一、丙型肝炎病毒蛋白对细胞信号转导通路的影响及其与肝癌发生的关系（论文文献综述）
鞠雪莹[1]（2021）在《10-羟基癸烯酸诱导肝癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制的分子机制》文中指出肝癌是一种常见的恶性肿瘤,具有恶性程度强、死亡率高、侵袭和转移性强等特点。常见的化疗药物主要有顺铂、洛铂和5-氟尿嘧啶（5-FU）等,存在副作用大、价格昂贵等问题。因此,寻找和开发一种经济、安全、低毒的潜在天然抗肝癌辅助活性成分或功能因子已成为当前研究热点。10-羟基癸烯酸（10-HDA）,是蜂王浆中特有的活性成分,具有抗菌消炎、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射等多种生物活性。在细胞及分子水平探究10-HDA的抗肝癌分子机制,并阐明其对肝癌细胞诱导凋亡、周期阻滞、活性氧（ROS）水平调控、迁移抑制作用及其对相应信号途径的调控效果,为开发抗肝癌的功能因子和新型抗肿瘤功能性食品提供新的思路和一定的理论依据。以10-HDA为研究对象,以肝癌细胞系为研究模型,通过CCK-8比色法检测10-HDA对肝癌细胞系（Hep G2、Hep3B、Huh7）的杀伤作用和对正常肝、肺、胃细胞（L-02、IMR-90、GES-1）的毒副作用;通过Hoechst 33342/PI双染法、Annexin V/PI染色法以及流式细胞术检测10-HDA对肝癌细胞的诱导凋亡作用;通过流式细胞术及蛋白质免疫印迹法检测10-HDA对肝癌细胞的细胞周期阻滞作用、MAPK/STAT3/NF-κB信号通路之间的关系及相关蛋白的表达情况;通过DCFH-DA荧光探针法和蛋白质免疫印迹法检测10-HDA对肝癌细胞内ROS水平、相关信号通路的调控情况及细胞核转录因子STAT3和NF-κB的表达情况;通过细胞划痕实验和蛋白质免疫印迹法检测10-HDA对肝癌细胞的迁移抑制作用及其相关蛋白的表达情况。10-HDA对肝癌细胞系具有明显的杀伤作用;同时,10-HDA对正常细胞的毒性明显低于5-FU。10-HDA抑制Bcl-2的表达水平,促进Bax的表达水平,使线粒体凋亡途径被激活,线粒体膜电位下降,从而释放细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）,Caspase-3被活化,最终使细胞发生线粒体依赖性凋亡,凋亡率高达49.24%。此外,10-HDA激活了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和信号转导与转录活化因子（STAT）3信号通路,促进了P-JNK、P-P38、IκB-α的表达,抑制了P-ERK、P-STAT3、核转录因子（NF-κB）的表达,但在加入MAPK抑制剂后被阻断;10-HDA抑制细胞核内STAT3和NF-κB核转录因子的表达;10-HDA可通过促进周期蛋白P21的表达,抑制周期蛋白P-AKT、CDK1/2、Cyclin A/B1的表达,使细胞在G2/M期发生周期阻滞;10-HDA能够诱导ROS堆积,在n-乙酰-l-半胱氨酸（NAC）处理后,细胞凋亡情况及蛋白表达明显被逆转。10-HDA通过抑制TGF-β1、P-GSK-3β、Snail、Twist、N-cadherin和Vimentin的表达,上调E-cadherin的表达,使细胞迁移作用被抑制。综上所述,10-HDA能够增加细胞内ROS水平,调控MAPK、STAT3和NF-κB信号通路,使肝癌细胞发生线粒体依赖性凋亡,抑制了AKT信号通路,影响下游周期相关蛋白表达,进而使肝癌细胞在G2/M期发生周期阻滞。此外,10-HDA抑制了TGF-β1信号通路,使肝癌细胞迁移受到了抑制。
陈椿[2]（2021）在《免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异及与肝癌临床病理特征相关性研究》文中认为目的:探讨免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病患者中的差异性,同时分析其与肝癌临床病理特征相关性,为评估患者病情和指导临床治疗提供参考。方法:（1）回顾性分析2016年1月1日-2019年9月30日期间初次在右江民族医学院附属医院住院的310例HBV相关肝病患者的临床资料,其中慢乙肝组111例,乙肝肝硬化组98例,原发性肝癌组101例。收集上述各组病例的免疫球蛋白和补体结果,比较分析免疫球蛋白和补体在不同HBV相关肝病患者中的差异。（2）回顾性分析同时期在外科住院并行肝癌切除手术的106例原发性肝癌患者临床资料。收集全部患者的免疫球蛋白和补体结果、临床情况、病理特征,按临床情况和病理特征因素分组,分析免疫球蛋白和补体与肝癌临床病理特征的相关性。结果:（1）慢乙肝组、乙肝肝硬化组、原发性肝癌组三组患者血清中的Ig A、Ig G、Ig M、C3、C4含量差异均有统计学差异（P<0.01）。乙肝肝硬化组的Ig A、Ig G、Ig M含量均高于慢乙肝组和原发性肝癌组（P<0.01）,而慢乙肝组和原发性肝癌组Ig A、Ig G、Ig M含量差异无统计学意义（P>0.05）。原发性肝癌组C3、C4含量高于慢乙肝组和乙肝肝硬化组（P<0.01）,而乙肝肝硬化组的C3、C4含量又低于慢乙肝组（P<0.01）。（2）血清Ig A、Ig G、Ig M、C3、C4水平在不同性别、AFP组中比较差异无统计学意义（P>0.01）。在HBs Ag阳性组和阴性组比较中,补体C3在阳性组水平小于阴性组,差异有统计学意义（P<0.01）,其余指标比较无统计学意义（P>0.05）。Ig A、Ig G水平和年龄呈正相关（P<0.05）,Ig M、C3、C4和年龄无相关性（P>0.05）。（3）在有门脉癌栓和无门脉癌栓组中Ig A、Ig G、Ig M、C3、C4的水平差异无统计学意义（P>0.05）。补体C3和C4在肿瘤>5cm组中的水平大于肿瘤≤5cm组,差异具有统计学意义（P<0.01）,其余指标比较无统计学意义（P>0.05）。补体C3在有肝硬化组中的水平低于无肝硬化组的水平,差异具有统计学意义（P<0.01）,其余指标比较无统计学意义（P>0.05）。Ig A、Ig G、Ig M和BCLC分期无相关性（P>0.05）,补体C3、C4水平和BCLC分期呈正相关（P<0.01）,Ig G水平和分化程度呈负相关（P<0.05）,补体C3水平和分化程度呈正相关（P<0.05）,Ig A、Ig M、C4和分化程度无相关性（P>0.05）。结论:（1）HBV相关肝病患者的免疫球蛋白Ig A、Ig G、Ig M水平随着肝脏病变的加重而升高;而补体C3、C4水平随着肝脏病变的加重而降低,在原发性肝癌中表现出升高趋势,其具体机制可能与补体对肝癌细胞的免疫抑制有关。（2）免疫球蛋白和肝癌临床病理特征无明显相关性,而补体水平和肿瘤大小、分化程度、BCLC分期存在正相关性,对于评估肝癌患者中的抗肿瘤免疫功能和病情具有一定临床意义。
邓日林[3]（2020）在《ISG12a通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤免疫机制》文中进行了进一步梳理肿瘤严重危害人类健康。通过增强效应T细胞为主的适应性免疫抗肿瘤作用,PD-1等免疫检查点的抑制剂广泛用于肿瘤的治疗。然而,肿瘤的异质性导致只有少数患者在免疫治疗中有持续性效果。经典Wnt/β-catenin信号通路的活化可致肿瘤发生发展、耐药和治疗耐受、肿瘤干细胞特性（CSC）和上皮间质转换（EMT）,还可能抑制免疫监管。先天免疫是肿瘤放疗、化疗和免疫治疗的基础,不仅可以介导对肿瘤细胞的识别、诱导和扩大免疫应答,而且可以发挥抗肿瘤效应、缓解肿瘤微环境中的免疫抑制。干扰素（IFN）通过激活JAK-STAT信号通路,诱导IFN刺激基因（ISGs）的表达,发挥抗肿瘤作用。然而,目前只发现RIG-I等极少数ISGs的抗肿瘤作用,大多数ISGs的功能未明。我们前期研究发现,IFN刺激基因ISG12a可逆转肿瘤细胞耐药、促进病毒诱导的先天免疫应答,是一个先天免疫效应分子。我们推断ISG12a可能调控肿瘤发生发展和肿瘤免疫,为此开展了如下研究:第2章发现ISG12a在肿瘤细胞和癌组织中呈低水平表达。为研究ISG12a的抗肿瘤效应,我们以肝细胞癌（HCC）和胃癌（GC）为研究对象。利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR（q RT-PCR）、免疫组织化学（IHC）染色等方法,确定ISG12a响应IFN刺激,ISG12a在肝癌细胞和胃癌细胞以及HCC和GC的癌组织中呈低水平表达,提示ISG12a可能抑制肿瘤的发生发展。第3章确定ISG12a的抗肿瘤作用。我们以沉默ISG12a的肝癌细胞和胃癌细胞进行了如下研究:通过检测细胞生长曲线、开展结晶紫染色和琼脂糖集落形成实验,发现ISG12a抑制肿瘤细胞增殖;借助于划痕和Transwell实验明确ISG12a阻碍肿瘤细胞迁移;粘附实验鉴定ISG12a降低肿瘤细胞的粘附能力;通过裸鼠皮下和尾静脉注射肿瘤细胞的方法,发现ISG12a抑制肿瘤发生、生长和转移;采用肿瘤干细胞球培养实验,发现ISG12a可降低CSC表型;检测EMT相关标志物和F-actin细胞骨架的表达变化确定ISG12a对EMT的负调控作用。