。
王宋平[10]（2008）在《人可溶性血管内皮生长因子受体-1、2基因的克隆及其抗肺癌的实验研究》文中研究说明肺癌与其它实体肿瘤一样,生长和转移都需要依赖新生血管的形成,因而抗血管生成是当前治疗肺癌的重要策略之一。肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用,其促进肿瘤血管生成的功能主要由血管内皮细胞表面的两种膜受体-血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）介导,与其受体共同组成了促血管生成的信号转导系统,因此,阻断VEGF促血管生成的信号转导通路即是最重要最直接的抗肿瘤血管生成的靶向治疗。可溶性VEGF受体-1（sVEGFR-1）和可溶性VEGF受体-2（sVEGFR-2）与相应的膜受体有同等的VEGF亲和力而无信号转导功能,因而能阻断VEGF促血管生成的信号转导通路,抑制VEGF诱导血管生成的生物学效应。本研究构建人sVEGFR-1和sVEGFR-2基因重组真核表达载体,将其转染人肺腺癌A549细胞,观察sVEGFR-1和sVEGFR-2基因的表达及其生物学效应,比较单独和联合转染sVEGFR-1和sVEGFR-2基因抑制肺癌血管生成和肿瘤生长及转移的效果,并探讨其作用机制,为肺癌抗血管生成的基因治疗提供新的途径。方法1.利用RT-PCR法从人胎盘组织中扩增sVEGFR-1和sVEGFR-2基因编码区片段,并将其定向连接到真核表达载体pCMV-Script,分别构建成重组真核表达载体pCMV-Script-sVEGFR-1（命名为psR1）和pCMV-Script-sVEGFR-2（命名为psR2）。2.使用阳离子脂质体转染法将空载体和各重组真核表达载体转染A549细胞,共分为5组:⑴空载体pCMV-Script转染A549细胞组（命名为A549-pCMV组）;⑵重组载体psR1转染A549细胞组（命名为A549-psR1组）;⑶重组载体psR2转染A549细胞组（命名为A549-psR2组）;⑷psR1和psR2共转染A549细胞组（命名为A549-psR1R2组）;⑸未转染A549细胞组（命名为亲代A549组）。3.通过细胞培养和G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,传代培养后,再用RT-PCR、蛋白印迹分析（Western Blot）、免疫细胞化学、酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定各组转基因细胞及其培养上清液中目的基因的表达和分泌。4.通过细胞形态的观察、细胞计数及细胞生长曲线、MTT比色实验和流式细胞仪检测细胞周期,观察各载体转染对转基因A549细胞及其干预的脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响。5.将各组A549细胞的培养上清液干预鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）,观察各组转基因A549细胞表达和分泌的sVEGFR-1和sVEGFR-2对鸡胚CAM血管生成的影响。6.建立裸鼠皮下移植瘤模型:将15只裸鼠随机分为5组,每组3只:⑴亲代A549组;⑵A549-pCMV组;⑶A549-psR1组;⑷A549-psR2组;⑸A549-psR1R2组。每组裸鼠背侧皮下接种相应组别的A549细胞。7.观察指标:⑴裸鼠的成瘤情况;⑵每周测量移植瘤的体积,观察移植瘤的增长速度;⑶肿瘤组织病理形态学观察;⑷免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）;⑸荷瘤裸鼠的生存时间及肿瘤转移情况。结果1.利用RT-PCR从人胎盘组织中成功扩增出sVEGFR-1和sVEGFR-2基因,其片段长度与预期大小一致。构建的重组真核表达载体psR1和psR2分别作双酶切和测序鉴定,证实其中含有sVEGFR-1和sVEGFR-2基因,测序结果经BLAST分析与预期的编码区序列一致,连接的方向正确。2.空载体和各重组载体转染的A549细胞,用G418筛选后均获得了稳定转染的细胞克隆;RT-PCR检测显示,A549-psR1组和A549-psR2组分别有sVEGFR-1 mRNA和sVEGFR-2 mRNA表达,而A549-psR1R2组表达这两种目的基因mRNA;Western Blot和免疫细胞化学检测显示,A549-psR1组和A549-psR2组分别有sVEGFR-1和sVEGFR-2蛋白表达,而A549-psR1R2组表达这两种目的蛋白;用ELISA法可从A549-psR1组和A549-psR2组细胞的培养上清液中检测到相应的目的蛋白,从A549-psR1R2组细胞的培养上清液中可检测到这两种目的蛋白;亲代A549细胞组和A549-pCMV组上述检测结果均为阴性。3.各载体稳定转染A549细胞的生长曲线、群体倍增时间、MTT结果、细胞周期与亲代A549细胞组比较没有显着性差异。但各组A549细胞干预的HUVEC培养结果与未干预组HUVEC培养结果比较,各重组载体转染A549细胞干预的HUVEC的生长速度减慢,群体倍增时间延长,MTT实验吸光度（A）值降低,细胞周期中G1期比例增高,S期比例降低。4.与未干预组CAM血管计数（12.33±1.53）比较,A549-psR1组和A549-psR2组培养上清液干预的CAM血管计数（分别为7.33±1.53和7.67±1.53）显着减少（P均<0.01）, A549-psR1R2组培养上清液干预的CAM血管计数（4.67±1.15）减少更为明显（P<0.01）,与A549-psR1和A549-psR2干预组比较,差异也有统计学意义（P<0.05）。