一、禽流感病毒核蛋白研究进展（论文文献综述）
孙兰[1]（2020）在《H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用》文中提出H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）自首次分离至今,已在全世界各地造成了广泛的传播。在国内,H9N2亚型AIV呈地方性流行且传播范围广,不但给养殖业造成巨大的经济损失,也给公共卫生安全造成潜在的威胁。在免疫压力和抗原漂移作用下,AIV容易发生抗原变异,最终导致免疫失败。因此研发针对H9N2亚型AIV较为理想的单抗对H9亚型AIV监测和诊断有重要的意义。1.H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达选取 H9N2 AIV 流行株 A/Chicken/Taixing/10/2010（简称 rTX）和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（简称F98）作为研究对象,通过PCR分别扩增其HA基因和NP基因,将其克隆到真核表达载体PCAGGS上,成功构建出重组质粒PCAGGS-rTX-HA、PCAGGS-F98-HA 和 PCAGGS-rTX-NP。然后将其转染入 293T 细胞,通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和蛋白印迹试验（Western blot,WB）检测确定HA和NP蛋白均在体外正确表达,成功制备出用于制备单克隆抗体的免疫原。此外,通过将PCAGGS-rTX-NP进行双酶切获得的NP片段连接pET-32a上,构建原核重组质粒pET32a-rTX-NP,利用Roestta（DE3）进行优化表达,获得分子量约为73 KD的可溶性rNP,以作为下一步制备针对rTX毒株NP蛋白单克隆抗体的筛选原。2.H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用将重组质粒PCAGGS-rTX-HA和PCAGGS-F98-HA通过肌肉注射结合基因导入仪刺激的方式免疫6-8周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射灭活病毒进行加强免疫,3天后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验和IFA对融合孔进行筛选,经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,其中有4株为针对rTX HA蛋白的单抗,分别命名为1B9、1C10、3E2和2D6;有2株为针对F98 HA蛋白的单抗,分别命名为1B2和1F10。抗体亚类鉴定结果显示,1B9、1C10和3E2的亚类均为IgM,2D6的亚类为IgG2a,1B2和1F10的亚类为IgG1;6株单抗腹水HI效价较高,均在210-215之间;IFA检测结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98产生特异性荧光,其余的单抗对毒株rTX产生特异性荧光;Western-blot试验结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98有特异性反应,其余的单抗都对毒株rTX有特异性反应,条带大小均为75KD;中和试验结果显示,单抗2D6、1B2和1F10都具有中和特性,其中1F10的中和效价最高;单抗特异性和广谱性鉴定结果显示,6株抗HA蛋白单抗只与H9亚型AIV有反应,而与其他亚型AIV和NDV无反应性,表明具有良好的特异性,其中有4株单抗对H9N2 AIV的反应谱较好;6株单抗对2017-2019年实验室分离株HI和IFA检测结果显示,有37.1%（10/27）的H9N2 AIV分离株与4株抗Y280-like代表株HA蛋白的单抗所识别的表位存在抗原差异性,有22.26%（6/27）的H9N2 AIV分离株获得了与抗F98毒株HA蛋白单抗识别表位类似的抗原位点。因此,这些单抗可用于流行株的抗原差异性分析,且近3年的流行株已发生了较大的抗原变异。3.H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备和鉴定将重组质粒PCAGGS-rTX-NP免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。细胞融合10 d后,通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和EFA筛选阳性杂交瘤细胞。经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,分别命名为1B4、1E50、2E10、3A9、8F10和3E6。抗体亚类鉴定结果显示,2E10、3A9和1B4的亚类均为IgG2a,1E50的亚类为IgG1,3E6和8F10的亚类为IgM;采用ELISA试验对单抗腹水效价进行检测,效价在1:25600-1:204800之间;IFA试验结果表明6株单抗中只有3E6和8F10与rTX毒株有特异性的荧光反应;特异性试验结果表明单抗3E6、8F10、2E10和1B4这4株单抗不与NDV和IBV发生反应,具有良好的的特异性,单抗3A9和1E50的特异性不佳;广谱性鉴定结果表明单抗3E6、8F10和2E10的广谱性较好,除了不与H5N1亚型发生反应,与H9N2、H5N6和H7亚型的AIV都有很好的反应,而单抗1B4、3A9和1E50广谱性较差,只与部分H9N2亚型AIV和毒株W1-8（H7亚型）反应。综上所述,单抗3E6、8F10和2E10综合特性较好,在AIV流行病学调查等方面有一定的应用价值。
