一、洞庭湖日本血吸虫疫区东方田鼠生化与分子遗传学标记的初步研究（论文文献综述）
高骏[1]（2017）在《中国东方田鼠分子系统地理学及种群遗传结构研究》文中进行了进一步梳理东方田鼠（Microtus fortis）具有独特的天然抗血吸虫感染特性,是一种极具前景的实验动物资源。但对于该物种的基因组序列、近缘物种及亚种间的系统进化关系、种群内与种群间的遗传结构都未见有系统报道。本研究首先从东方田鼠母系遗传结构的角度,利用传统和长距离PCR结合的策略,首次完成了东方田鼠指名亚种（M.f.fortis）的线粒体基因组测序。在此基础上,优化了16对引物对中国六个地区（湖南、宁夏、福建、黑龙江、吉林、广西）的东方田鼠样本线粒体全基因组进行了PCR扩增和重测序。研究表明所测的六个不同地区的东方田鼠的线粒体全基因组长度在1630316312 bp之间。并首次将东方田鼠宁夏指名亚种（M.f.fortis）和东方田鼠湖南长江亚种（M.f.calamorum）的线粒体全长基因组序列,提交至Gen Bank,获得了相应的序列号（Gen Bank:JF261174/JF261175）。东方田鼠指名亚种线粒体基因组具有与其它脊椎动物线粒体基因组相同的一些特征,都含有13个蛋白质编码基因、2个r RNA基因和22个t RNA基因。在东方田鼠线粒体非编码控制区（Control Region,CR）序列上,分别发现了中央保守区1（CSB1）序列、终止序列区（EATS1、EATS2）、和一个Poly（C）n区段,通过种间比对发现这个Poly（C）n区段只在亚洲谱系田鼠群（Asian lineage）中被发现,该结构可能是亚洲谱系田鼠所特有的,可以进一步佐证田鼠亚洲谱系（Asian lineage）的存在以及其明显的单系类群（monophyletic lineage）特征。利用线粒体全基因组构建的系统进化树表明,在中国分布的东方田鼠主要分为3个主要的分支:1)广西样本、2)北方样本（包括宁夏、黑龙江、吉林）、3)湖南和福建样本。东方田鼠南方样本（广西、湖南、福建）与北方样本（宁夏、黑龙江、吉林）在线粒体基因组轻链复制区（OL区）的二级结构茎环上有一个3碱基（CCC→TTT）的突变。该突变可以作为区分南北不同来源的东方田鼠样本的重要分子遗传标记。对六个不同地区来源的东方田鼠样本线粒体全基因组序列比对后,共发现种内的简约信息位点（Parsimony informative sites）157个,自裔突变位点（Singleton variable sites）450个,统计发现南方样本的线粒体基因组多态性明显高于北方样本。本研究进一步对中国6个地区的84个东方田鼠野生样本的线粒体细胞色素b（cyt b）基因以及非编码控制区序列（Control Region,CR）进行了重测序（cyt b和CR序列的Gen Bank登录号分别为KJ081871KJ081954和KJ207290KJ207373）,进一步探讨了东方田鼠各地理种群内与种群间的系统进化关系及母系遗传结构。在拼接后的84个东方田鼠样本序列片段（cyt b+CR）,共得到49种单倍型（haplotype）,不同的地理种群间无共享单倍型。较高的种群间FST值表明,斑块化的栖息地可能是造成这种地理种群分化程度较大的主要原因。通过贝叶斯系统发育推断（Bayesian inference）和最大似然法（maximum likelihood）构建了东方田鼠的系统进化树,再次证实了东方田鼠各地理种群形成三个主要的分支:（1）北方种群;（2）南方的湖南福建种群;（3）广西种群。研究表明,东方田鼠与分布于俄罗斯、蒙古以及中国东北部的三种田鼠:米氏田鼠（M.middendorffii）、蒙古田鼠（M.mongolicus）以及莫氏田鼠（M.maximowiczii）有着最近的系统进化关系,该四种田鼠在系统进化树上形成单系类群的特征,它们应该是由共同的祖先分化而来。分析认为,中国的秦岭淮河一线（Qinling Mountains-Huaihe river line）是我国重要的南北地理分界线,该地理屏障的南北地区气候以及环境差异较大,可能是造成东方田鼠南北群体遗传分化的重要原因之一。此外,来自中国西南地区的东方田鼠广西群体可能是物种在冰期避难所内避难的一种典型例子。根据分子钟推算中国东方田鼠最初的分歧时间在6477万年前,位于中国倒数第二次冰期与末次冰期之间的间冰期。贝叶斯Skyline图表明东方田鼠的有效种群大小,在过去的3040年经历了明显的下降趋势,分析认为这与栖息地的丧失和环境恶化存在一定关系。另一方面,本研究利用20个东方田鼠微卫星位点从常染色体遗传多样性的角度,利用荧光多重PCR和微卫星（STR）分型技术,对4个野生东方田鼠种群（福建、湖南、宁夏、广西）的63个样本进行了常染色体角度的遗传结构分析。其中19个微卫星位点显示出高度多态性（PIC=0.83>0.5）,平均等位基因数、位点杂合度均显示4个地区野生东方田鼠的遗传多样性丰富。遗传距离与UPGMA聚类分析均表明,宁夏种群与广西种群间的遗传分化程度相对最大,而湖南种群与广西种群间的遗传分化程度相对最小,这一点在STRUCTURE聚类图（K=2）分析时,同样得到提示。分析认为,湖南与广西种群间由于较近的地理距离关系,在核基因组水平存在一定的基因交流。本研究通过大量比对,统计了东方田鼠线粒体细胞色素b（cyt b）基因以及非编码控制区序列（CR）上的种间和种内的单核苷酸多态性（SNP）位点。在与近缘田鼠物种的同源序列比对后,共在cyt b基因和控制区（CR）区段序列上分别找到13个和12个东方田鼠特有的SNP位点。这些特异性的种间SNP位点可以作为今后东方田鼠样本鉴定重要的分子遗传标记。同时,在各地理种群中分别发现了一定数量的种内SNP位点。研究获得的这些线粒体基因组上的SNP位点以及核基因组上的高度多态性的东方田鼠微卫星（STR）信息,都将为今后东方田鼠的亚种分类、样本来源鉴别以及各地理种群的遗传多样性分析提供重要的分子检测标记。
李荣[2]（2014）在《东方田鼠抗日本血吸虫童虫的相关基因作用机制的初步研究》文中进行了进一步梳理血吸虫病是一种严重危害人民身心健康的人兽共患寄生虫性传染病,在我国仍然是一个重要的公共卫生问题。流行病学调查和人工感染实验研究结果表明：东方田鼠Microtus fortis)是日本血吸虫的非适宜宿主,也是唯一一种对日本血吸虫具有天然抗性、感染血吸虫后不致病的哺乳动物。在前期实验的基础上,本研究通过蓝色琼脂糖凝胶亲和层析,直接从东方田鼠血清中分离、纯化获得了一个对日本血吸虫童虫具有显着杀伤作用的蛋白——白蛋白。为了进一步了解东方田鼠血清白蛋白抗日本血吸虫的作用机理,我们用FITC标记东方田鼠血清白蛋白,来追踪其在日本血吸虫童虫体内的作用部位,应用日本血吸虫肠道内的组织蛋白酶Legumain来消化东方田鼠血清白蛋白,并构建了东方田鼠血清白蛋白的真核表达载体,制备条件培养基,验证了其表达产物对日本血吸虫童虫的杀伤效果。ILKAP是本课题组从东方田鼠骨髓细胞cDNA文库中筛选出来的一种抗性基因,本研究利用东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白通过免疫共沉淀实验,联合MALDI-TOF-MS分析,鉴定出与ILKAP作用的8种相关蛋白,接着将基因ILKAP和Tegument antigen （TA）分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-）b和pCMV-Tag2b,共转染HEK293T细胞后,通过免疫共沉淀和Western blotting验证了ILKAP和Tegument antigen的相互作用,为进一步阐明其在抗日本血吸虫的作用机制及发现新的抗性相关蛋白提供线索。一、东方田鼠血清白蛋白的分离、纯化、鉴定及对日本血吸虫童虫的杀伤效果实验通过蓝色琼脂糖凝胶层析柱分离得到东方田鼠血清白蛋白溶液,透析、冷冻干燥后,通过10%SDS-PAGE电泳进行分析。将纯化的白蛋白与体外培养的日本血吸虫童虫共孵育,实验结果显示：东方田鼠白蛋白浓度为2.5mg/m1时,童虫死亡率为37.94%（P<0.05）,随着白蛋白浓度的增加,童虫死亡率也增加,与对照组相比,具有统计学意义。二、东方田鼠血清白蛋白条件培养基的制备及对日本血吸虫童虫的杀伤效果本实验将东方田鼠白蛋白基因重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）,制备东方田鼠白蛋白的条件培养基,检测其真核表达产物体外杀伤日本血吸虫童虫效果。实验结果显示：东方田鼠albumin的条件培养基杀虫率为38.7%（P<0.05）,与对照组相比具有显着的杀虫效果。三、东方田鼠血清白蛋白在日本血吸虫童虫体内的定位及Legumain对东方田鼠血清白蛋白的消化将荧光素（FITC）标记的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫共孵育,白蛋白终浓度为5mg/ml,于37℃、5%CO2环境中培养童虫。24h及48h后分别收获童虫,于OLYMPUS倒置荧光显微镜下观察荧光出现的部位。结果发现,FITC标记的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫共孵育24h后,在童虫肠道内有荧光素聚集,孵育48h后,荧光素在童虫肠道内的聚集更加明显。为了进一步了解东方田鼠抗日本血吸虫童虫的作用机制,我们分析了日本血吸虫肠道内常见的几种内肽酶：组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L和组织蛋白酶AE。通过文献资料查阅和序列分析发现：只有Legumain对东方田鼠和小白鼠白蛋白的氨基酸序列有切割位点的变化。因此我们利用Legumain分别消化东方田鼠和小白鼠血清白蛋白。结果发现：Legumain对东方田鼠和小白鼠血清白蛋白的消化存在显着差异。四、与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的筛选在早期抗日本血吸虫研究中,课题组建立了东方田鼠骨髓细胞cDNA文库,通过表达克隆法对该文库进行抗性基因的筛选,从gE77次级亚基因池中筛选到抗性候选基因gE77.43,其编码的产物为整合素连接激酶相关丝氨酸／苏氨酸磷酸酶（ILKAP）。前期研究首次发现ILKAP具有显着的杀伤日本血吸虫童虫的效果。因此,本研究利用东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白,通过免疫共沉淀实验,联合质谱分析鉴定与8种与ILKAP相互作用的血吸虫童虫蛋白质。五、与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的验证东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白通过免疫共沉淀实验和质谱分析共筛选了8个可能与ILKAP相互作用的血吸虫童虫蛋白质。为进一步验证筛选出来的蛋白质是否与ILKAP存在相互作用,本实验采用免疫共沉淀结合Western blotting发现童虫蛋白TA确实与ILKAP存在直接相互作用。本研究利用脂质体分别将Myc-TA-pcDNA3.1/（-）b和Flag-ILKAP-pCMV-2b转染至HEK293T细胞,建立ILKAP-Flag和TA-Myc高表达的HEK293T细胞；通过免疫共沉淀实验证实了日本血吸虫蛋白TA与东方田鼠骨髓ILKAP之间的相互作用,为进一步阐明东方田鼠抗日本血吸虫的作用机制及发现新的靶作用位点提供线索。