基于以上发现,我们认为ISG12a是一个抑癌基因。第4章阐述ISG12a抑制经典Wnt/β-catenin信号通路的机制。结合肿瘤细胞内EMT标志物β-catenin的表达变化和RNA测序,我们推断ISG12a调控Wnt/β-catenin信号通路;借助蛋白免疫印迹、免疫荧光染色、q RT-PCR和双荧光素酶报告基因等技术方法,我们发现ISG12a对Wnt/β-catenin信号通路活化的抑制作用;利用蛋白的泛素化降解和免疫共沉淀实验结合生物信息学分析,阐明ISG12a通过阻断Axin蛋白的泛素化降解而促进β-catenin蛋白的泛素化降解,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路的机制。第5章揭示ISG12a促进肿瘤免疫的作用和机制。我们利用IHC染色排除了ISG12a对肿瘤免疫浸润的调控作用,而利用流式细胞术等方法确定了ISG12a促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫。非常有趣的是,我们通过流式细胞术等方法发现ISG12a抑制肿瘤细胞表面免疫检查点PD-L1的表达,并利用染色质免疫沉淀、双荧光素酶报告基因等技术方法,发现β-catenin是PD-L1新的转录因子。结合NK细胞杀伤和受体-配体封闭实验,揭示了ISG12a通过逆转PD-1/PD-L1信号轴,促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫。因此,我们认为ISG12a通过抑制肿瘤细胞内Wnt/β-catenin信号通路,阻断PD-1/PD-L1信号轴而抑制免疫逃逸,进而促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。第6章明确ISG12a研究的临床意义。首先分析了临床肿瘤组织中ISG12a和Axin蛋白的表达,明确ISG12a对体内Wnt/β-catenin信号通路的特异性调控作用;然后探讨了肿瘤组织的ISG12a表达水平与临床预后的关系,发现癌组织内低表达ISG12a易致预后不良;最后解析了ISG12a表达水平与临床病理的关系,确定癌组织内低表达ISG12a可致肿瘤恶性进展。本研究的创新性和意义主要体现在三个方面:（1）确定ISG12a抑制肿瘤细胞增殖、迁移、转移、CSC和EMT等恶性表型,是一个新的抑癌基因,与HCC和GC的临床预后、恶性进展有重要联系;（2）首次发现SKP2是降解β-catenin蛋白复合物中支架蛋白Axin的E3泛素连接酶;（3）首次发现β-Catenin是免疫检查点PD-L1的转录因子,肿瘤细胞通过Wnt/β-Catenin信号通路上调PD-L1的表达而实现其免疫逃逸。总之,先天免疫效应分子ISG12a通过抑制肿瘤细胞内经典Wnt/β-Catenin信号通路逆转PD-1/PD-L1信号轴,促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫。ISG12a的抗肿瘤作用及机理的研究强调IFN和先天免疫促进免疫治疗的关键作用。ISG12a等ISGs可能是肿瘤诊断和治疗的靶标,在肿瘤防治中将发挥重要作用。本研究确定的先天免疫、Wnt/β-catenin信号通路和肿瘤免疫之间的关系将为提高免疫治疗提供新的策略。
王好好[4]（2020）在《GSG2在肝细胞肝癌中的表达及其调控机制研究》文中提出目的分析GSG2在肝癌及癌旁组织中的表达水平及其与患者临床病理特征的相关性。研究GSG2敲减对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移以及细胞周期的影响。构建荷瘤模型,研究GSG2敲减对小鼠体内肿瘤生长发育的影响。方法1.获取患者知情同意,收集患者肝癌及癌旁样本。同时记录患者临床病理资料,主要包括患者年龄、性别、TNM分期、肿瘤病理分级以及肿瘤分期。应用免疫组化测得肝癌及癌旁组织中GSG2的表达水平,并应用统计软件分析GSG2表达水平与病人临床资料的相关性。2.应用MTT法检测GSG2敲减后肝癌细胞增殖情况,克隆形成实验检测GSG2敲减对肝癌细胞克隆能力的影响,划痕实验检测GSG2敲减对肝癌细胞迁移的影响,流式细胞法检测GSG2敲减对肝癌细胞凋亡的影响。应用流式细胞仪检测出细胞DNA含量,最后软件分析计算出细胞所处周期。3.肿瘤在体内的生长发育:在小鼠前肢腋下注射肿瘤细胞建立荷瘤模型后,定期记录并计算出肿瘤大小、体积及小鼠重量,应用小动物活体成像仪测量肿瘤的荧光强度。处死小鼠获得肿瘤组织后,使用免疫组化检测肿瘤样本Ki-67表达水平。结果1.免疫组织化学结果显示:179例原发性肝癌标本中GSG2表达水平低和高的比例分别为:52.0%和48.0%。在20例癌旁组织中,GSG2低表达率为100.0%。统计分析得出肝癌组织中GSG2的表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05）,进一步统计分析显示GSG2表达水平与肿瘤分期及肿瘤浸润深度有相关性并且呈正相关（P<0.05）。2.GSG2敲减后,MTT法测得的肝癌细胞增殖速率显着减慢（P<0.001）,克隆形成实验测得的细胞克隆形成数目明显减少（P<0.001）,并且划痕实验测得的细胞迁移率明显下降（P<0.001）。流式细胞测得的细胞凋亡率明显增加（P<0.001）,细胞周期停滞于G2期（P<0.001）,差异具有统计学意义。3.在荷瘤模型中,相较于对照组,GSG2敲减组的肿瘤荧光强度明显变弱（P<0.001）,并且敲减组的肿瘤重量与体积都明显小于对照组（P<0.01）,Ki-67表达相较于对照组降低（P<0.05）。结论GSG2在肝细胞肝癌中存在过表达,并且其表达水平与肿瘤浸润深度相关。GSG2敲减抑可制肝癌细胞增殖、克隆形成、细胞迁移、导致G2周期停滞以及促进细胞凋亡,最终抑制肝细胞肝癌进展。
李龙[5]（2019）在《和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究与STAT3在MHV68感染中的作用分析》文中认为疱疹病毒家族是一种能够在宿主体内建立终身潜伏感染的重要病原体。目前疱疹病毒感染在全球人群中的血清阳性率在20%95%,发病率在发展中国家可能会更高。例如全球超过三分之二的人都感染了单纯疱疹病毒（HSV）,超过90%的人群都感染了巨细胞病毒（HCMV）,一半以上的人群感染了EB病毒（EBV）或则卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）。疱疹病毒在人体内原发性感染或者周期性的重激活都会导致不同的临床疾病,包括口唇疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、淋巴瘤、卡波西肉瘤等。在免疫力低下的人群感染疱疹病毒后会导致更为严重的结果,如不可恢复性神经损伤、失明、甚至死亡。目前临床上除了水痘-带状疱疹病毒具有预防性疫苗,大部分疱疹病毒包括HSV-1、KSHV等均无有效的疫苗。临床上治疗用的药物大部分是针对疱疹病毒的DNA聚合酶发挥出抗病毒作用,无法规避耐药性毒株的出现,并且这些抗病毒药物具有较大副作用。因此,继续寻找新的抗疱疹病毒药物就显得很有意义。本研究主要包括两部分工作,第一部分是探究中草药活性成分和厚朴酚抗疱疹病毒作用及其作用机制。第二部分工作初步探究了STAT3与MHV68从头感染之间的关系。中草药活性成分和厚朴酚是一种具有多种药理学活性的新木质素,能够发挥着抗肿瘤、抗炎症、抗血栓形成、抗微生物感染等功能,然而其在抗病毒感染方面的研究却非常有限。本文通过融合表达了荧光蛋白基因的重组病毒包括HSV-1-GFP、KSHV-RGB-BAC16、MHV68-H2b-YFP等构建方便检测的疱疹病毒感染模型。借助于荧光显微镜观察、实时定量PCR技术和蛋白免疫印迹技术等首次发现和厚朴酚具有抗疱疹病毒的作用,不仅可以抑制人的阿尔法型疱疹病毒（HSV-1）和伽马型疱疹病毒（KSHV）,也可以抗小鼠疱疹病毒（MHV68）。初步结果显示和厚朴酚抗HSV-1是通过抑制DNA复制,基因表达,病毒颗粒产生,并且对于病毒的入侵过程没有影响。疱疹病毒感染和宿主因子之间存在着密切关系,这对于抗疱疹病毒治疗非常有意义。STAT3具有信号转导和转录激活双功能,在病毒感染过程作用复杂。事实上,许多药物活性成分可以通过抑制STAT3信号通路中的靶点发挥作用。和厚朴酚是否由此影响疱疹病毒的从头感染尚未可知,在解决这个问题之前我们首先想探究清楚STAT3信号通路和MHV68从头感染的关系。在本文的第二部分我们发现抑制了JAK-STAT3信号通路可以导致MHV68感染能力下降,并构建过表达STAT3的小鼠胚胎成纤维母细胞系,为研究STAT3与MHV68感染提供了方便。结果过表达STAT3与STAT3C（STAT3持续性激活形式）均能够显着增加MHV68感染;并促进其重激活。这两部分原创性的研究描述了一种潜在的抗疱疹病毒感染药物和厚朴酚及其作用机制。初步探究STAT3可以增强MHV68从头感染,促进MHV68重激活。这将为探究MHV68感染和宿主转录因子STAT3之间相互影响的分子机制奠定基础;也为进一步探究和厚朴酚抗疱疹病毒作用机制铺平道路。