李卫鹏[2]（2020）在《黄芩苷对小鼠感染H6N6禽流感的治疗效果》文中认为目的:H6N6亚型禽流感病毒具有跨越物种屏障感染哺乳动物的能力,并对人类健康构成潜在威胁。本研究用不同浓度黄芩苷对感染鸭源H6N6亚型AIV的小鼠进行治疗,探究黄芩苷对H6N6亚型禽流感患鼠血液常规指标、组织病理损伤、组织病毒含量、组织中肥大细胞（MC）数量及脱颗粒情况、主要炎性因子等多方面的影响,为黄芩苷治疗低致病性禽流感提供理论依据。方法:通过鸡胚培养试验和血凝试验（HA）筛选出抗H6N6亚型禽流感病毒效果最佳中药。选用6-8周龄小鼠108只,随机平均分为阴性对照组、病毒阳性组、低、中、高黄芩苷治疗组和西药对照组,尾静脉攻毒(0.2 m L·只-1),阴性组注射（灭菌生理盐水）。攻毒3 d后灌胃给药,黄芩苷治疗组(0.014,0.028,0.056mg·只-1·d-1),西药对照组(0.39 mg·只-1·d-1),病毒阳性组、阴性对照组（灭菌生理盐水）,分别于治疗后3 d、6 d、9 d（各组每次采取6只小鼠）采用颈静脉放血法处死,采集样品。血液分析仪检测血常规;ELISA方法检测血清中炎性因子含量;HA检测肺脏组织匀浆血凝滴度;肺脏、气管、脾脏制作石蜡组织切片,HE染色观察各组织病理损伤、TB染色观察各组织MC,实时荧光定量PC R测量组织中病毒含量。结果:（1）黄芩汤剂在鸡胚中抗病毒效果最佳（2）治疗3 d、6 d、9 d时高剂量黄芩苷组白细胞总数、中性粒细胞数目均极显着低于病毒阳性组（P<0.01）;（3）治疗3 d、6 d和9 d时高剂量黄芩苷组淋巴细胞数目和淋巴细胞百分比均极显着高于病毒阳性组（P<0.01）,与西药对照组差异不显着（P>0.05）;（4）治疗9 d时,所有剂量黄芩苷组红细胞数目均极显着高于病毒阳性组（P<0.01）;在治疗3 d、6 d和9 d时,所有黄芩苷治疗组血红蛋白浓度和平均红细胞血红蛋白含量均极显着高于病毒阳性组（P<0.01）,与阴性对照组和西药对照组差异不显着（P>0.05）;（5）在治疗3 d、6 d和9 d时所有黄芩苷治疗组血小板数目均极显着低于病毒阳性组（P<0.01）;（6）治疗3 d时,高剂量黄芩苷组肺脏系数显着低于病毒阳性组（P<0.05）;（7）治疗3 d时,高剂量黄芩苷组肺脏病理评分显着低于病毒阳性组（P<0.05）,治疗6 d、9 d时,高剂量黄芩苷组肺脏病理评分均极显着低于病毒阳性组（P<0.01）;（8）治疗3 d、6 d、9 d时,高剂量黄芩苷组血凝滴度均极显着低于病毒阳性组（P<0.01）;（9）治疗3 d、6 d和9 d时,高剂量黄芩苷治疗组肺脏组织病毒含量显着低于病毒阳性组（P<0.05）,与西药对照组差异不显着（P>0.05）,治疗9 d时,中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组肺脏组织病毒含量显着低于病毒阳性组（P<0.05）,气管、脾脏组织中各试验组病毒含量差异不显着（P>0.05）;（10）治疗9 d时,低剂量黄芩苷组肺脏MC数显着低于病毒阳性组（P<0.05）,治疗6 d和9 d时,中剂量黄芩苷组和高剂量黄芩苷组肥大细胞脱颗粒率均显着低于病毒阳性组（P<0.05）;（11）治疗6 d和9 d时,低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组小鼠血清中IL-1含量均极显着低于病毒阳性组（P<0.01）;（12）治疗3 d、6 d、9 d时各浓度黄芩苷组与病毒阳性组血清中IL-2含量差异不显着（P>0.05）;（13）治疗3 d、6 d、9 d时低、中、高剂量黄芩苷组血清中TNF-α含量均极显着低于病毒阳性组（P<0.01）;（14）结果显示治疗3 d、6 d、9 d时,中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组血清中IFN-γ含量极显着高于病毒阳性组（P<0.01）,（15）治疗6 d和9 d时,低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组血清中5-HT含量均极显着低于病毒阳性组（P<0.01）,中、高剂量黄芩苷组均与西药对照组差异不显着（P>0.05）。全文总结:黄芩苷在对H6N6禽流感病毒引起的炎症中,具有降低病毒在肺脏中的复制,具有降低白细胞总数、抑制出血反应、抑制肺脏中MC脱颗粒反应,调节血清中细胞因子（IL-1、TNF-α、IFN-γ和5-HT）含量,减轻患鼠肺脏组织的病理损伤的作用。