杨健美[3]（2012）在《不同终末宿主对日本血吸虫感染适宜性的差异分析》文中指出日本血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病，曾流行于我国南方12个省（市）、自治区，对社会经济和人类健康造成严重影响。半个多世纪以来，我国血吸虫病防治取得了举世瞩目的成就，至2010年底，全国血吸虫病病例数由建国初期的1100余万例降至32.6万例。但当前我国血吸虫病防治形势依然比较严峻，局部地区钉螺面积有所上升，出现了疫情反复。目前我国血吸虫病防治的主要难点在于其中间宿主钉螺难以彻底消灭；保虫宿主种类多；人、畜重复感染严重，单靠以化学药物治疗为主的防治策略不能有效控制血吸虫病流行。加强日本血吸虫病疫苗和新治疗药物研究，是当前我国血吸虫病防治的重大需求。加强血吸虫与不同适宜性宿主相互作用关系等研究，可为筛选血吸虫疫苗候选分子和新药物靶标提供重要基础。多达46种哺乳动物可自然感染日本血吸虫，但不同哺乳动物对日本血吸虫的适宜性有所不同。根据血吸虫感染宿主后在其体内生长发育等情况，可以将宿主分为适宜宿主与非适宜宿主。东方田鼠是迄今为止在日本血吸虫病疫区发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳动物，具有天然抗日本血吸虫病特性。黄牛、水牛和山羊是血吸虫病疫区三种最重要天然保虫宿主，大鼠、小鼠及新西兰大白兔是最常使用的三种血吸虫病实验动物，其中黄牛、山羊、小鼠、新西兰大白兔是日本血吸虫的适宜宿主；水牛、大鼠属于非适宜宿主。本课题组前期对大鼠、小鼠和东方田鼠三种不同适宜性实验动物宿主进行了感染适宜性差异机制的相关研究，获得了一些有重要科学价值的实验数据或结果。本文着重对黄牛、水牛、山羊三种不同适宜性天然宿主的感染差异及其机制进行分析，获得以下研究结果：1.日本血吸虫在不同适宜性宿主中的发育和致病观察以日本血吸虫尾蚴人工感染黄牛、水牛、山羊、Wistar大鼠、BALB/c小鼠及新西兰大白兔，7w后收集虫体。结果表明六种动物的虫体回收率有显着差别，由高到低依次为：山羊、BALB/c小鼠、新西兰大白兔、黄牛、水牛、Wistar大鼠。虫体的长度和宽度亦存在显着差别，适宜宿主体内虫体明显长于非适宜宿主体内虫体，雌虫长度长于雄虫（Wistar大鼠例外）。适宜宿主（黄牛、山羊、BALB/c小鼠和新西兰大白兔）感染后肝脏布满虫卵结节，其中山羊、新西兰大白兔和BALB/c小鼠的肝脏完全充满白色虫卵结节，病变尤其严重；而非适宜宿主的肝脏只有少量虫卵结节（水牛），或者几乎看不到虫卵结节（Wistar大鼠）。本文首次对日本血吸虫感染黄牛、水牛和山羊三种天然宿主后宿主的肝脏组织病理变化差异及三种宿主来源虫体的超微结构作了比较，观察到适宜宿主黄牛和山羊的肝脏组织产生了更为强烈的免疫应答，肝细胞肿大，炎性细胞明显增多且聚集，虫卵周围有大量嗜酸性细胞、炎性淋巴细胞聚集浸润，或呈浸润性坏死，形成典型条纹状嗜伊红沉淀物，呈现特征性“何博礼现象”；而水牛组的肝细胞以中央静脉为中心,呈放射状排列,无明显肝细胞变性、无大量坏死及炎症细胞的聚集浸润,小叶结构完整，白细胞少于红细胞，呈散在分布，且以中性粒细胞和单核细胞居多，淋巴细胞很少。虫体超微结构观察结果表明不同宿主来源虫体在超微结构水平亦存在较大差异。扫描电镜观察显示水牛组雄虫口吸盘皱缩，松弛，腹吸盘外边缘体棘宽度减小，体棘较不明显，雄虫抱雌沟后段褶嵴扁平，花型乳突较少，且呈空泡状；雌虫口吸盘萎缩，退化性变化，口吸盘背部体棘，感觉乳突退化，体壁无褶嵴，仅有少量乳突。而山羊组和黄牛组的雄虫体表主要部位在扫描电镜观察下较正常，腹吸盘感觉乳突丰富，雄虫外壁示褶嵴和感觉乳突，抱雌沟体壁褶嵴明显，花型乳突丰富；雌虫口吸盘感觉乳突和体棘丰富，腹吸盘及生殖孔明显，体壁褶嵴明显和乳突较多。透射电镜观察显示水牛组来源的雄虫体壁有较多空泡结构，内部脂滴明显增多，胞质内细胞器溶解；水牛组来源的雌虫体壁与黄牛雌虫体壁相差不大，但内部微绒毛结构较短，较少。2．天然宿主黄牛和水牛感染日本血吸虫后的免疫应答初步研究对黄牛和水牛感染日本血吸虫前后免疫学应答差异进行了比较分析，感染前和感染后，黄牛的CD4+T细胞比例一直高于水牛；而水牛的CD8+T细胞比例一直显着高于黄牛。在感染血吸虫尾蚴后，黄牛的CD4+T细胞比例下降，水牛的CD8+T细胞比例升高，黄牛和水牛的CD4/CD8比率都下降。黄牛的IFN-γ比例在感染前至感染后4w较高，至感染后7w时显着下降至较低水平；黄牛IL-4比例在感染前至感染后2w很低，感染4w后稍有升高，至感染7w时继续升高。水牛的IFN-γ比例在感染前较低，感染2w后有升高，之后至感染7w时都呈下降趋势；水牛的IL-4比例在感染前较高，感染之后一直下降，至7w时降至一个很低水平。应用ELISA检测感染前和感染后2w，4w，7w的血清特异IgG抗体，结果显示黄牛组在感染之后特异IgG抗体水平逐渐增加，并显着高于水牛，而水牛组特异性抗体应答启动较慢，至感染后7w，特异性IgG抗体仍处于较低水平。研究结果表明黄牛在感染早期以Th1类主导的免疫应答为主，感染6-7w后转向以Th2类主导的免疫应答为主，而水牛在感染之后则没有Th1向Th2漂移的明显变化。同时提示宿主CD4+T细胞主导的免疫环境的差异可能是黄牛比水牛更有利于虫体发育的重要原因之一。本研究也为今后牛用血吸虫疫苗免疫设计提供了科学依据。3.不同天然宿主来源的日本血吸虫基因表达谱分析利用寡核苷酸基因芯片技术分析黄牛、水牛和山羊三种天然保虫宿主来源的日本血吸虫基因表达差异。芯片总体分析结果表明，水牛来源虫体与黄牛来源虫体，有66个差异表达基因（p<0.05, FC>2），水牛来源虫体与山羊来源虫体有491个差异表达基因（p<0.05, FC>2），其中共同的差异表达基因有46个。在非适宜宿主水牛组来源虫体上调表达的基因主要有：蛋白磷酸酶/蛋白激酶类（PP2A，CDK6），神经调节相关基因（protocadherin, Rab3interactingmolecule–related, lim-homeobox family transcription factor），发育相关基因（iroquois homeoboxfamily transcription factor，lim-homeobox family transcription factor），核苷酸代谢相关基因（NDK6,EIF3, histone h4-like, Pumilio），超长链脂肪酸延伸酶（elongase of very long chainfatty acids），凋亡诱导基因（TSP-1），Wnt信号通路基因（beta-catenin-like protein，wnt-related）等；而在水牛组来源虫体下调表达的基因主要有：细胞结构组成相关基因（spectrin, ciliaryrootlet, cell wall protein，gamma-tubulin complex, macroglobulin, eggshell protein），凋亡有关的蛋白激酶类（tyrosine-protein kinase, serine threonine protein kinaseAkt, MAPK/ERK kinase4,MAPK/ERK kinase1），繁殖和胚胎发育相关的Dlx同源蛋白（distal-less/Dlx homeobox），神经调节有关基因（taurine transporter, glutamate receptor, glutamic acid-rich protein），表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor），多功能的亮氨酸富集重复区极性蛋白（leucine-rich repeat protein scribble complex protein）和锌指蛋白等。值得我们感兴趣的是，第一，一些与凋亡相关的蛋白激酶在适宜宿主山羊来源虫体中上调表达，而凋亡诱导基因TSP1在非适宜宿主水牛来源虫体中上调表达，提示凋亡途径可能是虫体在不同宿主环境中发育差异的重要原因之一。第二，一些与神经调节相关的基因在不同适宜性宿主来源虫体呈现差异表达，提示神经调节可能是血吸虫适应不同适宜性宿主环境的一个重要因素。第三，一些发育相关基因和细胞结构组成相关基因在不同适宜性宿主来源虫体呈现差异表达，是因为日本血吸虫感染三种不同适宜性天然动物宿主后导致了不同的发育结果。对差异表达基因信号通路途径分析显示，这些差异表达基因主要参与核苷酸代谢、脂肪代谢、能量代谢、遗传信息加工、免疫系统和Wnt信号通路等。本文结果提示这些差异表达基因可能对虫体的生长和发育甚为重要，值得进一步的关注。本文首次对黄牛、水牛和山羊三种不同天然宿主来源的血吸虫差异表达基因进行了比较分析，为从转录组水平分析、鉴定可能影响日本血吸虫生长发育的重要虫源性分子及筛选家畜用血吸虫病疫苗候选分子提供了基础。4.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血基因表达谱分析本文利用牛的全基因组芯片对黄牛、水牛血吸虫感染前后的外周血整体基因表达谱进行比较分析。结果表明，感染前两种宿主的基因表达谱存在较大差异，有差异表达基因5740个，其中4185个在感染7w后仍存在，占72.9%。在日本血吸虫感染7w后，两宿主产生了更多的差异表达基因（共6353个），其中有2168个是新呈现的差异表达基因。感染前后，黄牛和水牛共有的差异表达基因较少，只有83个。适宜宿主黄牛感染前后总差异表达基因497个，特有差异表达基因390个（黄牛出现，而水牛没有出现），占总差异表达基因的78.5%。在日本血吸虫感染后，非适宜宿主水牛呈现了更多的基因表达差异，水牛感染前后总差异表达基因有2197个，特有差异表达基因2114个（水牛出现，而黄牛没有出现），占总差异表达基因96.2%。对两种宿主在感染7w后新呈现的差异表达基因作进一步分析表明，这些差异表达基因主要与免疫系统及免疫调节通路（尤其是先天免疫系统及调节通路，包括补体级联及凝血系统，自然杀伤细胞介导的细胞毒性，Toll样受体信号途径等），造血细胞，p53通路，嘌呤代谢等有关，且这些大都为水牛显着下调表达基因。本研究提示一些水牛和黄牛先天存在或感染血吸虫后新呈现的差异表达基因可能影响了日本血吸虫的生长发育。5.不同宿主来源虫体的微卫星分析及特征性差异表达基因的筛选验证用同一地理株（中国大陆安徽株）日本血吸虫尾蚴感染黄牛、水牛、山羊、Wistar大鼠、BALB/c小鼠、新西兰大白兔六种宿主，从已有日本血吸虫微卫星研究相关文献中寻找设计了7对微卫星检测引物，利用微卫星技术对这六种不同宿主来源的日本血吸虫进行遗传多态性分析。结果该法未能在不同宿主来源虫体中寻找到明显的遗传变异标记，唯有其中一对引物的谱系聚类分析能够初步将实验动物宿主与天然宿主来源虫体分开。对黄牛、水牛和山羊三种天然宿主来源虫体的寡核苷酸基因芯片数据进行分析和实时定量法验证，获得2个黄牛，3个水牛，5个山羊来源虫体的特征性差异表达基因，它们可能可以作为三种保虫宿主来源虫体的特征性分子标记。本文首次对黄牛、水牛和山羊三种不同宿主来源虫体的基因表达差异及黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血基因表达差异进行了比较分析，获得一批可能对血吸虫生长发育至关重要的虫源性和宿主源性分子，为揭示黄牛和水牛对血吸虫感染差异的分子基础，探讨不同适宜性宿主，特别是我国日本血吸虫病最重要天然宿主牛、羊与日本血吸虫相互作用关系积累了有价值的信息和知识，为筛选家畜用日本血吸虫疫苗候选分子或新药物靶标提供了新思路。