王明珍[6]（2019）在《宿主因子对丙型肝炎病毒复制的影响》文中研究表明丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）严重威胁着人类的健康,据世界卫生组织报道,全球约有七千一百万人被HCV感染,并且约80%的被感染者由急性感染转变成了慢性持续性感染,进而引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌等疾病。随着研究的不断发展,治疗HCV感染的药物研究也取得了新进展,一种直接抗病毒药物sofosbuvir在2013年成为了首个治疗HCV感染的口服药物。与传统的聚乙二醇-干扰素和病毒唑联合疗法相比,sofosbuvir取得了较好的疗效。但是,高昂的治疗费用、不同基因型治疗效果有差异、病毒耐药性突变等问题依旧存在。并且迄今为止,仍没有有效的HCV疫苗。HCV在宿主细胞内的复制极其复杂,病毒粒子的进入、基因组的翻译、RNA的复制、病毒粒子的组装释放等过程都需要细胞内的宿主因子参与完成。因此,研究宿主因子在HCV复制周期中的作用以及相关机制仍然是寻找抗病毒药物的关键。EPSTI1（epithelial stromal interaction 1）为干扰素诱导基因,其在细胞凋亡、乳腺癌的发展以及免疫应答中都发挥重要作用。在本研究中,我们发现HCV感染能够诱导EPSTI1转录表达,且与病毒滴度呈正相关。我们还发现I型、II型、III型干扰素都能诱导EPSTI1的转录表达。同时,在肝癌细胞系中外源过表达EPSTI1会抑制HCV RNA和Core蛋白的表达量。而下调内源的EPSTI1,HCV RNA和Core蛋白的表达量均增加。由此说明,EPSTI1能够抑制HCV复制。进一步研究发现,EPSTI1不影响HCV的进入和病毒粒子的组装释放过程,而是抑制HCV亚基因组复制。推测其可能在HCV基因组复制过程中发挥作用。SPSB2（SPRY domain-and SOCS box-containing protein 2）为SPSB家族成员,作为一个接头蛋白,其通过SPRY结构域招募靶蛋白,并通过SOCS box结构域参与组成E3泛素连接酶ECS（Elongin BC-Cullin5-SOCS box）复合物,在宿主免疫应答中发挥重要作用。在本研究中,我们发现HCV感染能够诱导SPSB2转录表达。在肝癌细胞系中过表达SPSB2,HCV RNA和Core蛋白的表达量均降低。而下调内源的SPSB2,HCV RNA和Core蛋白的表达量均增加。同时,我们还发现,SPSB2的抗病毒功能依赖于SOCS box结构域。进一步研究发现,SPSB2和HCV结构蛋白E1及非结构蛋白NS5A都有相互作用,并且SPRY结构域的C端是SPSB2与E1以及NS5A相互作用的关键区域。同时,我们发现SPSB2能够对NS5A进行多聚泛素化修饰并通过蛋白酶体途径将其降解。综上可以表明,SPSB2可以通过和HCV非结构蛋白NS5A结合并介导其泛素化降解,从而抑制HCV的复制。ASB9（ankyrin repeat and SOCS box containing 9）为ASB家族成员,通过ANK序列与CK激酶家族成员CKB和uMtCK结合并通过C端的SOCS box结构域参与组成E3泛素连接酶ECS复合物,然后通过蛋白酶体途径将CKB和uMtCK降解。同时,ASB9还是一个重要的肿瘤抑制因子,是乳腺癌、结肠癌临床诊断的重要指标。在本研究中,我们发现,ASB9通过第一个ANK序列与HCV非结构蛋白NS5A相互作用,并且在肝癌细胞系中过表达ASB9可以抑制HCV的复制,而下调内源的ASB9则促进HCV的复制。同时,ASB9的抗病毒功能依赖其SOCS box结构域。
覃煜雯[7]（2019）在《NLRX1和Sam68调控丙型肝炎病毒复制机制研究》文中研究表明丙型肝炎病毒（HCV）是一种重要的人类病原体,全世界有超过1.7亿人被感染,它可导致慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌。目前还没有有效针对丙型肝炎病毒的疫苗。HCV是一种单股正链RNA病毒,编码产生3种结构蛋白和7种非结构蛋白。HCV感染人类细胞后,受到宿主先天免疫应答的调控。病毒入侵宿主细胞后,模式识别受体RIG-I样受体识别病毒的病原相关分子模式（PAMPs）,RIG-I和MDA5被激活后发生构象变化,激活定位在线粒体外膜上的接头蛋白MAVS,MAVS招募并激活IRF3和NF-kB,最终诱导I型、III型干扰素以及其他抗病毒细胞因子的产生。我们的研究发现,HCV上调肝细胞内的NLRX1蛋白水平。沉默NLRX1可抑制HCV复制,而过表达NLRX1则促进HCV复制和病毒蛋白的积累。在稳定沉默NLRX1的细胞系中感染HCV,I型干扰素、III型干扰素和干扰素诱导基因（ISGs）的mRNA水平都明显上升。进一步研究发现,NLRX1与接头蛋白MAVS结合,诱导MAVS泛素化降解。深入研究发现,NLRX1与PCBP2相互作用,并促进MAVS的K48位泛素化。除了HCV之外,NLRX1对其它RNA病毒诱导的先天性免疫反应也起负调控作用。另外我们发现HCV感染诱使Sam68从细胞核转移到细胞质,Sam68结合于病毒基因组5’-UTR的第2个茎环结构,促进病毒复制。综上所述,NLRX1通过招募PCBP2促进关键信号分子MAVS的泛素化降解,从而抑制HCV诱导的人肝细胞先天免疫应答,最终导致导致HCV持续感染。Sam68直接靶向HCV基因组RNA,促进HCV在宿主细胞中复制。本研究工作寻找到了两个关键的宿主蛋白NLRX1和Sam68分别通过调控先天免疫信号通路和直接靶向HCV基因组RNA的方式,调控HCV在宿主细胞内的复制,本研究为在丙型肝炎病毒感染过程中宿主对病毒的调控机理的理解提供了新见解,也为开发潜在丙型肝炎病毒的疫苗提供了新思路。
赵艳[8]（2019）在《miR-141调控丙型肝炎病毒感染肝癌细胞的机制研究》文中研究指明目的:探讨micro RNA-141（miR-141）在Hepatitis C virus（HCV）感染过程中发挥的作用。主要从两方面进行研究,miR-141对HCV进入宿主细胞的调节机制及对interferonβ（IFNβ）信号通路的改变及HCV复制的影响。方法:利用q RT-PCR检测miR-141及相关基因的m RNA水平;Western blot和免疫组化等方法检测EPH receptor A2（Eph A2）及相关基因的蛋白表达;利用HCV病毒颗粒检测试剂盒测定制备的病毒滴度以及经处理的细胞培养上清中释放的病毒颗粒的滴度;利用免疫荧光检测进入细胞中的HCV颗粒、细胞表面受体的表达及共定位情况;用Target Scan、Pic Tar、star Base等在线软件预测miR-141的靶基因;利用UCSC、Reg RNA2.0等在线软件预测靶基因的启动子序列,并寻找靶基因与miR-141结合的位点;利用双荧光素酶报告基因试验验证miR-141与Eph A2之间的靶向关系及IFNβ和NF-κB p65的活性;利用si RNA敲低Eph A2和TLR8,分析敲低Eph A2与过表达miR-141的生物学影响的相似性;利用Eph A2的小分子抑制剂dasatinib处理肝癌细胞;利用共培养的方法检测过表达miR-141对细胞-细胞接触介导的HCV进入的影响。结果:Mi R-141在HCV感染的患者阳性外周血中表达极低,在HCV感染相关的肝癌组织中表达明显低于临近癌旁组织。过表达miR-141明显减少了进入细胞内的HCV非结构蛋白NS5A和结构蛋白Core的表达;免疫荧光结果显示,病毒感染早期,过表达miR-141的细胞中HCV Core的表达明显低于对照细胞;双荧光素酶报告基因实验验证了过表达miR-141能明显抑制Eph A2的表达;过表达miR-141的细胞中Eph A2的表达明显被抑制;HCV感染相关的肝癌组织Eph A2的表达明显高于临近癌旁组织;利用si RNA敲低Eph A2,明显减少了细胞内HCV NS5A和Core的表达;利用Eph A2的特异性抑制剂Dasatinib处理后,Eph A2的表达明显被抑制,细胞内HCV NS5A和Core的表达明显减少,进入细胞内HCV Core的表达减少;过表达miR-141抑制了Eph A2-CLDN1、Eph A2-OCLN以及CD81-CLDN的共定位;过表达miR-141能明显减少细胞-细胞间病毒的传播。另一方面,随HCV的感染的时间长,miR-141的表达逐渐降低;过表达miR-141明显降低了HCV Core和NS5A的表达;过表达miR-141的细胞,在感染HCV后IFNβ的表达明显增加;过表达miR-141增加了IFNβ信号通路中IRF3、c-Jun及NF-κB p65的表达;Western blot结果显示,IRF3、c-Jun和NF-κB p65的表达增加;敲低miR-141后,细胞内IFNβ信号通路中IRF3、c-Jun及NF-κB p65的表达减少,而HCV NS5A和Core的表达增加;非变性蛋白的Western blot结果显示,过表达miR-141的细胞在HCV感染后形成的IRF3二聚体明显增加,而敲低miR-141后二聚体的形成明显被抑制;体外过表达miR-141明显增加了TLR7、TLR8和TLR9的表达;软件预测发现miR-141能与IFNβ信号通路上游的TLR8基因的启动子区域结合;敲低TLR8,细胞内HCV NS5A和Core的表达明显增加,细胞内IRF3、c-Jun及NF-κB p65的表达及IRF3的二聚体化都减少。结论:miR-141可通过下调Eph A2,从而减少Eph A2与CLDN1和OCLN的结合,抑制CD81和CLDN1共定位,减少病毒-细胞受体复合物的内化,从而抑制HCV进入宿主细胞。miR-141能通过增强TLR8的表达而进一步激活IFNβ信号通路的表达,增强机体对HCV感染的抵抗作用。