李如梦[3]（2020）在《基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究》文中认为2013年,H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现,迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰。截至2020年3月1日,实验室确诊人感染H7N9禽流感病毒共有1568例病例,其中616人死亡,病死率约为40%。另外,根据世界动物卫生组织（World Orgnization For Animal Health,OIE）的报告,截至2018年3月,在中国家禽中已报告11起高致病性H7N9亚型禽流感暴发,导致将近100万只家禽被扑杀。因此,H7N9亚型禽流感是对公共卫生和家禽养殖的重大威胁。接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产,具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外,灭活疫苗只能诱导抗体免疫,而不能诱导细胞免疫。因此,需要利用新的技术研发一种安全高效的H7N9禽流感疫苗,以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒,可模拟病毒粒子的天然结构,能激活细胞免疫反应和体液免疫反应,诱导的免疫保护更为全面。另外,利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产流感VLP疫苗,而且它由于不依赖鸡胚生产,保证了禽流感大流行时疫苗的充足供应,且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞悬浮培养平台,采用两种策略构建了表达H7N9禽流感病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）和基质蛋白（Matrix,M1）的VLP候选疫苗株。两种策略产生的候选VLP疫苗的抗原产量较高、免疫原性好、保护效力强,与商品化H7N9灭活疫苗的表现相当,为H7N9禽流感的防控提供了新的选择。1.基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究选取了一株 H7N9 亚型高致病性禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD1 5/2016（GD15）作为目的基因的供体。分别将 GD15 的 HA、NA、M1基因克隆在pVL1393载体上,通过与线性化的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（AcMNPV）基因组DNA共转染产生了三个重组杆状病毒（rBac-HA-GD15、rBac-NA-GD15、rBac-M1-GD15）。利用IFA方法能检测到外源蛋白的表达。将三个重组杆状病毒以MOI为1:1:1的比例共感染Sf9细胞。通过透射电镜可观察到直径80-120 nm、内部无遗传物质且与流感病毒结构相似的颗粒形成,即为H7N9 VLP（命名为VLP-1）。将VLP经超滤管浓缩后再经30-60%蔗糖密度梯度超速离心进行纯化,其血凝（HA）效价达到11 log2。分别收获超滤浓缩的VLP与超速离心纯化的VLP制备疫苗,同时以单独表达HA蛋白的重组杆状病毒rBac-HA-GD15制备的灭活疫苗为对照。疫苗经肌肉注射方式接种4周龄的SPF鸡,免疫后第3周各疫苗都能诱导产生抗体应答,平均血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）抗体滴度在6 log2以上;与对照组相比,各疫苗免疫鸡的血清中均能检测到中和抗体,纯化VLP-1组平均滴度能达到260;各疫苗组IgY抗体滴度均在2560以上,这些结果显示了 VLP-1疫苗具有较强的免疫原性。其中15 μg免疫剂量比7.5 μg免疫剂量能诱导更高的HI抗体水平。免疫3周后,用GD15毒株以106.0 EID50的剂量通过滴鼻点眼的方式攻毒。未免疫组在攻毒后出现严重的临床症状,且5天内全部死亡。所有疫苗免疫鸡在攻毒后14天内均未出现症状且未发生死亡,说明H7N9 VLP-1疫苗可提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,疫苗免疫后最高仅有30%的鸡能检测到排毒,且排毒量较低,其中纯化VLP-1组仅在攻毒后第3天能检测到排毒。组织病理学实验显示,VLP-1疫苗以15 μg剂量免疫时,H7N9病毒感染造成的肺脏病变明显较轻。以上结果说明,通过单独表达HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒共感染Sf9细胞可成功组装H7N9 VLP,且VLP-1疫苗能够诱导产生较强的抗体反应,能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护且显着抑制排毒。2.基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究将H7N9 GD15毒株的HA、NA和M1基因串联并克隆至穿梭载体中（pVL1393-NA-M1-HA）。