姜宪环[4]（2012）在《东方田鼠线粒体基因组序列及Y染色体部分序列的测定及分析》文中指出东方田鼠（Microtus fortis）属啮齿目、仓鼠科、田鼠亚科、田鼠属,主要分布在我国,以及和我国接壤的俄罗斯、朝鲜、蒙古等某些地区。20世纪70年代以来,东方田鼠在洞庭湖区暴发成灾,不仅对当地的农林业造成巨大的损失,在迁移时还经常引发钩端螺旋体、流行性出血热等病疫。同时,东方田鼠还是重要的实验动物资源,我国学者现已利用东方田鼠构建出抗血吸虫病、糖尿病和卵巢癌等多种模型。对东方田鼠的生态防控以及作为实验动物的资源利用,都需要对其种群遗传结构进行先行研究。线粒体DNA和Y染色体序列是研究物种母系和父系遗传进化史的有效工具。田鼠属包含60多个物种,进化速度非常快,是研究系统进化的好材料。近年来,研究者们根据mtDNA序列研究田鼠系统进化关系,并已测出田鼠属Microtus kikuchii和Microtus levis的mtDNA基因组全序列。父系遗传结构仅在人类群体遗传学研究中被广泛应用,而在其他哺乳动物中研究很少。本课题采用长片段PCR（LA-PCR）和PCR引物步移测序等方法,首次测得了东方田鼠长江亚种（Microtus fortis calamorum）线粒体基因组全序列和Y染色体序列,主要结果如下：1.东方田鼠长江亚种线粒体基因组为双链环状分子,序列总长为16310bp, GenBank登录号为JF261175；包含了与其他脊椎动物一致的37个基因（13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因）和1个控制区（CR）。其基因组组成有很强的AT偏向性,全线粒体序列H-链的碱基百分含量为：A%（32.6）>C%（27.7）>T%（26.2）> G%（13.4）, A+T%（58.8）>G+C%（41.1）。2.东方田鼠长江亚种mtDNA的13个蛋白质编码基因最常用的起始密码子是ATG （COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND4L、ND4、ND6、Cytb基因）,其次是ATT（ND3和ND5）。ND1和ND2基因比较特殊,起始密码子分别是GTG和ATA。COX1, COX2, ATPase8, ATPase6, ND3, ND4L, ND5和Cytb基因的终止密码子是TAA; ND2和ND6基因的终止密码子是TAG；另外,COX3和ND4以不完整的T作为终止密码子。3.东方田鼠长江亚种mtDNA的22个tRNA基因中,有21个可以折叠成标准的三叶草二级结构；tRNAser（AGY）仅有59bp,二级结构缺少DHU环,这种tRNA结构在其他啮齿类动物中也很常见。4.东方田鼠长江亚种mtDNA控制区的结构包括三个部分：两个终止序列区（ETAS-1和ETAS-2）、中央保守区（Central Domain）和保守序列区（CSB-1）。但与已报道的两个田鼠种一样均没有发现CSB-2和CSB-3。5.东方田鼠长江亚种mtDNA的L-链复制起始区（OL）长度为35bp,可以形成茎环结构,与Microtus kikuchii和Microtus levis比较发现,其长茎以及相邻的序列十分保守。这3种田鼠的长茎相邻的保守序列为5’-TAAGG-3’,而其他哺乳动物为5’-GCCGG-3’。6.16种啮齿类动物线粒体DNA H-链的12个蛋白编码基因序列ML法和Bayesian法系统进化树表明,东方田鼠属于田鼠属的亚洲谱系。田鼠属5个种（18条序列）线粒体DNA Cytb基因序列的ML法系统进化树表明,东方田鼠与Microtus. middendorfii组成姐妹群。7.首次测得了东方田鼠长江亚种和指名亚种Y染色体上的7300bp序列,比对这两个亚种的序列后发现4个SNPs位点。本论文测出了东方田鼠线粒体基因组全序列和Y染色体上部分序列,这将为我国东方田鼠的母系和父系遗传结构研究打下坚实基础；此外,提出了一种新的获得Y染色体序列的策略。
成钢[5]（2011）在《东方田鼠KPNA2基因克隆及抗日本血吸虫实验研究》文中进行了进一步梳理东方田鼠是迄今发现对日本血吸虫抗性最强的啮齿类哺乳动物。从东方田鼠体内分离其抗日本血吸虫的抗性物质,有助于人类从分子水平上揭示东方田鼠天然抗日本血吸虫的机理也有助于血吸虫病防治新型手段的研发。在前期研究中,我们从东方田鼠骨髓cDNA文库中分离获得了一个具有显着体外杀伤日本血吸虫童虫的次级亚基因池gE76。因此,我们拟从次级亚基因池gE76中继续分离单个活性的基因,并探讨其生物学功能。一、东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因gE76.44的筛选实验利用表达克隆法对有较高体外杀伤日本血吸虫童虫活性的东方田鼠骨髓次级亚基因池gE76进行了筛选。将其转化大肠杆菌DH5a并铺板,随机挑取246个单克隆,分别进行质粒DNA抽提,EcoRⅠ酶切,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,共获取153个有插入片段质粒,选择插入片段≥800 bp的不同重组质粒37个,转化大肠杆菌DH5α并提取质粒DNA,转染HEK293 T细胞,制备条件培养基后,进行体外杀伤日本血吸虫童虫实验,在96 h内连续观察童虫死亡情况,统计死亡率,共获得四个杀虫效果较为显着的克隆：44号、69号、85号及109号,其童虫死亡率分别为16.7%、16.5%、10.4%、11.3%,与对照组比较具有统计学意义。经测序后其EST序列长度分别为2008bp、1626bp、1420bp、828bp。序列同源性比较发现：44号为核转运受体蛋白质karyopherin （importin） alpha 2,其序列中包含全长ORF,根据测序及多次重复杀虫实验结果,我们把44号基因作为从东方田鼠骨髓基因表达文库中筛选到的新的候选抗日本血吸虫相关基因,暂时命名为Mf-gE76.44进行下游实验。二、gE76.44基因生物信息学分析及其功能分析运用生物信息学方法对东方田鼠抗性相关基因gE76.44全长核苷酸序列进行结构和功能分析,BLASTN同源性比对发现：gE76.44与小鼠karyopherin alpha 2 （KPNA2） （NM-010655）的序列相似性为89.8%；多序列比对分析发现：小鼠、牛、人、大鼠和东方田鼠KPNA2的核苷酸及氨基酸序列存在差异；3D-JIGSAW （version 2.0）软件分析结果也证明东方田鼠和小鼠KPNA2蛋白分子立体结构上也存在明显差异。实验将小鼠KPNA2 （Ms-KPNA2）基因重组到真核表达载体pcDNA1.1,分别制备东方田鼠（Mf-KPNA2）及小鼠（Ms-KPNA2） KPNA2条件培养基,检测两者真核表达产物体外杀伤日本血吸虫童虫效果。扣除空白对照组童虫死亡率,Mf-KPNA2和Ms-KPNA2的条件培养基杀虫率分别为15.8%,2.8%,两者相比差异显着（P=0.003）。实验还从mRNA水平比较分析了KPNA2在正常东方田鼠和小鼠体内不同组织中的表达情况以及感染日本血吸虫0d,7d,12d后KPNA2基因在肝脏和肺脏组织中的表达。结果表明：不同组织间KPNA2的表达存在显着差异,东方田鼠在感染日本血吸虫后12d,肝脏KPNA2基因表达较小鼠显着上调。三、Mf-KPNA2基因治疗效果及表达情况分析为进一步确认Mf-KPNA2的抗日本血吸虫活性,我们建立了感染血吸虫小鼠模型,应用逆转录病毒载体pLXSN,建立pLXSN-KPNA2重组逆转录病毒载体系统,通过小鼠尾静脉注射,将重组病毒导入小鼠体内,检测重组病毒治疗后感染小鼠的减虫率、肝脏减卵率、血吸虫虫体改变及小鼠肝脏肉芽肿减少情况。pLXSN-KPNA2重组病毒经PA317细胞包装、浓缩、病毒滴度测定后,同空载体pLXSN病毒组,DMEM对照组一道,分三次尾静脉注射日本血吸虫感染小鼠。实验结果显示：pLXSN-KPNA2重组病毒治疗组较DMEM处理组,空载体pLXSN病毒对照组小鼠减虫率分别为：39.42%（P=0.006）和38.97%（P=0.007）；肝脏减卵率分别为76.50%（P=0.000）和75.04%（P=0.000）差异显着,有统计学意义。不同处理组感染小鼠体内KPNA2基因在不同组织间的表达也存在明显差异,小鼠感染血吸虫后7d, pLXSN-KPNA2病毒处理组小鼠体内KPNA2基因在肝脏,肾脏和肌肉组织中高表达。四、东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系的建立Mf-KPNA2基因具有显着体外、体内杀伤日本血吸虫的作用,为了深入研究其抗虫机制,我们对东方田鼠胚胎成纤维细胞进行了体外分离和培养,并采用脂质体介导的基因转染法,将质粒pSV3 neo（含有SV40 T抗原基因和neo抗性基因）转染第三代东方田鼠胚胎成纤维细胞,首次建立了东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为进一步从细胞水平深入研究其抗虫机理及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料。综上所述,本研究应用表达克隆法从东方田鼠骨髓基因表达文库筛选到一个日本血吸虫抗性相关基因Mf-KPNA2。东方田鼠与小鼠KPNA2在氨基酸结构域序列和数量上存在显着差异；东方田鼠体内不同组织间KPNA2表达丰度存在差异,而且与小鼠体内相同组织中的表达情况也完全不同。体外、体内实验结果均显示：该基因有着显着的抗日本血吸虫活性。同时,我们还建立了东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,以上结果为进一步研究其抗日本血吸虫机制奠定了良好的基础。
彭金彪[6]（2010）在《不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究》文中提出血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。已报道在我国流行的日本血吸虫中国大陆株可感染40余种哺乳动物,日本血吸虫对不同宿主有着不同的感受性,如在小鼠等易感宿主体内血吸虫的发育率达60-70%,在大鼠等非易感宿主体内的发育率为10-20%,而血吸虫感染东方田鼠后,大部分虫体在感染后2周死亡,不能发育成熟。东方田鼠是至今发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳动物,查明其抗血吸虫病机理具有重要的理论和实际意义。此前该领域相关研究多限于形态观察、感染、致病和免疫现象等,研究亟待深入发展。为此,本研究以实验室感染的来源于易感宿主BALB/c小鼠,非易感宿主Wistar大鼠及不致病宿主东方田鼠的日本血吸虫10d童虫为研究对象,应用日本血吸虫寡核苷酸芯片技术比较、分析三种不同宿主来源的日本血吸虫基因表达方面的差异。并对东方田鼠来源虫体呈低表达的凋亡抑制基因Sj IAP和呈高表达的凋亡相关基因caspase3和caspase 7;在小鼠来源虫体呈高表达的生长发育、信号传导相关基因Sj MAP 2、Sj mago nashi、Sj Cyclophilin A、Cyclophilin B和Cyclophilin C等进行克隆、表达,及生物学功能初步分析,旨在揭示在不同宿主环境中,日本血吸虫生长发育差异的分子基础。研究结果对阐明血吸虫生长发育机制、与宿主相互作用机理,发现血吸虫生长发育相关的重要分子,也可为研制血吸虫病疫苗、新治疗药物和对血吸虫病防治提供新思路和新途径。