田婧[9]（2019）在《PTPRD基因调控PI3K-Akt-mTOR途径影响人肝癌细胞增殖和迁移的机制研究》文中指出研究目的1 明确蛋白酪氨酸磷酸酶 D（Protein tyrosine phosphates receptor type delta,PTPRD）基因在人肝癌细胞中的抑癌活性。2阐明PTPRD基因调控磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）-蛋白激酶 B（Proten kinase B,PKB/Akt）-雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）途径影响人肝癌细胞增殖和迁移的分子机制。3为寻找肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）新的遗传标记物和肝癌治疗的新靶点提供新思路。研究方法1采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测人正常肝细胞（L02）和肝癌细胞株（HepG2和HuH-7）中PTPRD基因的mRNA和蛋白表达水平。2采用PTPRD基因过表达腺病毒和shRNA-PTPRD慢病毒分别转染构建PTPRD基因过表达和沉默的稳定人肝癌细胞系,然后采用MTT和细胞划痕实验分别检测PTPRD基因表达水平的变化对人肝癌细胞增殖和迁移的影响。3采用Western blot检测PTPRD基因过表达和沉默的稳定人肝癌细胞系中蛋白激酶b（Akt）、磷酸化蛋白激酶b（Phosphatase-proten kinase b,p-Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化雷帕霉素靶蛋白（Phosphatase-mammalian target of rapamycin,p-mTOR）的蛋白表达水平。研究结果1与人正常肝细胞L02相比,人肝癌细胞（HepG2和HuH-7）PTPRD基因的mRNA和蛋白水平均较低（P<0.05）。2 PTPRD基因过表达的HepG2和HuH-7肝癌细胞系构建成功。与阴性对照组相比,PTPRD基因过表达两种肝癌细胞系（HepG2和HuH-7）细胞的增殖和迁移明显受到抑制（P<0.05）;仅PTPRD基因沉默的HepG2细胞系构建成功,PTPRD基因沉默后的HepG2细胞较阴性对照组细胞的增殖和迁移均上升（P<0.05）。3与阴性对照组相比,PTPRD基因过表达的两种肝癌细胞系（HepG2和HuH-7）中Akt和mTOR蛋白的表达均无统计学意义,p-Akt和p-mTOR蛋白的表达均明显降低（P<0.05）,反之,PTPRD基因沉默的HepG2细胞中Akt和mTOR蛋白的表达也均无统计学意义,p-Akt和p-mTOR蛋白的表达均明显上升（P<0.05）。研究结论1 PTPRD基因可能是肝癌的抑癌因子。2 PTPRD基因可能通过调控PI3K-Akt-mTOR信号通路,影响人肝癌细胞增殖和迁移。
戴薇[10]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中认为癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
二、丙型肝炎病毒蛋白对细胞信号转导通路的影响及其与肝癌发生的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒蛋白对细胞信号转导通路的影响及其与肝癌发生的关系（论文提纲范文）
（1）10-羟基癸烯酸诱导肝癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 肝癌的研究进展 |
| 1.2 肝癌的发病因素 |
| 1.2.1 乙型肝炎病毒感染因素 |
| 1.2.2 丙型肝炎病毒感染因素 |
| 1.2.3 黄曲霉毒素因素 |
| 1.2.4 吸烟和过量饮酒 |
| 1.2.5 其他因素 |
| 1.3 肝癌的治疗方法 |
| 1.3.1 手术治疗 |
| 1.3.2 化学治疗 |
| 1.3.3 放射治疗 |
| 1.3.4 免疫治疗 |
| 1.3.5 靶向治疗 |
| 1.4 10-羟基癸烯酸的研究进展 |
| 1.4.1 抗炎抗菌作用 |
| 1.4.2 增强免疫力 |
| 1.4.3 抗肿瘤作用 |
| 1.4.4 抗辐射作用 |
| 1.4.5 降血脂作用 |
| 1.5 细胞信号通路 |
| 1.5.1 细胞凋亡 |
| 1.5.2 细胞周期 |
| 1.5.3 ROS |
| 1.5.4 MAPK信号通路 |
| 1.5.5 STAT3 信号通路 |
| 1.5.6 NF-κB信号通路 |
| 1.5.7 细胞迁移信号通路 |
| 1.6 目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验细胞株及10-羟基癸烯酸标准品 |
| 2.1.2 主要实验试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 细胞复苏 |
| 2.3 细胞培养及体外扩增 |
| 2.4 CCK-8 比色法 |
| 2.5 Hoechst33342/PI染色法 |
| 2.6 流式细胞术 |
| 2.6.1 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法 |
| 2.6.2 线粒体膜电位(JC-1)检测 |
| 2.6.3 DNA含量(细胞周期)检测 |
| 2.6.4 ROS检测 |
| 2.7 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.8 细胞划痕实验分析 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 10-HDA对肝癌细胞的杀伤作用及对正常细胞的毒副作用 |
| 3.2 10-HDA诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡 |
| 3.2.1 Hoechst33342/PI染色法观察细胞凋亡形态学特征 |
| 3.2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡数量 |
| 3.2.3 JC-1 荧光探针法检测HepG2 细胞线粒体膜电位的变化 |
| 3.2.4 蛋白质免疫印迹法检测HepG2 细胞凋亡相关蛋白的表达情况 |
| 3.3 10-HDA对人肝癌HepG2 细胞周期阻滞作用 |
| 3.3.1 流式细胞术检测HepG2 细胞的阻滞周期 |
| 3.3.2 蛋白质免疫印迹法检测HepG2 细胞周期相关蛋白的表达情况 |
| 3.4 10-HDA 调控 MAPK/STAT3/NF-κB 信号通路诱导人肝癌 HepG2 细胞凋亡机制 |
| 3.4.1 蛋白质免疫印迹法检测MAPK、STAT3和NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况 |
| 3.4.2 蛋白质免疫印迹法检测STAT3和NF-κB核转录因子的表达情况 |
| 3.4.3 蛋白质免疫印迹法检测加入MAPK抑制剂后蛋白的表达情况 |
| 3.5 10-HDA调控ROS水平诱导人肝癌HepG2 细胞凋亡 |
| 3.5.1 流式细胞术检测10-HDA对 HepG2 细胞内ROS水平的影响 |
| 3.5.2 流式细胞术检测ROS堆积对HepG2 细胞凋亡的影响 |
| 3.5.3 蛋白质免疫印迹法检测ROS对上游信号蛋白的影响 |
| 3.5.4 蛋白质免疫印迹法检测ROS对 STAT3和NF-κB核转录因子的影响 |
| 3.6 10-HDA抑制HepG2 细胞迁移 |
| 3.6.1 细胞划痕实验检测10-HDA对 HepG2 细胞迁移的影响 |
| 3.6.2 蛋白质免疫印迹法检测细胞迁移相关蛋白的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异及与肝癌临床病理特征相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 资料收集 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HBV相关肝病患者分布情况 |