将重组穿梭质粒与线性化的AcMNPV基因组DNA共转染Sf9细胞进行VLP的组装。利用IFA方法鉴定了 HA、NA与M1蛋白的表达,并用透射电镜观察到直径约为100 nm的流感病毒样颗粒,说明重组杆状病毒拯救成功且能够组装成H7N9VLP（命名为VLP-2）。重组杆状病毒接种Sf9细胞制备VLP,用超滤结合超速离心方法浓缩VLP,浓缩后VLP的HA效价显着提高（6 log2至11 1og2）。用两种构建策略制备的VLP疫苗（VLP-1与VLP-2）与商品化重组禽流感病毒H5+H7三价灭活疫苗进行动物的免疫与攻毒实验。VLP疫苗以15μg剂量肌肉注射4周龄的SPF鸡,第3周平均HI抗体滴度在6 log2以上,商品疫苗和VLP-1疫苗诱导的最高HI抗体均能达到10 log2以上。疫苗免疫血清与2013-2018年H7N9野毒株均具有良好的交叉反应性。各疫苗均能诱导中和抗体反应,但是VLP疫苗诱导的中和抗体比商品疫苗诱导的抗体略低。各疫苗均能诱导很高的IgY抗体水平（2560-5120）,且VLP疫苗与灭活疫苗之间无显着差异。其中,VLP-2与VLP-1都以15 μg剂量免疫时,VLP-1疫苗诱导的抗体水平更高。免疫后第3周用高致病性H7N9禽流感病毒GD15株以106.0 EID50的剂量进行攻毒。临床观察14天内,各疫苗免疫组均未出现明显的临床症状且未发生死亡,说明VLP疫苗与商品疫苗均能提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测,结果显示50%的商品疫苗免疫鸡能检测到排毒,两个VLP疫苗免疫鸡的排毒率分别为30%与40%,与商品化疫苗相比无显着差异。VLP疫苗与商品疫苗免疫鸡的脏器中均未检测到病毒,说明它们均能有效抑制病毒复制。以上结果说明,基于HA、NA、M1基因串联表达策略组装的H7N9 VLP疫苗能够在SPF鸡中诱导较强的抗体免疫应答,且能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护并显着抑制排毒及病毒在体内的复制,其免疫原性与保护效力与杆状病毒共感染组装的VLP-1疫苗及商品疫苗相当。
李云燕[4]（2020）在《广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立》文中指出禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正粘病毒科,A型流感病毒属。H9亚型AIV感染通常会使家禽表现出产蛋量下降、生长缓慢及呼吸道症状,严重危害家禽产业的健康发展。该亚型病毒不仅能感染家禽和鸟类,也能直接感染人类,还能为新的感染人的重组病毒如H5N6、H7N9、和H10N8等提供部分或全部内部基因,严重危害人类公共卫生安全。广西地理位置特殊,加强该地区H9亚型AIV生态进化的研究对禽流感的有效防控具有重要意义为了解广西地区野鸟源H9亚型AIV遗传进化情况,本研究对2017-2019年间从不同活禽市场采集的斑鸠、鸽子和山鸡等野鸟咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离和纯化,用RT-PCR方法扩增分离株全基因并克隆测序,同时对测序结果进行遗传进化分析。结果表明成功分离鉴定出15株H9亚型AIV,均符合低致病性禽流感的分子特征,遗传进化分析发现其全基因来源较为复杂,一共出现3种不同的基因组合形式。为了建立快速检测不同亚型禽流感病毒方法,本研究利用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法快速、敏感和成本低的优点,从NCBI下载不同HA和NA基因序列,利用Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/）在线软件设计多对HA（H9和H5）和NA（N2）LAMP特异性引物,同时又设计了四组使用不同荧光标记的探针（HA-H9-探针和NA-N2-探针组合,HA-H9-探针和HA-H5-探针组合）,成功建立了快速检测H9和N2亚型AIV和区分H9、H5亚型AIV的二重荧光RT-LAMP检测方法。
侯力嘉[5]（2020）在《基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究》文中研究指明禽流感（avian influenza,AI）主要是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种全身性或呼吸器官性传染疾病,其中高致病性禽流感具有致死率高、传播范围广等特点。目前,国际检验兽疫局（OIE）已将禽流感定为A类传染病,我国也将其列为一类动物疫病。禽流感属人畜共患病,它一旦爆发不仅给禽类养殖业用户带来巨大的经济损失,同时还会给公共卫生事业造成严重威胁,目前我国把对禽流感防控作为重要的任务。如何防控禽流感是一个长期而艰巨的任务,控制禽流感不仅需要将患者进行隔离,而且需要对动物进行早期的检测,做到及时切断动物方面的传播途径。