1、不同宿主来源日本血吸虫10d童虫形态观察及体细胞凋亡分析实验室中以日本血吸虫尾蚴感染小鼠、大鼠和东方田鼠,10d后收集虫体。光镜下观察到不同来源日本血吸虫形态大小有很大差异,东方田鼠来源童虫长402.2±102.2μm,宽159.1±47.3μm,大鼠来源童虫长828.3±127.4μm,宽103.4±22.8μm,小鼠来源童虫长878.5±137.4μm,宽88.3±20.0μm。扫描电镜下观察,东方田鼠来源童虫虫体萎缩,口吸盘形成空泡,表面结构消失,腹吸盘表面结构改变,体表正常棘消失,萎缩,形成空泡;小鼠和大鼠来源虫体体表棘等结构无异常变化。透射电镜观察发现,东方田鼠来源童虫虫体细胞结构受到破坏,细胞崩解,细胞核仁消失,染色质凝集,有细胞凋亡的表现。小鼠和大鼠来源虫体细胞形态正常,细胞核和线粒体无明显变化。利用Annexin V-FITC/propidium iodide （PI）分析不同宿主来源虫体细胞凋亡状况表明,小鼠来源虫体的凋亡细胞比例为0.40%;大鼠来源虫体的凋亡细胞比例为5.22%;东方田鼠来源虫体的凋亡细胞比例为62.91%,表明东方田鼠来源虫体的细胞发生了明显凋亡。本研究首次利用扫描电镜和透射电镜技术,进行东方田鼠、大鼠和小鼠来源日本血吸虫童虫显微和超微结构的观察和比较,利用流式细胞仪检测发现日本血吸虫在不同宿主体内的生长发育状况与体细胞凋亡相关。2、不同宿主来源日本血吸虫童虫基因表达的芯片分析应用寡核苷酸芯片技术,比较分析小鼠、大鼠和东方田鼠来源的日本血吸虫10d童虫的基因表达差异。结果表明,与小鼠来源童虫相比,东方田鼠来源童虫有3293个基因呈下调表达（fold<0.5）,71个基因呈上调表达（fold>2）;大鼠来源童虫有3335个基因呈下调表达（fold<0.5）,133个基因呈上调表达（fold>2）。其中,东方田鼠来源童虫显着性下调表达基因81个（fold<0.2）,显着性上调表达基因18个（fold>5）;大鼠来源童虫显着性下调表达基因210个（fold<0.2）,显着性上调表达基因54个（fold>5）。东方田鼠和大鼠来源童虫具有相似表达趋势的显着性下调表达基因有27个（fold<0.2）,显着性上调表达基因有7个（fold>5）。对显着性差异表达基因进行GO分类和KEGG通路等生物信息分析,结果显示,东方田鼠来源童虫显着性上调表达基因主要与细胞（cell）、细胞凋亡（apoptosis）、细胞外组成部分（extracellular region part）、细胞组成（cell part）、酶调节活性（enzyme regulator activity）和转录调节活性（translation regulator activity）等相关。东方田鼠来源童虫显着性下调表达基因主要与代谢过程（metabolic process）、催化活性（catalytic activity）、发育过程（developmental process）、转运活性（transporter activity）、细胞进程（cellular process）、定位（localization）和结合（binding）等相关。东方田鼠和大鼠来源童虫均显着下调表达基因与代谢过程（metabolic process）、定位（localization）、结构形成自动修饰（anatomical structure formation）和催化活性（catalytic activity）等相关。对东方田鼠和大鼠来源童虫均显着下调表达的基因进行KEGG pathway通路分析,发现这些蛋白主要为甘氨酸/苏氨酸/丝氨酸代谢分子（Glycine,serine and threonine metabolism）、DNA复制关键分子（DNA replication）、MAPK信号通路分子（MAPK signaling pathway）、蛋白转运（Protein export）、氨酰基tRNA生物合成（Aminoacyl-tRNA biosythesis）等分子。本研究发现一批基因在三种宿主来源10d童虫中呈现差异表达,它们可能是不同宿主来源童虫发育差异的关键分子,影响血吸虫在不同宿主中的发育。如东方田鼠来源童虫显着上调表达,小鼠来源虫体显着下调的基因有与细胞增殖密切相关的颗粒蛋白（Granulin）基因,细胞凋亡通路中发挥凋亡效应的关键分子如Cell death protein 3,Caspase 7,caspase 3;在小鼠来源童虫显着上调表达,东方田鼠来源童虫显着下调表达的基因中与生长发育相关的甲硫氨酰氨肽酶2 （MAP 2）和Sj magonashi基因,与胰岛素代谢相关的胰岛素分子（Insulin-2）和胰岛素受体蛋白激酶（insulin receptor protein kinase）基因,与脂肪酸代谢相关的脂肪酸去饱和酶（Fatty acid desaturase）、长链脂肪酸延伸相关蛋白（Elongation of very long chain fatty acids protein）、脂肪酸脱氢酶（Fatty-acid amide hydrolase）、脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein）基因,与细胞凋亡通路中发挥抑制凋亡效应的关键分子相关Sj IAP（Baculoviral IAP repeat-containing protein）、cytokine-induced apoptosis inhibitor,与信号传导相关的Cyclophilin家族基因、TGF通路分子如Eukaryotic translation initiation factor 3,Transforming growth factor beta-1、Wnt通路分子Wnt inhibitory factor 1等。这些重要功能分子的发现,将为阐明血吸虫在不同宿主生存环境中的生长发育机制,探讨血吸虫与宿主相互作用关系、发现新的血吸虫候选疫苗分子和新药物靶标提供重要基础。本研究分析获得了一批小鼠、大鼠和东方田鼠来源的10d童虫的差异表达基因信息,初步揭示了在不同宿主体内日本血吸虫生长发育的分子基础,发现了一批在不同宿主环境中可能影响血吸虫生长发育的关键功能分子,为这些重要差异表达基因的确定及进行生物学功能研究提供了良好的基础。3、日本血吸虫细胞凋亡因子和凋亡抑制因子（Sj IAP）的研究基因组水平的研究表明血吸虫与其他多细胞生物一样具有凋亡这一生物学现象。上文透射电镜研究表明,东方田鼠来源10d童虫细胞有细胞凋亡的现象,同时芯片分析结果表明,日本血吸虫凋亡相关基因caspase3和7在东方田鼠来源虫体中呈高表达,而在小鼠来源虫体中呈较低表达;日本血吸虫凋亡抑制因子基因在小鼠来源虫体中高表达,东方田鼠来源虫体中低表达,表明日本血吸虫凋亡相关基因和凋亡抑制因子可能在血吸虫生长发育和寄生虫与宿主相互作用关系中发挥重要的生物学功能,在东方田鼠抗血吸虫机制中发挥一定的作用。本研究进行了不同宿主来源日本血吸虫童虫caspase3/7的活性和基因表达差异研究;利用RT-PCR技术获得了Sj IAP编码基因的全长cDNA,PCR扩增其mRNA对应基因组DNA序列;荧光实时定量PCR和western blot分析表明,该基因为成虫期雄虫期高表达基因;免疫组化研究分析表明,虫体IAP蛋白广泛分布于成虫体被膜;细胞水平实验证实该基因真核重组表达质粒在细胞水平可以有效抑制诱导剂引起的细胞凋亡,同时研究发现Sj IAP重组蛋白也可以在血吸虫的虫体水平抑制凋亡;Real Time RT-PCR和western blot研究了日本血吸虫凋亡抑制因子基因（IAP）在不同宿主的差异表达情况。研究结果表明细胞凋亡相关基因很可能是不同宿主环境中影响血吸虫生长发育的重要功能分子,在血吸虫生长发育调控和东方田鼠抗血吸虫病中可能发挥重要的生物学功能。4、日本血吸虫生长发育重要功能分子甲硫氨酰氨肽酶2基因（MAP 2）和mago nashi基因的研究MAP 2是一种双功能酶,其催化结构域位于C端,负责切除蛋白质合成过程中新生肽链N端的起始蛋氨酸,对蛋白质的成熟以及在细胞中的转运和定位、功能调节极其重要,其N端结构域含有酸性氨基酸和碱性氨基酸富集的区域,可以抑制真核起始因子eIF2-2α的磷酸化,促进蛋白质合成的起始。在哺乳动物细胞内,MAP 2与细胞增值与分化密切相关,MAP 2在秀丽线虫生殖和发育中发挥重要的生物学功能。mago nashi基因在真核生物中广泛存在,且极为保守。在生物体翻译转录中参与mRNA定位和剪切,在生物体生殖与发育中,mago nashi基因在胚胎早期发育和生殖细胞性别决定中发挥重要的生物学功能。芯片分析结果表明,日本血吸虫MAP 2和mago nashi基因在东方田鼠来源虫体中低表达,大鼠和小鼠来源虫体中高表达。本研究利用RT-PCR技术分别获得了Sj MAP 2（日本血吸虫甲硫氨酰氨肽酶2）和Sj mago nashi编码基因的全长cDNA（基因登录号为:GQ403663和GQ403668）。荧光实时定量PCR和western blot分析Sj MAP 2和Sj mago nashi基因在不同期别阶段虫体表达差异,发现这两个基因均为童虫期表达基因,且在雄虫的表达量均高于其在雌虫。Real Time RT-PCR和western blot分析Sj MAP 2和Sj mago nashi在不同宿主来源日本血吸虫童虫的表达情况,发现二者均在小鼠来源童虫中表达最高,大鼠次之,东方田鼠最低。应用吡喹酮处理雌虫和雄虫后,Sj M AP 2表达均有显着降低,其中雄虫和雌虫中分别下降92.17%和49.01%。构建了这2个基因的重组表达质粒,并分别在大肠杆菌中成功表达。Western blotting分析表明重组蛋白rSj MAP 2和rSj mago nashi具有良好的抗原性,应用这两种重组抗原免疫小鼠,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得的减虫率分别为17.8%和22.43%,肝脏虫卵减少率分别为36.24%和29.11%。以上研究表明,日本血吸虫Sj MAP 2和Sj mago nashi基因的表达可能对血吸虫生长发育有影响,这两个基因可能在血吸虫生殖、生长发育及细胞分化中具有重要的生物学功能。5、日本血吸虫Cyclophilin家族CyPA、CyPB和CyPC基因的研究Cyclophilin（CyP）广泛存在于生物体内,为一种分布广泛的细胞内蛋白,在植物、细菌和哺乳动物中均存在,具有高度保守性。CyP具有肽酰脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性,在体内外能结合蛋白质并催化加速它们的折叠、装配和转运;特别是富含脯氨酸的蛋白质折叠,起着分子伴侣的作用,同时在信号转导中起着重要调节作用。信号转导与蛋白翻译后修饰在日本血吸虫中发挥重要的生物学功能。本研究利用RT-PCR技术分别获得了Sj CyP A、Sj CyPB和Sj CyPC编码基因的全长cDNA（基因登录号为:GQ403666、GQ403664和GQ403665）。荧光实时定量PCR分析这三个基因在不同期别阶段虫体表达量,发现这三个基因均为童虫期高表达基因。Real Time RT-PCR分别分析Sj CyP A、Sj CyPB和Sj CyPC在不同宿主来源日本血吸虫童虫的差异表达情况,发现三者均在小鼠来源童虫中表达最高,大鼠次之,东方田鼠最低。