| 2.2 三组患者的一般资料比较 |
| 2.3 三组患者免疫球蛋白和补体的差异 |
| 3 讨论 |
| 3.1 免疫球蛋白IgA、IgG、IgM在HBV相关肝病中的对比分析和意义 |
| 3.2 补体C3、C4在HBV相关肝病中的对比分析和意义 |
| 4 不足与展望 |
| 5 结论 |
| 第二部分 免疫球蛋白和补体与肝癌临床病理特征的相关性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 资料收集 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床资料情况 |
| 2.2 病理特征情况 |
| 2.3 免疫球蛋白和补体与肝癌临床情况相关性 |
| 2.4 免疫球蛋白和补体与肝癌病理特征相关性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 免疫球蛋白和补体与肝癌临床情况相关性分析 |
| 3.2 免疫球蛋白和补体与肝癌病理特征相关性分析 |
| 4 不足与展望 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞信号转导通路与肝癌相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（3）ISG12a通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤免疫机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤的现状和生物学特征 |
| 1.1.1 肿瘤的基本概况 |
| 1.1.2 肝细胞癌和胃癌 |
| 1.1.3 肿瘤的基本特征 |
| 1.1.4 经典Wnt/β-catenin等肿瘤信号通路 |
| 1.2 先天免疫与肿瘤的发生发展 |
| 1.2.1 先天免疫细胞与肿瘤 |
| 1.2.2 NK细胞与肿瘤 |
| 1.2.3 损伤相关分子模式 |
| 1.2.4 RNA和DNA诱导产生干扰素 |
| 1.3 干扰素和干扰素刺激基因 |
| 1.3.1 干扰素与干扰素信号通路 |
| 1.3.2 干扰素刺激基因(Interferon stimulated-genes,ISGs) |
| 1.3.3 干扰素刺激基因ISG12a |
| 1.4 肿瘤免疫 |
| 1.4.1 肿瘤免疫治疗的现状 |
| 1.4.2 肿瘤免疫逃逸 |
| 1.4.3 先天免疫在肿瘤免疫治疗中的作用 |
| 1.4.4 经典Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤免疫 |
| 1.5 本论文的设计思路 |
| 第2章 ISG12a在肿瘤细胞和癌组织中呈低水平表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验细胞 |
| 2.2.2 临床组织样本 |
| 2.2.3 试剂和耗材 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 IFN诱导ISGs实验 |
| 2.3.3 人肝细胞的分离 |
| 2.3.4 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.5 qRT-PCR |
| 2.3.6 IHC染色 |
| 2.3.7 数据的统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 IFN诱导肝癌细胞和胃癌细胞内ISG12a的高表达 |
| 2.4.2 ISG12a蛋白在肝癌细胞和胃癌细胞内呈低水平表达 |
| 2.4.3 ISG12a表达水平在肝癌组织和胃癌组织中降低 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ISG12a抑制肿瘤细胞的恶性表型 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细胞 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 材料与试剂 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 干扰质粒的构建 |
| 3.3.2 过表达质粒的构建 |
| 3.3.3 细胞培养和转染 |
| 3.3.4 慢病毒包装与感染 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.6 细胞生长曲线 |
| 3.3.7 结晶紫染色 |
| 3.3.8 软琼脂集落形成 |
| 3.3.9 粘附实验 |
| 3.3.10 划痕实验 |
| 3.3.11 Transwell实验 |
| 3.3.12 裸鼠皮下成瘤 |
| 3.3.13 裸鼠尾静脉注射 |
| 3.3.14 H&E染色 |
| 3.3.15 肿瘤干细胞球的培养 |
| 3.3.16 Phalloidin染色 |
| 3.3.17 数据的统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 稳定沉默ISG12a肿瘤细胞系的构建 |
| 3.4.2 ISG12a抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3.4.3 ISG12a抑制肿瘤细胞迁移和对基质的粘附 |
| 3.4.4 ISG12a抑制体内肿瘤的发生 |
| 3.4.5 ISG12a抑制体内肿瘤的生长和转移 |
| 3.4.6 ISG12a抑制肿瘤干细胞特性(CSC) |
| 3.4.7 ISG12a抑制肿瘤细胞的上皮间质转换(EMT) |
| 3.5 小结 |
| 第4章 ISG12a抑制经典Wnt/β-catenin信号通路及其机理 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞 |
| 4.2.2 材料与试剂 |
| 4.2.3 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 质粒构建 |
| 4.3.3 qRT-PCR |
| 4.3.4 蛋白免疫印迹 |
| 4.3.5 RNA测序 |
| 4.3.6 双荧光素酶报告基因 |
| 4.3.7 细胞质和细胞核蛋白的分离提取 |
| 4.3.8 免疫荧光染色 |
| 4.3.9 蛋白免疫共沉淀(Co-IP) |
| 4.3.10 生物信息学分析 |
| 4.3.11 数据的统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 ISG12a对肿瘤细胞信号通路的影响 |
| 4.4.2 ISG12a抑制经典Wnt/β-catenin信号通路的活化 |
| 4.4.3 ISG12a促进β-catenin蛋白的泛素化降解 |
| 4.4.4 ISG12a维持β-catenin蛋白降解复合物的稳定 |
| 4.4.5 ISG12a抑制Axin蛋白的泛素化降解 |
| 4.4.6 SKP2是降解Axin的E3泛素连接酶 |
| 4.4.7 SKP2和Axin蛋白相互作用的功能区段分析 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 ISG12a通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化所致的PD-L1表达而促进肿瘤免疫 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验细胞 |
| 5.2.2 临床组织样本 |
| 5.2.3 试剂和耗材 |
| 5.2.4 仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 干扰质粒的构建 |
| 5.3.3 启动子质粒的构建 |
| 5.3.4 蛋白免疫印迹 |
| 5.3.5 免疫荧光染色 |
| 5.3.6 qRT-PCR |
| 5.3.7 IHC染色 |
| 5.3.8 RNA测序 |
| 5.3.9 ChIP |
| 5.3.10 双荧光素酶报告基因 |
| 5.3.11 外周血PBMC的分离 |
| 5.3.12 NK细胞的分选 |
| 5.3.13 人肝细胞的分离 |
| 5.3.14 流式细胞术检测细胞表面蛋白 |
| 5.3.15 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 5.3.16 数据的统计分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 ISG12a不影响肿瘤内免疫细胞浸润 |