目前,对于禽流感病毒的主要检测技术有禽流感病毒的分离与检测、血凝-血凝聚合酶抑制（HA-HI）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）和免疫胶体金等。禽流感病毒的检测以及分离诊断相对比较准确,但是操作繁琐且比较耗时,不利于快速的检测;HA-HI试验对环境比较敏感,外界的条件会对检测结果产生影响;ELISA试验由于步骤简便,有利于大量病毒样品的分析检测,但其需反复洗涤,耗时且检测灵敏度有限;PCR这种方法虽然具有能够直接检出禽流感病毒的基因的功能,且检测灵敏度相对较高,但检测成本以及技术要求比较高,只适用于检测机构和实验室诊断,不适合现场快速诊断;针对于胶体金检测鉴定技术,目前已有相关产品被开发,但其检测灵敏度不高,产品质量不一,只能定性,不能定量,只能用于疫病的辅助检测。因此,针对于目前禽流感检测方法的一些局限性,探索一种高效、特异、准确、简便的检测手段对于禽流感的及时防控具有十分重要的意义。而现有的血清学检测方法主要基于抗原抗体的反应,目前国内禽流感病毒抗体产品质量参差不齐,国外已有比较成熟的商品化抗体,但价格十分昂贵。因此,制备高效价、特异性强、低成本的禽流感病毒单克隆抗体可为禽流感的检测鉴定与及时防控提供有效试剂。快速、低成本免疫检测对全球健康有重要意义,传统的免疫检测方法因过程繁琐等问题,无法于现场快速完成。而利用交流动电富集蛋白并基于阻抗免疫传感的方法操作简单,可将传统的ELISA的检验时间从数个小时缩短到1分钟之内,同时还具有非常低的检出限。该技术主要利用交流动电效应加快微粒操控芯片表面抗原抗体特异性结合,此时阻抗免疫传感器可实时监测芯片表面因抗原抗体结合所引起双电层厚度的变化从而判定阴阳性结果。该方法具有低成本、高灵敏度、覆盖面广等优点,有望用于临床疾病的即时检测（Point-of-care testing,POCT）。目前国外有文献报道将该技术用于双酚A（BPA）,寨卡病毒RNA、革兰氏阴性菌、人体D-Dimer等的检测,均取得了理想的实验结果。前期本实验室已成功将该项技术应用于禽类新城疫病毒和布鲁氏菌病抗体的检测。而该技术应用于禽流感的检测尚未见报道。本研究拟采用原核表达系统制备H9N2 AIV血凝素（HA）蛋白,用HA蛋白作为免疫原对BALB/c小鼠进行了免疫,利用PEG1500细胞融合技术制备HA单克隆抗体。此外,以所制备的HA抗原、抗体作为禽流感诊断试剂原料,将制备的HA抗体加入经臭氧处理后的微电极芯片表面,臭氧处理可实现芯片表面改性过程,使得芯片电极表面形成大量羟基（-OH）从而增加芯片电极表面的亲水性,有利于抗体与之固定结合。另外,芯片表面从纳米尺度上可观察到起伏不平的表面,这也增加了抗体包被于芯片电极表面的面积。再对未结合位点进行封闭处理以减少非特异性结合,从而制得用于禽流感抗原检测的微电极芯片,将芯片与阻抗仪连接即可监测芯片表面免疫反应情况,初步建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感器相结合的禽流感抗原检测方法,并对方法进行评价,为禽流感的现场即时诊断提供了一种新的检测技术。本文的研究内容如下:（1）为了实现H9N2 AIV HA蛋白在原核表达系统中进行高效表达,根据GenBank发布的A/chicken/Gansu/2/99（H9N2）HA（ID=EF070733.1）基因序列,优化该密码子,化学方法合成HA全基因,并在合成HA基因的5’段和3’段分别重新设计酶切位点NcoI和酶切位点XhoI,使用DNA Ligation Kit将该HA片段连接转化到质粒载体pET28a（+）中,以构建重组质粒pET28a（+）-HA。再将pET28a（+）-HA重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态的细胞中,为了表达出大量的HA重组蛋白,对于诱导基因表达中各项的条件（包括温度、时间、诱导剂浓度）进行了优化。然后利用镍柱（His-tag）对HA重组蛋白进行分离纯化,纯化后的HA重组蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及蛋白印迹实验（Western-blot）对其进行初步的纯度和特异性分析;经二喹啉甲酸（BCA）法对HA重组蛋白进行浓度的测定。（2）将上述方法制备的H9N2 AIV HA蛋白对BALB/c小鼠进行常规免疫,取免疫后的小鼠血清通过ELISA检测的方法进行抗体效价的测定,取抗体效价达到融合要求的小鼠,分离小鼠脾脏并制成脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）通过PEG1500进行细胞融合;建立间接酶联免疫吸附法（ELISA）,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体,采用有限稀释法对阳性克隆细胞进行亚克隆,并从中筛选出可稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,将其扩大培养后取适量细胞注射至BALB/c小鼠的腹腔内以形成腹水,收集小鼠腹水并使用Protein A柱对其纯化,将纯化后的抗体进行生物特性（包括纯度、浓度、效价、特异性）鉴定。（3）建立并优化交流动电阻抗传感检测方法,并应用于禽流感病毒的检测。