构建了这3个基因的重组表达质粒,并分别在大肠杆菌中成功表达Western blotting验证表明重组蛋白rSj CyP A、rSj CyPB和rSj CyP C均具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,三种蛋白免疫小鼠获得的减虫率分别为14.2%、26.98%和13.79%;肝脏虫卵减少率分别为43.38%、39.73%和51.32%。研究表明,日本血吸虫Sj CyP A、Sj CyPB和Sj CyPC基因的表达可能对血吸虫生长发育有影响,这三个基因可能在血吸虫的分子伴侣、信号转导等方面发挥重要的生物学功能。本文以日本血吸虫易感宿主BALB/c小鼠、非易感宿主Wistar大鼠和不致病宿主东方田鼠来源的10d童虫作为研究对象,应用电镜观察表明三种不同宿主来源的10d童虫在形态结构上存在较大差异。首次发现东方田鼠来源童虫虫体细胞的凋亡现象显着大于大鼠和小鼠来源虫体。首次应用寡核苷酸芯片技术对三种宿主来源童虫的差异表达基因进行了比较分析,发现一些重要的血吸虫生长发育、细胞凋亡、信号传导分子在三种不同宿主来源虫体呈差异表达,获得一批具有深入研究价值的差异表达基因信息。首次克隆、鉴定和表达了Sj MAP2, Sj magonashi, Sj CyPA, Sj CyPB和Sj CyPC五个血吸虫新基因,登录号分别为GQ403663、GQ403668 GQ403666、GQ403664和GQ403665。应用以上五种基因重组抗原进行了小鼠免疫试验,这5个基因的重组蛋白都诱导了部分免疫保护作用。首次对日本血吸虫凋亡抑制基因Sj IAP的生物学功能进行了探索,在细胞水平验证了该凋亡抑制因子可有效地抑制凋亡诱导剂诱发的凋亡。本文结果对深入探讨日本血吸虫的生长发育机制,发现血吸虫与宿主相互作用关键分子,进而为发现抗血吸虫病新的疫苗候选分子和新的治疗药物靶标提供了新思路。
贺争鸣[7]（2010）在《我国资源动物的实验动物化潜力与展望》文中认为实验动物资源建设不仅是实验动物学科发展的基础性核心工作,也是生命科学发展的关键性支撑保障条件之一。目前,已有的实验动物资源难以解决伴随着生命科学研究快速发展而涌现出来的新问题,因此需要开发新的实验动物品种（实验动物新资源的R&D则是当前迫切需要解决的问题）。本文对近年来我国资源动物实验动物化工作的现状及进展做一综述,提出存在的问题和解决问题的建议,与大家共同探讨。
龚强[8]（2010）在《东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因Mf-HSP90α的克隆筛选及其功能研究》文中研究说明流行病学调查及人工感染实验研究证明东方田鼠具有天然的日本血吸虫抗性,这种抗性能够稳定遗传。现代分子遗传学理论认为,生物体对于任何疾病的易感性和抗性都可能是由相应基因所决定的。进一步研究发现东方田鼠体内不同组织及组分体外抗日本血吸虫抗性最强的是血清,被动转移血清的小鼠同样获得日本血吸虫抗性。从东方田鼠血清入手,筛选分离抗日本血吸虫抗性物质成为有效防治日本血吸虫病新的突破口。本研究从东方田鼠骨髓基因表达文库入手,应用表达克隆法逐级筛选,最终获得日本血吸虫抗性基因Mf-HSP90α,生物信息学分析其结构和功能后,制备条件培养基,验证基因表达产物的体外杀伤日本血吸虫童虫效果,并使用逆转录病毒载体pLXSN,构建重组pLXSN-HSP90α质粒,包装重组基因病毒,导入日本血吸虫感染小鼠体内,验证其体内抗虫效果。一、东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因gC14.75的克隆筛选本研究构建了东方田鼠骨髓基因表达文库,根据表达产物的体外杀日本血吸虫童虫活性应用表达克隆法对文库进行筛选：基因表达文库随机分成8个基因池,相应质粒瞬时转染293T细胞,收集48h转染上清（条件培养基）,进行体外杀日本血吸虫童虫实验,设立阴性对照：pcDNA1.1/Amp空载体转染293T细胞培养上清；阳性对照：20%东方田鼠血清。条件培养基杀虫率最高的基因池进入下一轮筛选,三轮筛选后获得杀虫效果最好的次级亚基因池gC14。gCl4质粒铺琼脂糖平板,随机挑取单个克隆,根据单克隆插入片段大小的不同,挑选32个进行表达产物杀虫实验,最终获得体外杀虫效果最好的单个克隆gC14.75。基因池条件培养基体外杀童虫率最高一组为gC,童虫死亡率为10.9%,与对照组相比P<0.05,差异具有统计学意义。亚基因池gC1、次级亚基因池gC14条件培养基的杀虫率分别为11.5%、15.9%,与对照组相比P<0.05,差异具有统计学意义。单克隆筛选中体外杀虫率最高的克隆是75号,杀虫率为11.0%。将克隆质粒DNA送Invitrogen公司测序获得抗性基因EST,长度为331 bp,将其命名为gC14.75。通过与GenBank数据库中序列进行同源性比较,发现gC14.75为HSP90α的同源序列。二、gC14.75基因全长的克隆及其功能分析HSP90是一个高度保守的基因家族。以gC14.75序列及与其同源性最高的中国仓鼠全长HSP90αcDNA （L33676）序列为模板,分别设计引物,RT-PCR扩增获得gC14.75全长序列。将全长序列测序后,用NCBI核苷酸数据库BLASTN进行序列比对分析,结果显示该基因与HSP90α同源,故将其命名为Mf-HSP90α。进而通过生物信息学方法分析该基因结构及功能。比对分析几种不同物种HSP90α的核苷酸及氨基酸序列,发现氨基酸、核苷酸序列差异很小。为了寻找可能存在的抗日本血吸虫功能差异的依据,我们用3D-JIGSAW （version 2.0）分析比较了东方田鼠与小鼠氨基酸序列的立体结构,结果显示二者在立体结构上存在显着差异。分别将Mf-HSP90α及小鼠HSP90α（Ms-HSP90α）重组到真核表达载体pcDNA1.1/Amp,制备相应条件培养基,进行体外杀日本血吸虫童虫实验。扣除空白对照组童虫死亡率,Mf-HSP90α条件培养基杀虫率为20.3%,与对照组相比较杀虫效果显着,而Ms-HSP90α条件培养基杀虫率仅为4.4%,与Mf-HSP90α相比较存在显着差异。为了进一步探讨东方田鼠与小鼠HSP90α抗虫功能差异的机制。我们进一步从mRNA、蛋白质水平分别用RT-PCR、Western-blot方法比较分析了HSP90α在东方田鼠及小鼠体内不同组织的表达情况,发现同一物种体内不同组织间HSP90α的表达存在显着差异,同一种组织在东方田鼠与小鼠间的表达情况也明显不同。三、小鼠体内Mf-HSP90α的抗日本血吸虫作用及表达情况分析为了进一步确认Mf-HSP90α的抗日本血吸虫活性,我们采用了基因转移技术,将该基因导入血吸虫易感动物（小鼠）体内,通过对小鼠模型的抗日本血吸虫效果的考察评估Mf-HSP90α的体内抗虫作用。本实验应用逆转录病毒载体pLXSN,构建pLXSN-HSP90α重组逆转录病毒载体系统,通过小鼠尾静脉注射将重组病毒导入小鼠体内,检测重组病毒治疗后感染小鼠的减虫率、肝脏减卵率、血吸虫虫体改变及小鼠肝脏肉芽肿减少情况。重组病毒载体经PA317细胞包装后,大量收集病毒悬液,经生物学方法检测病毒滴度：pLXSN病毒滴度为1.6×107cfu/ml pLXSN-HSP90α病毒滴度为4×106cfu/ml。分别用pLXSN、pLXSN-HSP90α病毒各200μl／次,共3次经尾静脉注射治疗日本血吸虫感染小鼠,空白对照组注射等体积DMEM。pLXSN- HSP90α重组病毒处理组检获成虫相比DMEM及pLXSN病毒组均要短小,检获成虫数也明显少于两对照组,减虫率与DMEM及pLXSN病毒组相比较分别是40.8%和32.3%。选取具有代表性肝脏制成石蜡切片,进行HE染色,镜下可以观察到pLXSN-HSP90α重组病毒处理组虫卵肉芽肿明显少于两对照组,与肉眼观察肝脏表面结果相同。pLXSN-HSP90α重组病毒处理组LEPG与DMEM及pLXSN病毒组相比,pLXSN-HSP90α重组病毒处理组的减卵率分别是57.9%和49.2%。减虫率、减卵率DMEM与pLXSN病毒组相比P>0.05,差异无统计学意义,pLXSN-HSP90α重组逆转录病毒组与DMEM及pLXSN病毒相比P<0.05,差异有统计学意义。为了探讨Mf-HSP90α抗日本血吸虫功能的机制,我们用RT-PCR的方法分析比较了感染尾蚴7天DMEM, pLXSN-HSP90α重组逆转录病毒不同处理组小鼠体内几种组织HSP90α表达情况,通过对RT-PCR条带灰度扫描,统计发现DMEM处理组小鼠肌肉HSP90α的表达丰度很低,其他组织表达丰度适中,组织间差异不大。pLXSN-HSP90α重组逆转录病毒处理组小鼠肺、脑、骨髓3种组织HSP90α的表达丰度相比其他几种组织明显要高,也明显高于与DMEM处理组肺、脑及骨髓的表达丰度也明显要高。综上所述,本研究应用表达克隆法从东方田鼠骨髓基因表达文库筛选到一个日本血吸虫抗性相关基因Mf-HSP90α。东方田鼠与小鼠HSP90α氨基酸三维结构存在显着差异,东方田鼠体内不同组织间HSP90α表达丰度存在明显差异。与小鼠相比,同种组织间HSP90α的表达情况也完全不同。体外、体内实验结果显示该基因有着显着的抗日本血吸虫活性。为进一步研究其抗日本血吸虫机制奠定了良好的基础。
邹艳,黄志辉,张祖萍,曾庆仁,杨胜辉,刘彦[9]（2009）在《东方田鼠血清识别日本血吸虫各期虫体蛋白组分的特性分析》文中研究表明目的进一步了解具天然抗性东方田鼠血清识别的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）不同发育期虫体蛋白组分特性,为保护性抗原筛选提供实验依据。方法用SDS-PAGE分离Sj不同发育期虫体蛋白,经PAS染色及考马斯亮兰染色,用Western blot法观察东方田鼠血清识别Sj不同发育期虫体的蛋白组分,根据标准分子量迁移率测算各蛋白组分分子量,比较被识别蛋白组分的特性。结果东方田鼠血清对日本血吸虫4个不同发育期虫体蛋白识别的组分数量和分子量范围不尽相同,其中对子胞蚴蛋白（SSP）识别的仅有110 kDa组分,对肺期童虫蛋白（SLWP）识别的有110kDa和45～50 kDa组分,对肝期童虫蛋白（SHWP）识别的有150、110、22和14 kDa组分,与成虫蛋白（SAWP）识别的有110、80/82、90/92、45、22和14 kDa组分。在反应强度上,以识别SLWP和SHWP中的组分为最明显。这些组分与相应蛋白电泳区带与PAS染色结果比较,4个不同发育期虫体中的110 kDa组分及SAWP中45、22和14 kDa组分为糖蛋白。结论东方田鼠血清中存在天然抗Sj多种蛋白组分的抗体,识别的主要组分存在于肺期和肝期的童虫蛋白中,并具糖蛋白特性。