5.建立的裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤率为100%;裸鼠皮下成瘤后,可见每只裸鼠的肿瘤都稳定增长,体积逐渐增大,但各重组载体转染A549组的肿瘤增长速度明显比亲代A549组和空载体转染组慢,其中A549-psR1R2组肿瘤增长速度最慢。实验终点A549-psR1组、A549-psR2组和A549-psR1R2组的肿瘤体积（mm3）（分别为1338.3±78.8、1443.2±90.9和1171.5±40.8）显着小于亲代A549组（1620.0±27.8,P均<0.01）和A549-pCMV组（1626.7±10.4,P均<0.01）;A549-psR1R2组与A549-psR1组或A549-psR2组比较,差异也有统计学意义（P均<0.01）;但A549-pCMV组与亲代A549组肿瘤体积的差异没有统计学意义（P>0.05）。6.免疫组化分析显示,各组裸鼠移植瘤内均可见形态不规则,无明显管腔形成的微血管,但A549-psR1组、A549-psR2组和A549-psR1R2组的MVD（分别为15.8±2.6、18.6±2.3和10.8±1.3）显着低于亲代A549组（23.6±3.0,P均<0.01）和A549-pCMV组（25.2±1.3,P均<0.01）;A549-psR1R2组与A549-psR1组或A549-psR2组的肿瘤MVD比较,差异也有统计学意义（P均<0.01）;但A549-pCMV组与亲代A549组肿瘤MVD的差异没有统计学意义（P>0.05）。7.A549-psR1组、A549-psR2组和A549-psR1R2组荷瘤裸鼠的中位生存期（分别为68、74和79天）明显比亲代A549组（41天）和A549-pCMV组长（37天）（P均<0.01）。结论1.成功克隆了人sVEGFR-1和sVEGFR-2基因,将其转移到人肺腺癌A549细胞后在mRNA和蛋白水平上均能表达,并且表达的sVEGFR-1和sVEGFR-2能分泌到细胞外。2.sVEGFR-1和sVEGFR-2基因转移对转基因A549细胞自身的增殖没有明显的影响,但其表达的sVEGFR-1和sVEGFR-2能抑制体外培养的HUVEC的增殖,能抑制鸡胚尿囊绒毛膜新生血管的形成。3.sVEGFR-1和sVEGFR-2基因转移A549细胞后能抑制转基因细胞自身形成的裸鼠皮下移植瘤的生长及其瘤内血管生成。其抑制肿瘤生长的机制可能是通过旁分泌方式抑制瘤内血管生成实现的,而不是直接作用于肿瘤细胞。4.联合转染sVEGFR-1和sVEGFR-2基因具有增强抑制血管生成和肿瘤生长的作用。
二、血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究（论文提纲范文）
（1）TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建（论文提纲范文）
| 中英文对照表 |
| 第一节 小鼠TIE2基因启动子的克隆及转录活性分析 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二节 小鼠及人内皮抑素基因的克隆 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）As2O3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（4）canstatin抗肿瘤作用研究现状（论文提纲范文）
| 1 canstatin发现、结构和命名 |
| 2 canstatin生物学特征 |
| 2.1 抑制血管新生作用 |
| 2.2 诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.3 作用机制 |
| 3 canstatin的抗肿瘤体内研究 |
| 3.1 canstatin单独应用抗肿瘤作用 |
| 3.2 联合其他疗法抗肿瘤作用 |
（6）人canstatin基因转染及其对体外培养肝癌HepG2细胞凋亡及迁移的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及其他 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验耗材 |
| 1.5 培养基 |
| 1.6 常规溶液及试剂 |
| 1.7 引物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 构建重组质粒 |
| 2.2 重组质粒转染 |
| 2.3 转染后肝癌HepG_2细胞凋亡和迁移能力的检测 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师评阅表 |
（7）癌抑素（canstatin）在肿瘤治疗中的研究现状（论文提纲范文）
| 1. Cans的作用及机制 |
| 2. Cans在肿瘤治疗中的优势 |
| 3. Cans蛋白的获取 |
| 4. 重组Cans蛋白在抗肿瘤血管生成中的应用研究 |
| 5. 重组Cans蛋白与其他肿瘤治疗方法的联合应用 |
| 6. 其他应用 |
| 7. 结语 |
（8）hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究（论文提纲范文）
| 论文 hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子canstatin基因重组腺病毒载体的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组腺病毒AdhTERT-Can体外感染卵巢上皮性癌细胞株HO8910PM实验及其体内抑瘤实验 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论及创新点 |