首先对芯片表面微电极清洗条件进行优化,然后对芯片进行臭氧化处理使表面带有亲水性的-OH等基团而利于禽流感抗体的固定,然后将纯化所得抗H9N2 AIV HA单抗包被于芯片表面并对抗体修饰芯片的浓度及时间进行优化,然后优化封闭时间后将芯片连接于阻抗仪检测禽流感抗原,并对阻抗仪检测电压及电流参数进行优化以获得最适用于检测禽流感抗原的条件。最后分别从其灵敏度、特异性、重复性对实验方法效果进行初步的评价。结果:（1）成功构建基因工程菌株pET28a（+）-HA/BL21（DE3）,筛选得出了该基因工程菌最优蛋白表达条件,在30℃、IPTG添加终浓度为0.8mmol/L持续诱导6h,HA重组蛋白的表达量最大;经镍柱亲和层析纯化后的HA蛋白纯度较高,达到了电泳纯,此外经过Western-blot鉴定,63KD处存在与其预期蛋白大小完全相符的条带,表明HA蛋白得到成功表达。（2）在制备H9N2 AIV HA单抗的过程中,共进行了两次细胞融合试验,两次的融合率分别为86.7%与94.4%。初次检测阳性率分别为33.5%和86.75%。在对融合后的杂交瘤细胞株进行多次克隆化反复筛选后总共成功获得了3株能持续地分泌抗体的单克隆株,分别为1F10E7,2D10D10,5A10C3;亚型鉴定结果显示3株抗体亚型均为IgG1型;将1F10E7细胞扩大培养后注入BALB/c小鼠的腹腔制备小鼠腹水型单抗,收集小鼠腹水用ProteinA柱抗体进行腹水型抗体的纯化,SDS-PAGE电泳鉴定结果显示纯化后抗体达到了电泳纯,且经BCA法浓度测定其浓度可达到2.518mg/ml,制备所得HA单抗经Western-blot鉴定后证实能与H9N2 AIV HA抗原以及H9N2标准病毒特异性结合,而与NDV的F蛋白无反应,说明制备的HA单抗具有较好的特异性。（3）在建立并优化禽流感抗原的检测方法过程中,确定了最佳芯片清洗方法为异丙醇、无水乙醇、超纯水依次超声清洗10min;最优抗体修饰芯片条件为加入10μg/mL的HA单抗于37℃的恒温箱中连续孵育3h;然后加入封闭液1%superblock 25℃封闭30min;阻抗仪最佳电压及电流设置为100mV、100kHZ。包被HA单抗分别检测0.1、1.0、10、100、1000ng/mL重组HA抗原稀释液,结果表明该方法用于检测禽流感抗原最低可以检测到10ng/mL的HA抗原,此时检测结果较为稳定。芯片包被HA单抗后检测经荧光逆转录PCR（reversetran scription-PCR,RT-PCR）鉴定的H9N2阴阳性禽咽拭子样品,共检测12支阳性样品（每支样品平行检测3份）、6支阴性样品,此外还检测了4支新城疫病毒尿囊液样品,其中每支样品平行检测3份。与传统的荧光RT-PCR检测的方法结果相比,其检测结果的灵敏度（检出特异阳性率）的灵敏度可达97.2%,检测特异性（检出特异阴性率）的灵敏度可达96.7%,且这种新的检测方法与其他常见禽类的病毒样品检测无任何交叉性反应,检测的结果表明该方法具备有较的特异性和较好的可重复性。该检测方法有望在未来成为便携式的诊断技术,将包被于HA单抗的微粒操控芯片经保护剂处理后进行真空保存,检测时仅需连接靠一部比手机略大的阻抗仪设备,就可实现现场1分钟检测并立即报告检测结果。结论:本研究成功构建了H9N2 AIV HA蛋白基因工程菌pET28a（+）-HA/BL21（DE3）,并通过研究筛选出HA蛋白的最佳蛋白表达条件,实现了HA蛋白在大肠杆菌中高效表达;对HA蛋白进一步的纯化后作为免疫原对小鼠进行常规免疫,经过细胞融合及亚克隆细胞筛选后,共筛选到3株具有持续分泌抗H9N2 AIV HA抗体能力的单克隆细胞株;将制备的抗原、抗体作为试剂原料,用于建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感技术相结合的禽流感快速诊断方法,通过对该方法进行优化与评价后,证明该方法具有较高的灵敏度、特异性,且重复性良好,可用于禽流感的现场快速检测,为禽流感的及时防控提供了一种新的检测技术。
李俊鑫[6]（2019）在《中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究》文中研究说明H7N9禽流感病毒是一种甲型流感病毒,可以通过禽类感染人。人感染H7N9禽流感是一种急性呼吸道传染病,可以迅速发展为重症肺炎和急性呼吸窘迫综合征,死亡率高达40%,至今仍然缺乏有效的药物和疫苗。目前,高致病性H7N9禽流感病毒的出现已经对家禽养殖业、畜牧业以及人类健康构成严重的威胁,亟需卫生部门采取有效的控制措施。全人源单克隆抗体能够中和和清除禽流感病毒,在防治禽流感上具有显着的疗效,因此,快速筛选靶向病毒保守中和表位的人源抗体对控制H7N9禽流感疫情具有重大意义。在本研究中,我们利用单个记忆B细胞PCR技术和微量中和H7N9病毒实验,两周内快速地从康复病人的可转化记忆B细胞（switched memory B cells）中鉴定和克隆全人源单克隆抗体3L11和5J13,并分别研究两种全新的人源抗体的抗病毒机制。