孙毅[10]（2007）在《日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建与东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因筛选》文中进行了进一步梳理日本血吸虫病（Schistosomiasis japonica）是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病。东方田鼠是迄今发现的唯一一种具有抗血吸虫病作用的哺乳动物。如能筛选、克隆出东方田鼠抗血吸虫抗性相关的日本血吸虫基因，可以为开发抗血吸虫疫苗和治疗药物提供新技术、新思路。噬菌体展示技术（phage display）是近年建立和发展起来的利用噬菌体融合表达外源基因的一项新技术，已广泛应用于分子间识别机制的研究。本研究首次应用T7噬菌体展示系统构建了日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库，并用东方田鼠阴性血清筛选该文库，以期筛选到与东方田鼠抗血吸虫抗性相关的日本血吸虫基因。方法与结果1．日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建：原始文库的库容量为4.98×106pfu，扩增后文库滴度为3.85x 1011pfu／ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8％，其中95.6％的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。2．东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因的筛选：分离东方田鼠阴性血清，用亲和淘洗的方法筛选文库。经三轮筛选，阳性克隆得到有效富集，共获得10种目的基因的EST序列，其中7种与GenBank中登陆的日本血吸虫基因序列具有高度相似性，相似性达到99％～100％；1种与其他物种基因有82％相似性，另外2种没有发现显着相似的基因。功能预测结果表明，部分EST编码的蛋白或多肽分子功能主要是结合作用、酶活性及结构蛋白。结论本研究成功构建了日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库，并利用东方田鼠阴性血清成功筛选到10种目的基因的EST序列，为深入阐述东方田鼠抗血吸虫分子机理和寻找新候选疫苗抗原分子奠定了基础。
二、洞庭湖日本血吸虫疫区东方田鼠生化与分子遗传学标记的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、洞庭湖日本血吸虫疫区东方田鼠生化与分子遗传学标记的初步研究（论文提纲范文）
（1）中国东方田鼠分子系统地理学及种群遗传结构研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究的背景及意义 |
| 1.1.1 东方田鼠是中国重要的模式动物资源 |
| 1.1.2 中国东方田鼠分子系统地理学及遗传结构研究的重要性 |
| 1.1.3 东方田鼠分子遗传标记发掘的意义 |
| 1.1.4 研究东亚地区动物分子系统地理学的意义 |
| 1.2 东方田鼠的概述 |
| 1.2.1 东方田鼠形态学特征 |
| 1.2.2 东方田鼠现有的亚种分类以及在中国的地理分布概况 |
| 1.2.3 东方田鼠亚种分类的争议 |
| 1.2.4 东方田鼠的生活习性 |
| 1.3 东方田鼠的实验动物化进程以及国内外研究进展 |
| 1.3.1 东方田鼠的实验动物化研究进程 |
| 1.3.2 东方田鼠的遗传学研究进展 |
| 1.4 动物分子系统地理学与群体遗传学的发展及应用 |
| 1.4.1 分子系统地理学 |
| 1.4.2 地理隔离对遗传结构的影响 |
| 1.4.3 种群的扩散与基因流 |
| 1.4.4 DNA分子标记在动物分子系统地理学中的应用 |
| 1.4.5 线粒体DNA与母系遗传 |
| 1.4.6 细胞色素b基因和CR控制区序列在系统地理学研究中的应用 |
| 1.4.7 微卫星分子标记与常染色体遗传结构分析 |
| 1.4.8 群体遗传学与分子系统地理学之间的关系 |
| 1.4.9 分子系统地理学与生物保护 |
| 1.5 啮齿目动物相关的分子系统地理学研究 |
| 1.6 冰期生物避难所的研究 |
| 1.7 本研究的前期基础和拟解决的科学问题 |
| 1.7.1 中国6个地区野生东方田鼠样本的采集 |
| 1.7.2 东方田鼠微卫星（STR）分子遗传标记的获得 |
| 1.7.3 本研究拟解决的科学问题 |
| 参考文献 |
| 第二章 东方田鼠线粒体全基因组的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 东方田鼠封闭群实验样本 |
| 2.2.2 野生东方田鼠样本的采集 |
| 2.2.3 实验仪器与试剂 |
| 2.2.4 本研究主要数据分析软件及版本号 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 东方田鼠样本基因组DNA提取 |
| 2.3.2 东方田鼠指名亚种的线粒体全基因组扩增 |
| 2.3.3 东方田鼠指名亚种的线粒体基因注释 |
| 2.3.4 东方田鼠指名亚种的线粒体基因组二级结构分析 |
| 2.3.5 线粒体基因组上多态性位点的统计及系统进化初步分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 东方田鼠线粒体基因组的拼接及基因注释 |
| 2.4.2 东方田鼠线粒体基因组的二级结构比较及特征分析 |
| 2.4.3 东方田鼠线粒体基因组的非编码控制区结构 |
| 2.4.4 东方田鼠线粒体基因组上tRNA二级结构分析 |
| 2.4.5 东方田鼠线粒体全长基因组序列的提交 |
| 2.4.6 东方田鼠线粒体种内系统进化初步分析 |
| 2.4.7 六个地区东方田鼠代表样本的线粒体全基因组多态性位点统计 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 中国东方田鼠6个地理种群的系统进化及遗传结构分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 线粒体细胞色素b基因及CR控制区序列的重测序 |
| 3.2.2 东方田鼠群体遗传多样性分析及系统进化树的构建 |
| 3.2.3 东方田鼠分歧时间及种群历史的分析 |
| 3.2.4 东方田鼠细胞色素b基因及控制区序列的种间及种内SNP统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 系统进化分析结果 |
| 3.3.2 种群遗传结构 |
| 3.3.3 东方田鼠分歧时间（Divergence time）的分析 |
| 3.3.4 东方田鼠种群历史 (Demographic history)的分析 |
| 3.3.5 东方田鼠细胞色素b基因及控制区序列的SNP统计 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 3.4.1 东方田鼠系统进化及各亚种分类的探讨 |
| 3.4.2 东方田鼠的分歧时间的研究 |
| 3.4.3 中国东方田鼠的分子遗传结构及冰期避难所的分析 |
| 3.4.4 地理屏障对东方田鼠南北种群的遗传结构影响 |
| 3.4.5 人类活动对东方田鼠种群数量的影响分析 |
| 参考文献 |
| 第四章 中国东方田鼠4个地理种群间的微卫星遗传检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 东方田鼠微卫星分子标记的筛选 |
| 4.2.2 东方田鼠STR引物的荧光标记及多重PCR扩增及产物检测 |
| 4.2.3 微卫星数据的统计及分析 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 群体遗传学参数检测 |
| 4.3.2 遗传分化与基因流 |
| 4.3.3 哈迪-温伯格平衡检测 |
| 4.3.4 遗传距离与聚类分析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 4.4.1 东方田鼠微卫星的遗传多态性 |
| 4.4.2 东方田鼠种群遗传结构与地理环境间的分析 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 获得了东方田鼠指名亚种、长江亚种的线粒体全基因组信息 |
| 5.1.2 东方田鼠线粒体母系遗传结构及系统进化分析 |
| 5.1.3 东方田鼠的微卫星遗传结构分析 |
| 5.1.4 东方田鼠线粒体基因组上的单核苷酸多态性（SNP）的发掘 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 5.3.1 本研究对东方田鼠抗血吸虫感染机理研究的提示 |
| 5.3.2 东亚地区啮齿类动物的分子系统地理学研究意义 |
| 5.3.3 东方田鼠分子生态学研究的价值 |
| 博士期间发表的相关研究论文 |
| 致谢 |
（2）东方田鼠抗日本血吸虫童虫的相关基因作用机制的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 英文缩写词简表 |
| 前言 |
| 技术路线一 |
| 技术路线二 |
| 1 东方田鼠白蛋白的分离、纯化及对日本血吸虫的杀伤效果 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试剂 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.1.3 常用试剂的配制 |
| 1.1.4 实验动物 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 血清白蛋白的分离与纯化 |
| 1.2.2 血清白蛋白对日本血吸虫的杀伤作用 |
| 1.3 讨论 |
| 2 Mf-albumin条件培养基的制备及体外杀虫实验 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 常用试剂的配制 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 细胞株、菌株、载体 |
| 2.1.6 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 pcDNA3.1/Mf-albumin重组质粒的构建 |
| 2.3 讨论 |
| 3 Mf-albumin在童虫体内的定位及Legumain对Mf-albumin的水解 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 常用试剂的配制 |
| 3.1.5 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 东方田鼠血清白蛋白在日本血吸虫体内的作用部位研究 |
| 3.2.2 日本血吸虫童虫肠道内的组织蛋白酶作用白蛋白的多序列比对分析 |
| 3.2.3 Legumain消化白蛋白 |
| 3.3 讨论 |
| 4 与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的筛选 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂和材料 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 常用试剂的配制 |
| 4.1.4 实验动物 |
| 4.1.5 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫共沉淀和ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白 |
| 4.2.2 质谱分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的验证 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试剂和材料 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 |