| 5.4.2 ISG12a促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫 |
| 5.4.3 ISG12a对NK细胞配体和HLA相关分子的表达没有影响 |
| 5.4.4 ISG12a抑制肿瘤细胞免疫检查点PD-L1的表达 |
| 5.4.5 IL-2和IL-18 促进NK细胞PD-1的表达 |
| 5.4.6 ISG12a通过抑制PD-1/PD-L1信号轴而促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫 |
| 5.4.7 β-catenin是PD-L1新的转录因子 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 ISG12a在肿瘤研究中的临床意义 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 临床组织样本 |
| 6.2.2 试剂与材料 |
| 6.2.3 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 蛋白免疫印迹 |
| 6.3.2 qRT-PCR |
| 6.3.3 数据的统计分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 临床肿瘤组织中ISG12a与Axin的表达存在相关性 |
| 6.4.2 癌组织内低表达ISG12a导致临床预后不良 |
| 6.4.3 低表达ISG12a预示肿瘤的恶性进展 |
| 6.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间的主要研究成果 |
| 附录B 用于蛋白免疫印迹immunoblots和qRT-PCR的肝细胞癌和胃癌组织样本的相关临床信息 |
| 致谢 |
（4）GSG2在肝细胞肝癌中的表达及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞肝癌诊断治疗新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
（5）和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究与STAT3在MHV68感染中的作用分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 和厚朴酚简介 |
| 1.2 和厚朴酚的药理学功能 |
| 1.2.1 和厚朴酚的抗炎反应 |
| 1.2.2 和厚朴酚的抗氧化功能 |
| 1.2.3 和厚朴酚的抗癌功能 |
| 1.2.4 和厚朴酚的神经保护作用 |
| 1.2.5 和厚朴酚抗微生物感染 |
| 1.2.6 和厚朴酚的抗病毒功能 |
| 1.3 和厚朴酚与STAT3 信号通路 |
| 1.4 疱疹病毒简介 |
| 1.4.1 单纯疱疹病毒1 |
| 1.4.2 卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒 |
| 1.4.3 小鼠疱疹病毒68 |
| 1.4.4 疱疹病毒感染的治疗方法 |
| 1.5 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 细胞株与毒株 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 毒株 |
| 2.2 主要器材和商业化试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 普通试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 病毒学操作技术 |
| 2.3.2 细胞支原体检测和清除 |
| 2.3.3 TCID50 测定病毒滴度 |
| 2.3.4 蛋白质样品检测 |
| 2.3.5 细胞全RNA的抽提和反转录 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR |
| 2.3.7 蛋白与免疫荧光半定量分析 |
| 2.3.8 CCK8 细胞活力检测 |
| 2.3.9 数据统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 和厚朴酚能够抑制I型单纯疱疹病毒感染 |
| 3.2 和厚朴酚能够抑制HSV-1的DNA复制和基因表达 |
| 3.3 和厚朴酚对HSV-1 病毒入侵没有影响 |
| 3.4 和厚朴酚抑制HSV-1 病毒的产生 |
| 3.5 和厚朴酚能够增强阿昔洛韦的抗病毒作用 |
| 3.6 和厚朴酚可以抑制卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒的感染 |
| 3.7 和厚朴酚抑制小鼠疱疹病毒68 的感染 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 疱疹病毒感染与治疗 |
| 4.2 和厚朴酚抗疱疹病毒感染 |
| 4.3 和厚朴酚抗病毒研究的不足之处 |
| 4.4 和厚朴酚抗病毒研究展望 |
| 第五章 结论 |
| 第二部分 STAT3在MHV68 感染中的作用分析 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 信号转导和转录激活因子(STATs) |
| 1.2 信号转导和转录激活因子3(STAT3) |
| 1.2.1 STAT3 简介 |
| 1.2.2 STAT3 的结构 |
| 1.2.3 STAT3 信号通路以及调控 |
| 1.2.4 STAT3 的生物学功能 |
| 1.2.5 开发靶向STAT3 的药物治疗 |
| 1.3 小鼠疱疹病毒 |
| 1.4 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 细胞与毒株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 其他试剂 |
| 2.1.5 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MEF细胞的分离与永生化 |
| 2.2.2 慢病毒转导 |
| 2.2.3 常规微生物操作技术 |
| 2.2.4 常规细胞技术 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 抑制JAK-STAT3 信号通路可以下调MHV68 的从头感染 |
| 3.2 构建稳定表达STAT3和STAT3C的 MEF细胞系 |
| 3.3 过表达STAT3 能增强MHV68 的感染 |
| 3.4 过表达STAT3 能够上调MHV68 基因的表达 |
| 3.5 过表达STAT3 促进MHV68 重激活 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 STAT3 的激活可以促进MHV68 感染 |
| 4.2 STAT3 过表达会促进MHV68 重激活 |
| 4.3 MHV68 感染不会导致STAT3 持续性激活 |
| 4.4 MHV68 感染与STAT3 的关系研究展望 |
| 第五章 结论 |
| 附录Ⅰ 引物列表 |
| 附录Ⅱ 缩略词表 |
| 参考文献 |
| 专业综述:中草药活性成分和厚朴酚研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）宿主因子对丙型肝炎病毒复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HCV |
| 1.1.1 HCV的结构 |
| 1.1.2 HCV基因型及分布 |
| 1.1.3 HCV致病性及治疗 |
| 1.1.4 HCV基因组 |
| 1.1.5 HCV复制周期 |
| 1.2 天然免疫系统及EPSTI1简介 |
| 1.2.1 HCV感染激活天然免疫 |
| 1.2.2 HCV逃避天然免疫 |
| 1.2.3 天然免疫系统对HCV复制的影响 |
| 1.2.4 EPSTI1的发现及鉴定 |
| 1.2.5 EPSTI1的结构及功能 |
| 1.3 泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system) |
| 1.3.1 泛素化 |
| 1.3.2 泛素蛋白酶体降解 |
| 1.3.3 泛素蛋白酶体降解对HCV复制的影响及研究进展 |
| 1.4 SPSB(SPRY domain-containing SOCS box)家族蛋白结构及功能简介 |
| 1.4.1 SPSB家族蛋白结构 |
| 1.4.2 SPSB家族蛋白的功能研究进展 |
| 1.5 ASB(ankyrin repeat-containing SOCS box)家族成员ASB9结构及功能简介 |
| 1.5.1 ASB家族简介 |