| 综述 血管生成抑制因子Canstatin与肿瘤的关系及相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 附录1 攻读博士学位期间获得的基金项目及发表的论文 |
| 附录2 主要载体图谱 |
| 致谢 |
（9）血管能抑素抑制新生血管生成的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Canstatin的发现、命名、结构及特点 |
| 2 Canstatin在体外实验中抑制新生血管的作用 |
| 3 Canstatin在体内实验中抑制新生血管的作用 |
| 4 Canstatin抑制新生血管生成的机制 |
| 4.1 通过抑制蛋白的合成来下调抗凋亡蛋白水平, 诱导FasL介导的凋亡 |
| 4.2 整合素依赖性VEC抑制作用 |
| 4.3 抑制血管基底膜和细胞外基质的降解和更新, 抑制血管重建 |
| 5 存在问题和在眼科应用方面的展望 |
（10）人可溶性血管内皮生长因子受体-1、2基因的克隆及其抗肺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 人可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因的克隆及其抗肺癌的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因的克隆及鉴定 |
| 分题一 可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因的扩增 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 重组可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因载体构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因的转染、表达及其生物学效应研究 |
| 分题一 可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因的转染及表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因转染对细胞增殖的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因转染抑制血管生成和肺癌生长的研究 |
| 分题一 可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因转染抑制血管生成的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二可溶性血管内皮生长因子受体-1、2 基因转染抑制肺癌生长的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 血管内皮生长因子及其受体与肺疾病的关系 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肿瘤血管生成及其抗血管生成治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 肺癌基因治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表的论文 |
| 英文论着 |
四、血管能抑素重组基因表达载体抗肺癌效应研究（论文参考文献）
- [1]TIE2基因启动子及内皮抑素基因表达载体的构建[D]. 陆俊佳. 广西医科大学, 2013(S1)
- [2]人血管能抑素抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生[J]. 陆卫忠,肖飞,黄桂君,李玉英,李瑾,陈维中,钱桂生. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2011(06)
- [3]As2O3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究[D]. 傅文达. 石河子大学, 2011(05)
- [4]canstatin抗肿瘤作用研究现状[J]. 傅文达,王雪雯. 中国现代医药杂志, 2010(08)
- [5]血管能抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究[J]. 孟丽娜,董晓光,王晔,刘廷,张珊珊. 中华眼底病杂志, 2010(03)
- [6]人canstatin基因转染及其对体外培养肝癌HepG2细胞凋亡及迁移的影响[D]. 赵贵先. 石河子大学, 2010(03)
- [7]癌抑素（canstatin）在肿瘤治疗中的研究现状[J]. 赵贵先,王雪雯. 生命的化学, 2010(01)
- [8]hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究[D]. 朱宝菊. 郑州大学, 2009(10)
- [9]血管能抑素抑制新生血管生成的研究进展[J]. 孟丽娜,董晓光. 眼科新进展, 2009(02)
- [10]人可溶性血管内皮生长因子受体-1、2基因的克隆及其抗肺癌的实验研究[D]. 王宋平. 第三军医大学, 2008(03)