| 5.1.3 常用试剂的配制 |
| 5.1.4 细胞株、菌株、载体 |
| 5.1.5 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Tegument antigen基因编码蛋白功能位点及基本理化性质预测 |
| 5.2.2 ILKAP和TA在正常生理状态下的表达分析 |
| 5.2.3 Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b和Flag-ILKAP-pCMV-2b重组载体的构建 |
| 5.2.4 免疫共沉淀联合Western blotting验证ILKAP与TA的相互作用 |
| 5.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
| 致谢 |
（3）不同终末宿主对日本血吸虫感染适宜性的差异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫概述 |
| 1.1.1 血吸虫病的流行及防控现状 |
| 1.1.2 血吸虫生活史 |
| 1.1.3 日本血吸虫的中间宿主 |
| 1.1.4 日本血吸虫的终末宿主 |
| 1.1.5 血吸虫基因组 |
| 1.1.6 血吸虫疫苗研究 |
| 1.2 宿主对血吸虫感染的免疫应答 |
| 1.2.1 宿主对血吸虫感染的先天性免疫应答 |
| 1.2.2 宿主对血吸虫感染的获得性免疫应答 |
| 1.2.3 宿主感染血吸虫的免疫学特点 |
| 1.2.4 宿主免疫系统与血吸虫生长发育 |
| 1.3 芯片技术及其在血吸虫研究上的应用 |
| 1.3.1 生物芯片技术概述 |
| 1.3.2 基因芯片技术及其在血吸虫研究上的应用 |
| 1.3.3 蛋白芯片技术及其在血吸虫研究上的应用 |
| 1.3.4 展望 |
| 第二章 日本血吸虫在不同适宜性动物宿主中的发育和致病 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.3 尾蚴感染 |
| 2.2.4 虫体收集与比较 |
| 2.2.5 不同宿主感染后肝脏病变比较 |
| 2.2.6 扫描电镜与透射电镜观察三种天然保虫宿主来源虫体的超微结构 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 六种宿主来源虫体发育和虫体回收率比较 |
| 2.3.2 虫体形态学比较 |
| 2.3.3 六种动物宿主感染日本血吸虫后的肝脏病变观察 |
| 2.3.4 三种天然宿主感染日本血吸虫后的肝脏病理切片观察 |
| 2.3.5 三种天然保虫宿主来源虫体的超微结构观察 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 天然宿主黄牛和水牛感染日本血吸虫后的免疫应答初步研究 |
| 3.1 绪言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 试验动物及尾蚴感染 |
| 3.2.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2.3 血液样本收集和处理 |
| 3.2.4 免疫相关细胞和细胞因子检测 |
| 3.2.5 血清特异性IgG抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 天然宿主黄牛和水牛感染日本血吸虫前后的CD4、CD8 T细胞变化分析 |
| 3.3.2 天然宿主黄牛和水牛在感染日本血吸虫前后的细胞因子变化分析 |
| 3.3.3 天然宿主黄牛和水牛在感染日本血吸虫前后的IgG抗体水平分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 不同天然宿主来源日本血吸虫的基因表达谱分析 |
| 4.1 绪言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 动物感染及虫体收集 |
| 4.2.2 芯片的定制 |
| 4.2.3 虫体RNA制备及反转录 |
| 4.2.4 芯片杂交、扫描与数据分析 |
| 4.2.5 实时定量PCR对芯片结果的验证 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 总RNA提取 |
| 4.3.2 芯片试验 |
| 4.3.3 芯片杂交数据概貌 |
| 4.3.4 三种天然宿主来源虫体的差异表达基因统计 |
| 4.3.5 非适宜宿主水牛组来源虫体差异表达基因的Go功能分析 |
| 4.3.6 三种天然宿主来源虫体的差异表达基因分析 |
| 4.3.7 实时定量PCR法对芯片结果的验证 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 不同宿主来源虫体的微卫星分析及特征性差异表达基因的筛选验证 |
| 5.1 利用微卫星技术初探六种宿主来源日本血吸虫的遗传多态性 |
| 5.1.1 材料和方法 |
| 5.1.2 结果 |
| 5.1.3 讨论 |
| 5.2 黄牛、水牛、山羊来源日本血吸虫特征性差异表达基因筛选与验证 |
| 5.2.1 材料与方法 |
| 5.2.2 结果 |
| 5.2.3 讨论 |
| 第六章 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血基因表达谱分析 |
| 6.1 绪言 |
| 6.2 材料方法 |
| 6.2.1 牛全基因组芯片 |
| 6.2.2 黄牛和水牛的感染 |
| 6.2.3 感染前和感染后不同时期宿主血液样本收集和处理 |
| 6.2.4 血液样本RNA提取 |
| 6.2.5 RNA质检 |
| 6.2.6 样品RNA的放大和标记 |
| 6.2.7 芯片杂交 |
| 6.2.8 结果扫描 |
| 6.2.9 差异基因的筛选和分析 |
| 6.2.10 实时定量PCR对芯片结果的验证 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 芯片试验 |
| 6.3.2 基因芯片表达谱分析 |
| 6.3.3 感染前水牛与黄牛差异表达基因的筛选和分析 |
| 6.3.4 感染 7w后水牛与黄牛差异表达基因的筛选和分析 |
| 6.3.5 黄牛组感染前后差异表达基因的筛选和分析 |
| 6.3.6 水牛组感染前后差异表达基因的筛选和分析 |
| 6.3.7 实时定量PCR对芯片结果的验证 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）东方田鼠线粒体基因组序列及Y染色体部分序列的测定及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 东方田鼠的分类及地理分布 |
| 1.1.2 东方田鼠相关的遗传学研究进展 |
| 1.1.3 田鼠属的系统发生研究现状 |
| 1.2 研究策略 |
| 1.2.1 线粒体基因组全序列获得的策略 |
| 1.2.2 Y染色体部分序列的测序策略 |
| 1.3 研究意义 |
| 1.3.1 东方田鼠实验动物化研究 |
| 1.3.2 东方田鼠是我国重要的实验动物资源 |
| 1.3.3 东方田鼠的生态防治 |
| 1.4 本课题创新点 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 溶液配制方法 |
| 2.2.4 实验计算机软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 东方田鼠DNA抽提及保存 |
| 2.3.2 线粒体体基因组和Y染色体部分序列测序引物设计 |
| 2.3.3 Y染色体部分序列测序引物设计 |
| 2.3.4 PCR和LA-PCR |
| 2.3.5 mtDNA基因组的序列的拼接、注释与分析 |
| 2.3.6 利用mtDNA的系统进化分析 |
| 第三章 结果及讨论 |
| 3.1 东方田鼠长江亚种mtDNA基因组研究结果及分析讨论 |
| 3.1.1 东方田鼠基因组DNA抽提结果 |
| 3.1.2 PCR和LA-PCR结果 |
| 3.1.3 东方田鼠长江亚种的线粒体基因组基因结构 |
| 3.1.4 线粒体基因组酶切图谱分析 |
| 3.1.5 遗传进化分析 |
| 3.2 Y染色体SNP挖掘结果与讨论 |
| 3.2.1 Y染色体SNP挖掘结果 |
| 3.2.2 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 研究结论 |
| 4.2 课题展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士研究生阶段发表论文 |
| 致谢 |
（5）东方田鼠KPNA2基因克隆及抗日本血吸虫实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词简表 |
| 前言 |
| 第一章 东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因gE76.44的筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 gE76.44基因生物信息学分析及其功能分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Mf-KPNA2基因治疗效果及表达情况分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的主要研究成果 |
（6）不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 东方田鼠抗血吸虫的研究 |
| 1.2.1 东方田鼠抗日本血吸虫病现象 |
| 1.2.2 日本血吸虫在东方田鼠体内的发育及宿主炎症反应 |
| 1.2.3 东方田鼠抗日本血吸虫特异性免疫机制研究 |
| 1.2.3.1 东方田鼠抗日本血吸虫体液免疫机制研究 |
| 1.2.3.2 东方田鼠抗日本血吸虫的细胞免疫机制研究 |
| 1.2.3.3 东方田鼠抗日本血吸虫非特异性免疫机制研究 |
| 1.2.3.4 东方田鼠抗日本血吸虫其他可能机制研究 |
| 1.3 血吸虫疫苗的研究 |
| 1.3.1 血吸虫疫苗的种类 |
| 1.3.2 血吸虫研究的保护性抗原介绍 |
| 1.4 基因芯片技术在寄生虫学中的应用 |
| 1.4.1 基因芯片的定义 |
| 1.4.2 基因芯片的制备 |
| 1.4.3 基因芯片技术在寄生虫学中的应用 |
| 第二章 不同宿主来源日本血吸虫 10d 童虫形态观察和体细胞凋亡研究 |
| 2.1 绪言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 虫体收集 |