| 1.5.2 ASB9的结构和功能 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 EPSTI1抑制HCV复制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及试剂 |
| 2.2.1 细胞系及培养试剂 |
| 2.2.2 病毒 |
| 2.2.3 RNA提取、c DNA制备及荧光定量PCR试剂 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳试剂 |
| 2.2.5 分子克隆载体及试剂 |
| 2.2.6 转染试剂 |
| 2.2.7 SDS-PAGE和Western Blot试剂 |
| 2.2.8 抗体及其他试剂 |
| 2.2.9 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养及冻存 |
| 2.3.2 细胞总RNA提取、c DNA制备及荧光定量PCR |
| 2.3.3 病毒感染 |
| 2.3.4 EPSTI1重组质粒构建 |
| 2.3.5 转染 |
| 2.3.6 过表达稳定细胞系构建 |
| 2.3.7 稳定干扰细胞系构建 |
| 2.3.8 SDS-PAGE及Western Blot |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肝癌细胞系Huh7中EPSTI1 m RNA主要以转录剪接体 2(V2)存在 |
| 2.4.2 HCV感染诱导EPSTI1表达 |
| 2.4.3 过表达EPSTI1抑制HCV的复制 |
| 2.4.4 下调EPSTI1促进HCV复制 |
| 2.4.5 EPSTI1抗病毒发生阶段研究 |
| 2.5 实验讨论 |
| 第三章 SPSB2抑制HCV复制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 病毒 |
| 3.2.2 细胞系及培养试剂 |
| 3.2.3 克隆载体及试剂 |
| 3.2.4 转染试剂 |
| 3.2.5 RNA提取、c DNA制备及荧光定量PCR试剂 |
| 3.2.6 免疫沉淀及Western Blot相关试剂 |
| 3.2.7 间接免疫荧光试剂 |
| 3.2.8 抗体和其他试剂 |
| 3.2.9 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 病毒感染 |
| 3.3.3 RNA提取、c DNA合成及荧光定量PCR |
| 3.3.4 重组质粒构建 |
| 3.3.5 转染 |
| 3.3.6 免疫共沉淀 |
| 3.3.7 间接免疫荧光及共定位 |
| 3.3.8 SDS-PAGE及Western Blot |
| 3.4 实验结果及分析 |
| 3.4.1 HCV感染对SPSB家族基因的转录表达调控 |
| 3.4.2 过表达SPSB家族蛋白对HCV复制的影响 |
| 3.4.3 SPSB2抑制HCV复制 |
| 3.4.4 SPSB2与HCV蛋白E1和NS5A相互作用 |
| 3.4.5 SPSB2 SPRY结构域的C端介导SPSB2与HCV E1以及NS5A的相互作用 |
| 3.4.6 E1 C端 94-160aa、NS5A Domain I与SPSB2相互作用 |
| 3.4.7 SPSB2诱导NS5A泛素化及蛋白酶体降解 |
| 3.5 实验讨论 |
| 第四章 ASB9抑制HCV复制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及试剂 |
| 4.2.1 病毒 |
| 4.2.2 细胞系及培养试剂 |
| 4.2.3 克隆载体及试剂 |
| 4.2.4 转染试剂 |
| 4.2.5 RNA提取、c DNA制备及荧光定量PCR试剂 |
| 4.2.6 免疫沉淀及Western Blot相关试剂 |
| 4.2.7 间接免疫荧光试剂 |
| 4.2.8 抗体和其他试剂 |
| 4.2.9 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 转染 |
| 4.3.3 感染 |
| 4.3.4 RNA提取、c DNA合成及荧光定量PCR |
| 4.3.5 重组质粒构建 |
| 4.3.6 免疫共沉淀 |
| 4.3.7 间接免疫荧光及共定位 |
| 4.3.8 SDS-PAGE及Western Blot |
| 4.4 实验结果及分析 |
| 4.4.1 ASB9与HCV NS5A相互作用 |
| 4.4.2 NS5A的Domain I负责与ASB9相互作用 |
| 4.4.3 ASB9的第一个ANK序列负责与NS5A相互作用 |
| 4.4.4 ASB9通过蛋白酶体途径降解NS5A |
| 4.4.5 ASB9抑制HCV复制 |
| 4.5 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表及待发表论文 |
| 致谢 |
（7）NLRX1和Sam68调控丙型肝炎病毒复制机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 先天免疫应答概述 |
| 1.1.1 TLR受体 |
| 1.1.2 TLR信号传导通路 |
| 1.1.3 RLR受体 |
| 1.1.4 RLR信号传导通路 |
| 1.1.5 其他受体 |
| 1.1.6 HCV相关先天免疫反应 |
| 1.2 先天免疫调控因子 |
| 1.2.1 泛素化修饰 |
| 1.2.2 宿主蛋白对先天免疫的调控 |
| 1.2.3 病毒对先天免疫应答的调控 |
| 1.3 NLRX1 蛋白 |
| 1.4 PCBP2 蛋白 |
| 1.5 丙型肝炎病毒 |
| 1.5.1 丙型肝炎病毒简介 |
| 1.5.2 丙型肝炎病毒结构 |
| 1.5.3 丙型肝炎病毒研究进展 |
| 1.6 Sam68 蛋白 |
| 1.7 本课题设计思路 |
| 第2章 NLRX1 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 质粒构建 |
| 2.3.2 质粒的转染 |
| 2.3.3 细胞内总RNA的提取 |
| 2.3.4 逆转录PCR |
| 2.3.5 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 2.3.6 细胞培养 |
| 2.3.7 细胞总蛋白的提取 |
| 2.3.8 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.9 免疫荧光试验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 HCV诱导NLRX1 表达 |
| 2.4.2 NLRX1 促进HCV复制 |
| 2.4.3 NLRX1 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 2.4.4 NLRX1 抑制RNA病毒诱导的先天免疫应答 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 NLRX1 促进MAVS发生K48 位依赖的泛素化降解 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质免疫共沉淀 |
| 3.3.2 免疫印迹实验步骤 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 HCV促进NLRX1与MAVS相互作用 |
| 3.4.2 NLRX1 促进MAVS降解依赖于蛋白酶体途径 |
| 3.4.3 NLRX1 促进MAVS发生K48 依赖的多聚泛素化降解 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 NLRX1 利用PCBP2 降解MAVS |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒构建 |
| 4.3.2 免疫印迹实验步骤 |
| 4.3.3 免疫共沉淀实验步骤 |
| 4.3.4 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 NLRX1与PCBP2 相互作用 |
| 4.4.2 PCBP2 促进NLRX1 介导的MAVS泛素化降解 |
| 4.4.3 HCV促进PCBP2 降解MAVS |
| 4.5 小结 |
| 第5章 NLRX1 利用PCBP2 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 PCBP2 抑制HCV诱导的先天免疫应答 |
| 5.4.2 NLRX1与PCBP2 互助负调控HCV诱导的免疫印应答 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 Sam68 促进HCV复制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 质粒构建 |