3L11抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由罕见的VH1-8*01/D2-15*01/JH5*02和VL2-13*01/JL3*02家族基因组成,而且分别带有8.87%和5.55%的体细胞突变,使3L11抗体能够结合H7N9病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）,亲和力KD为5.32×10-9M。我们构建的稳转CHO细胞能够生产250.12mg/L的3L11,抗体纯度达99%。在体外,3L11能够广谱中和A/Anhui/1/2013（AH1）、A/Shanghai/2/2013（SH2）、A/Shenzhen/Th004/2017（SZ4）、A/Shanghai/1/2013（SH1）等H7N9禽流感病毒,也可以介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）清除感染病毒的细胞。对3L11的H7N9逃逸病毒株测序发现,病毒的HA蛋白发生了G151R(Gly151→Arg151)和S152P(Ser152→Pro152)的氨基酸替换,这表明3L11的中和表位是在HA头部受体结合位点（receptor binding site,RBS）附近的抗原位点A（RRSGSS）。而且通过序列比对的结果发现,流行的H7N9野生型病毒都没有这两个氨基酸突变。因此,3L11有极大潜力能够中和所有出现过的H7N9流行毒株。更重要的是,无论是预防实验还是治疗实验,3L11都可以完全地保护小鼠免受H7N9病毒的致命攻击。5J13抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由VH3-30*03/D2-2*01/JH6*02和Vκ4-1*01/Jκ4*01组成,并且分别带有15.25%和4.42%的体细胞突变。5J13特异地高亲和力结合H7N9病毒的HA蛋白,KD值为1.95×10-10M。稳转5J13抗体基因的CHO细胞能够生产84.48mg/L的5J13,抗体纯度达99%。在体外,5J13能够抑制病毒的血凝作用和膜融合作用,从而高效地中和了H7N9病毒;在体内,5J13能够预防和治疗致命的H7N9病毒感染小鼠。更重要的是,通过氢氘交换质谱、逃逸病毒株测序和竞争结合实验等结果发现,5J13的表位在HA蛋白头部RBS的对面,是一个之前国内外从未报道过的全新的中和表位,其中一个氨基酸E89K(Glu89→Lys89)的突变能够导致5J13失去结合病毒的活性。我们把这个全新的中和表位命名为抗原位点J。综上所述,本项研究工作证明了记忆B细胞PCR技术快速鉴定、克隆抗流感病毒人源抗体的可行性,对迅速控制严峻的特别是未来新出现的流感疫情具有重大的指导意义。我们获得了两个新的中和H7N9病毒的人源抗体,为预防和治疗H7N9禽流感提供了优质的候选抗体药物。另外,两个人源抗体的抗病毒机制以及全新中和表位的发现,将有力地促进通用型禽流感疫苗及广谱性中和抗体的研究和发展。
高原[7]（2019）在《辽宁地区猪流感血清流行病学调查》文中进行了进一步梳理猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的猪的一种急性、高度接触性呼吸道疾病,在全世界范围内普遍存在。在自然条件下,猪对人流感病毒和禽流感病毒具有双重易感性,同时还具有将SIV传给人类和禽类的能力,因此,猪是流感病毒基因重组和新抗原亚型毒株产生的“孵育器”,SIV在整个流感病毒的生态分布和遗传进化中起着非常重要的作用,对全球范围内的畜牧养殖经济和人类公共卫生具有深远影响。为了掌握辽宁省SIV感染情况,确定辽宁省内SIV的主要流行毒株,本研究对辽宁省辖区内五个地区共14个市的规模场、屠宰场、散养户开展随机采样,在2016年1月至2018年12月间共采集4800份未免疫过流感疫苗的猪血清样品,应用HI检测方法,以EAH1N1、H1N1pdm09、H3N2、H5和H7五种抗原对所有猪血清样品进行血清学抗体检测并对检测数据进行了分析。本研究结果显示,在4800份血清样品中,抗体阳性样品总数为2145份,总抗体阳性率达44.69%。其中甲型H1N1pdm09亚型SIV抗体阳性样品数为1886份,按照年份分析,20162018三年的阳性率分别为37.1%、41.37%和39.76%,平均阳性率39.29%,差异不显着;按照季度分析,四个季度的阳性率分别为44.54%、38.57%、28.57%和47.46%,其中第一、四季度的阳性率相对较高,第三季度最低;按照地区分析,辽东地区抗体阳性率最高为44.65%,辽中地区最低为29.28%,辽宁省所辖14个市的抗体阳性率为22.42%53.46%,其中沈阳、本溪、丹东、盘锦、葫芦岛等市SIV抗体阳性率相对较高,均超过45%。类禽型H1N1亚型SIV抗体阳性样品总计259份,20162018三年的抗体阳性率分别为1.24%、8.15%和7.86%,平均阳性率为5.4%,其中2017和2018年较2016年有所增加。四个季度的阳性率分别为8.16%、2.54%、5.32%和5.98%,其中第一季度相对较高;辽宁五个区域的抗体阳性率在3.84%6.97%之间,其中辽南和辽北地区猪群抗体阳性率最高,辽东地区最低,但地区阳性率总体差异不显着;辽宁各市抗体阳性率为1.21%12.73%,其中,大连的抗体阳性率最高,为12.73%,鞍山、抚顺和营口的抗体阳性率相对较低,均低于2%。