| 2.2.5 扫描电镜观察不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.2.6 透射电镜观察不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.2.7 Annexin V-FITC/propidium iodide (PI)法检测不同宿主来源虫体细胞细胞凋亡 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 扫描电镜分析不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.3.2 透射电镜分析不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.3.3 不同宿主来源虫体细胞细胞凋亡分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 不同宿主来源日本血吸虫童虫基因表达的芯片分析 |
| 3.1 绪言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验动物 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 虫体收集 |
| 3.2.5 寡核苷酸芯片的定制与杂交 |
| 3.2.6 芯片结果的实时定量PCR 验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 虫体总RNA 的提取 |
| 3.3.2 不同宿主来源童虫差异表达基因分析 |
| 3.3.3 芯片结果Real time RT-PCR 验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章日本血吸虫细胞凋亡因子和凋亡抑制因子 SjIAP 研究 |
| 4.1 绪言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和酶 |
| 4.2.2 菌种、实验动物和血清 |
| 4.2.3 RNA 的提取 |
| 4.2.4 不同宿主来源童虫caspase3/7 活性检测 |
| 4.2.5 IAP 基因的扩增及生物信息学分析 |
| 4.2.6 荧光实时定量RT-PCR 检测 |
| 4.2.7 重组表达质粒的构建与表达 |
| 4.2.8 Western blotting 检测 |
| 4.2.9 重组蛋白质谱鉴定 |
| 4.2.10 IAP 质粒转染对ActD 药物诱导凋亡的抑制作用 |
| 4.2.11 免疫组化 |
| 4.2.12 虫体蛋白与重组IAP 蛋白相互作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同宿主来源童虫caspase3/7 活性分析 |
| 4.3.2 不同宿主来源虫体caspase3 和caspase7 实时定量分析 |
| 4.3.3 Sj IAP 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.4 重组原核表达质粒的构建、原核表达及重组蛋白纯化 |
| 4.3.5 Sj IAP 基因的期别差异表达分析 |
| 4.3.6 Sj IAP 在293T 细胞中对caspase 活性的抑制作用 |
| 4.3.7 Sj IAP 重组蛋白对血吸虫caspase 活性影响的研究 |
| 4.3.8 Sj IAP 的免疫定位研究 |
| 4.3.9 Sj IAP 在不同宿主来源童虫中的表达差异 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫甲硫氨酰氨肽酶2基因(MAP 2)和mago nashi基因的研究 |
| 5.1 绪言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂和酶 |
| 5.2.2 菌种、实验动物和血清 |
| 5.2.3 RNA 的提取 |
| 5.2.4 cDNA 片段的扩增及生物信息学分析 |
| 5.2.5 荧光实时定量RT-PCR 检测 |
| 5.2.6 重组表达质粒的构建与表达 |
| 5.2.7 Sj MAP2 和Sj mago nashi 基因在不同宿主来源童虫的基因和蛋白表达情况 |
| 5.2.8 吡喹酮作用对SjMAP2 基因表达影响 |
| 5.2.9 小鼠免疫保护性试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Sj MAP 2 和Sj mago nashi 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 5.3.2 重组表达质粒的构建与原核表达、重组蛋白纯化 |
| 5.3.3 Sj MAP2 和Sj mago nashi 基因的期别差异表达分析 |
| 5.3.4 Sj MAP2 和Sj mago nashi 在不同宿主来源童虫中的表达差异 |
| 5.3.5 吡喹酮作用对血吸虫Sj MAP2 基因表达影响 |
| 5.3.6 动物免疫试验结果 |
| 5.3.7 血清特异性抗体水平 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 日本血吸虫Cyclophilin 家族基因的研究 |
| 6.1 绪言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 主要试剂和酶 |
| 6.2.2 菌种、实验动物和血清 |
| 6.2.3 RNA 的提取 |
| 6.2.4 含ORF cDNA 片段和基因组序列的扩增及生物信息学分析 |
| 6.2.5 荧光实时定量RT-PCR 检测 |
| 6.2.6 重组表达质粒的构建与表达 |
| 6.2.7 复性后重组蛋白CyPA 的PPIase 酶活性测定 |
| 6.2.8 Cyclosporin A 作用日本血吸虫后Sj CyPA 基因的表达检测 |
| 6.2.9 小鼠免疫保护性试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 SjCyPA、CyPB 和CyPC 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 6.3.2 SjCyPA、CyPB 和CyPC 基因的期别差异表达分析 |
| 6.3.3 Sj CyPA、CyPB 和CyPC 重组蛋白的表达纯化 |
| 6.3.4 表达产物抗原性分析 |
| 6.3.5 重组复性蛋白 CyPA 的 PPIase 酶活性测定 |
| 6.3.6 Cyclosporin A 作用后 CyPA 基因的表达检测 |
| 6.3.7 动物免疫试验结果 |
| 6.3.8 血清抗体水平 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）我国资源动物的实验动物化潜力与展望（论文提纲范文）
| 1 资源动物特性与实验动物化研究现状 |
| 1.1 树鼩 (Tupaia belangeri chinenesis) |
| 1.2 东方田鼠 (Microtus fortis) |
| 1.3 灰仓鼠 (Cricctulus migratorius) |
| 1.4 高原鼠兔 (Ochotona curzoniae) |
| 1.5 布氏田鼠 (Lasiopodomys brandti) |
| 1.6 大仓鼠 (Tscherskia triton) |
| 1.7 长爪沙鼠 (Meriones unguiculatus) |
| 1.8 家蚕 (Bombyx mori) |
| 1.9 果蝇 (Drosophila pseudoobscura) |
| 1.10 小型猪 (Miniature Pig) |
| 1.11 斑马鱼 (Brachdanio rerio) |
| 1.12 剑尾鱼 (Xiphophorus helleri) |
| 2 问题与建议 |
（8）东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因Mf-HSP90α的克隆筛选及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词简表 |
| 前言 |
| 第一章 东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因gC14.75的筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 gC14.75基因全长的克隆及其功能分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小鼠体内Mf-HSP90a的抗日本血吸虫作用及表达情况分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（10）日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建与东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本血吸虫病 |
| 1.2 血吸虫疫苗的研究 |
| 1.3 东方田鼠抗日本血吸虫的研究 |
| 1.4 日本血吸虫cDNA文库的构建 |
| 1.5 噬菌体展示技术在抗血吸虫疫苗研究中的应用 |
| 第二章 日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 4.1首次成功构建高质量的日本血吸虫成虫噬菌体展示cONA文库 |
| 4.2首次用东方田鼠阴性血清筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,获得了多个具有进一步研究价值的日本血吸虫新基因片段: |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、洞庭湖日本血吸虫疫区东方田鼠生化与分子遗传学标记的初步研究（论文参考文献）
- [1]中国东方田鼠分子系统地理学及种群遗传结构研究[D]. 高骏. 东华大学, 2017(10)
- [2]东方田鼠抗日本血吸虫童虫的相关基因作用机制的初步研究[D]. 李荣. 中南大学, 2014(02)
- [3]不同终末宿主对日本血吸虫感染适宜性的差异分析[D]. 杨健美. 中国农业科学院, 2012(10)
- [4]东方田鼠线粒体基因组序列及Y染色体部分序列的测定及分析[D]. 姜宪环. 东华大学, 2012(07)
- [5]东方田鼠KPNA2基因克隆及抗日本血吸虫实验研究[D]. 成钢. 中南大学, 2011(12)
- [6]不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究[D]. 彭金彪. 中国农业科学院, 2010(10)
- [7]我国资源动物的实验动物化潜力与展望[J]. 贺争鸣. 中国比较医学杂志, 2010(03)
- [8]东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因Mf-HSP90α的克隆筛选及其功能研究[D]. 龚强. 中南大学, 2010(11)
- [9]东方田鼠血清识别日本血吸虫各期虫体蛋白组分的特性分析[J]. 邹艳,黄志辉,张祖萍,曾庆仁,杨胜辉,刘彦. 实用预防医学, 2009(01)
- [10]日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建与东方田鼠抗血吸虫抗性相关基因筛选[D]. 孙毅. 中国农业科学院, 2007(05)