| 6.3.2 免疫印迹实验 |
| 6.3.3 免疫共沉淀实验步骤 |
| 6.3.4 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 6.3.5 免疫荧光实验 |
| 6.3.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 6.3.7 体外转录(Ambion) |
| 6.3.8 电穿孔法转染RNA |
| 6.3.9 细胞质与细胞核分离实验 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 Sam68 升高HCV蛋白水平 |
| 6.4.2 Sam68 促进HCV复制 |
| 6.4.3 HCV诱导Sam68 由细胞核移位至细胞质 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 Sam68 结合于HCV的5’非编码区第2 个茎环结构 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.2.1 材料与试剂 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 质粒构建 |
| 7.3.2 免疫印迹实验 |
| 7.3.3 实时定量PCR(SYBR Green) |
| 7.3.4 RNA免疫共沉淀实验 |
| 7.3.5 蛋白质原核表达纯化 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 Sam68 直接结合HCV基因组RNA |
| 7.4.2 Sam68 结合于HCV5'-UTR |
| 7.4.3 Sam68 结合HCV5′-UTR茎环结构2(SL2) |
| 7.4.4 Sam68的1至157 氨基酸结合于HCV基因组并促进病毒复制 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（8）miR-141调控丙型肝炎病毒感染肝癌细胞的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 全文缩略语 |
| 第一部分 miR-141对HCV进入宿主细胞的调节机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 临床标本收集 |
| 2.3.3 病毒制备 |
| 2.3.4 病毒感染 |
| 2.3.5 TRIzol法提取总RNA |
| 2.3.6 荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction) |
| 2.3.7 Western Blot检测蛋白表达 |
| 2.3.8 免疫荧光 |
| 2.3.9 HCV进入试验 |
| 2.3.10 细胞共培养试验 |
| 2.3.11 小干扰RNA转染 |
| 2.3.12 质粒转染和双荧光素酶报告基因试验 |
| 2.3.13 实验数据的统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 miR-141 抑制HCV进入宿主细胞 |
| 3.2 HCV进入因子EphA2是miR-141 的直接靶基因 |
| 3.3 敲低EphA2 明显抑制HCV进入宿主细胞 |
| 3.4 Dasatinib处理明显抑制HCV进入宿主细胞 |
| 3.5 miR-141 抑制HCV进入相关的膜受体的共定位 |
| 3.6 miR-141 抑制HCV病毒在细胞-细胞间的传播 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 miR-141调节干扰素信号通路的抗病毒效应 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验步骤 |
| 2.2.1 病毒感染 |
| 2.2.2 TRIREAGENT?BD法提取血浆RNA |
| 2.2.3 qRT-PCR引物设计 |
| 2.2.3 非变性凝胶电泳(Native-PAGE) |
| 2.2.4 小干扰RNA转染 |
| 2.2.5 质粒构建和双荧光素酶报告基因检测试验 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 miR-141在HCV感染的过程中表达下调 |
| 3.2 miR-141 通过增强IFNβ 信号通路抑制HCV的感染 |
| 3.3 敲低miR-141 的表达抑制了IFNβ 信号通路 |
| 3.4 TLR8 可能是miR-141 增强IFNβ 信号通路的靶点 |
| 3.5 miR-141主要是通过增加TLR8 的表达从而发挥抗病毒作用 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 miR-141对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的调节机制研究 |
| 附录二 攻读博士期间工作总结 |
| 附录三 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）PTPRD基因调控PI3K-Akt-mTOR途径影响人肝癌细胞增殖和迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 主要中英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 PTPRD基因在人正常肝细胞和肝癌细胞中的表达 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 RT-PCR检测PTPRD基因在L02, HepG2和HuH-7细胞中mRNA水平的表达 |
| 2.4 Western blot检测PTPRD基因在L02, HepG2和HuH-7细胞中蛋白水平的表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PTPRD基因对人肝癌细胞增殖和迁移的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 MTT实验检测细胞增殖能力 |
| 2.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 PTPRD基因对人肝癌细胞中PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot检测各组细胞Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR蛋白的表达情况 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述1 |
| 参考文献 |
| 综述2 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
四、丙型肝炎病毒蛋白对细胞信号转导通路的影响及其与肝癌发生的关系（论文参考文献）
- [1]10-羟基癸烯酸诱导肝癌细胞凋亡、周期阻滞及迁移抑制的分子机制[D]. 鞠雪莹. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [2]免疫球蛋白和补体在HBV相关肝病中的差异及与肝癌临床病理特征相关性研究[D]. 陈椿. 右江民族医学院, 2021(01)
- [3]ISG12a通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤免疫机制[D]. 邓日林. 湖南大学, 2020(02)
- [4]GSG2在肝细胞肝癌中的表达及其调控机制研究[D]. 王好好. 郑州大学, 2020(02)
- [5]和厚朴酚抗疱疹病毒的作用机制研究与STAT3在MHV68感染中的作用分析[D]. 李龙. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [6]宿主因子对丙型肝炎病毒复制的影响[D]. 王明珍. 武汉大学, 2019(07)
- [7]NLRX1和Sam68调控丙型肝炎病毒复制机制研究[D]. 覃煜雯. 湖南大学, 2019(07)
- [8]miR-141调控丙型肝炎病毒感染肝癌细胞的机制研究[D]. 赵艳. 华中科技大学, 2019
- [9]PTPRD基因调控PI3K-Akt-mTOR途径影响人肝癌细胞增殖和迁移的机制研究[D]. 田婧. 广西医科大学, 2019(08)
- [10]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
标签：肝癌论文; 肿瘤论文; 肿瘤细胞论文; 肿瘤异质性论文; β-catenin论文;