此外4800份样品中有71份样品H1N1pdm09亚型SIV抗体与类禽型H1N1亚型SIV抗体均为阳性,阳性率为3.46%,表明辽宁地区猪场存在一定程度的不同亚型SIV混合感染的情况。在4800份样品中,H3N2亚型SIV阳性数为21,抗体阳性率为0.44%,检出率较低。同时,所有样品中没有检出H5和H7抗体,抗体阳性率为0。本研究通过采集辽宁地区规模场、屠宰场、散养户未免疫SIV疫苗的猪血清样品开展SIV抗体检测,建立了辽宁省SIV的监测网络,掌握了辽宁省SIV感染情况及流行毒株亚型,为有针对性的制定辽宁地区SIV的防控措施提供理论依据,对最大限度地降低SIV流行威胁,提高我省生猪的生产率,预防人类感染具有重要临床指导意义。
张婷钰[8]（2019）在《2017-2018年我国H9N2亚型禽流感流行病学调查及疫苗候选株的筛选》文中提出H9N2亚型禽流感病毒自1994年在我国广东地区首次分离以来,流行范围逐渐扩大,是目前在我国养殖场广泛存在的主要低致病性禽流感亚型,家禽单独感染该病毒后无明显临床症状,但当混合感染时极易引起鸡群的发病和死亡,给养鸡业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是有效防控H9N2亚型禽流感的主要策略之一,目前国内比较常见的 H9N2 疫苗株有 A/chicken/Shanghai/F/98,A/Chicken/Beijing/1/94 以及A/chicken/Guangxi/55/2005等,但疫苗的广泛使用加速了禽流感病毒的重组和变异。近年来感染H9N2亚型禽流感的家禽数量不断增加,因此对H9N2亚型禽流感进行流行病学调查,通过血清学方法筛选出交叉保护性好的疫苗候选株意义重大。本研究对江苏某公司养鸡厂区2017-2018年H9N2亚型禽流感流行情况进行流行病学调查和毒株分离鉴定。针对其中17株代表株进行了抗原性分析,并筛选出交叉保护性较好的疫苗候选株进行免疫效果评估。本研究对2017年12月-2018年10月江苏某公司及徐州、潍坊、阜阳、泰安、洛阳、合肥等地分公司养殖户病死鸡肝脏、肺脏、气管及拭子共948份样品进行病毒的分离鉴定,经血清学试验初步鉴定,共鉴定出234份H9亚型禽流感病毒阳性样品,阳性率为24.68%。研究结果显示,阳性样品的分离率随季节变化呈现出一定的趋势,其中冬季的分离率最高,夏季的分离率最低。选取2017-2018年分离的51株H9N2代表株进行HA基因测序,运用DNA Star和MEGA 7.0生物学软件拼接比对HA基因测序结果并绘制HA基因遗传进化树,结果显示本研究的51株禽流感病毒均属于h9.4.2.5分支,与目前疫苗株存在一定的差异,位于不同的分支中,提示2017年-2018年所分离的H9N2禽流感病毒在疫苗免疫的压力下,其HA基因发生了较大的遗传变异。本研究进一步对17株H9N2亚型禽流感病毒进行抗原性分析和交叉保护性分析,结果表明,A/chicken/Fuyang/32/2017 和 A/chicken/Xuzhou/76/2017 毒株与同一小分支内其它毒株抗原性差异较大,提示 A/chicken/Fuyang/32/2017 和A/chicken/Xuzhou/76/2017毒株的HA基因的抗原决定区某些氨基酸可发生了重要变异。根据交叉血凝抑制试验的结果,筛选出交叉保护性较好的A/chicken/Changzhou/443/2017 毒株进行免疫效果评估,结果显示,A/chicken/Changzhou/443/2017株灭活疫苗免疫后可产生较高的抗体水平,同时可有效抵御同源和异源H9N2亚型病毒的攻击。因此综合抗体水平和免疫保护效率两方面因素,可将A/chicken/Changzhou/443/2017（H9N2）毒株作为疫苗候选株使用。
陆勤勤[9]（2019）在《2018年我国部分地区H9N2禽流感流行病学调查及HA基因遗传进化分析》文中研究指明H9N2亚型禽流感是一种低致病性禽流感,具有流行时间长、传播范围广、感染宿主种类多等特点。自我国在1992年首次分离到该病毒以来,在数十年间已经传播至我国大部分地区。H9N2亚型禽流感病毒主要危害各种禽类,我国家禽养殖数量庞大,该病毒在我国的流行对家禽养殖业造成了严重的经济损失。H9N2也被证实具有感染人类的能力,这对人类的身体健康和公共卫生安全也造成很大威胁。值得注意的是,H5N1、H7N9等亚型禽流感病毒形成或与H9N2的传播密切相关,有研究表明H7N9有6个基因片段来自H9N2,因此H9N2在重0组过程中作为基因供体对新亚型毒株的出现起着关键作用。本文对我国部分地区H9N2亚型禽流感进行流行病学调查,并对相关毒株进行进化树构建,对H9亚型HA基因进行遗传亲缘关系鉴定,为更好防控禽流感的发生提供应用基础研究。试验一 2018年我国部分地区H9N2亚型禽流感流行病学调查2018年上半年（3-5月）和下半年（10-12月）分别进行了两次流行病学调查。上半年在我国11个省份67个场点,随机采集4792份咽喉/泄殖腔拭子样品,检测出H9N2亚型阳性样品1208份,样品总阳性率为25.21%（1208/4792）,场点总阳性率为80.60%（54/67）。另外,检测出鸡阳性样品1090份,鸭阳性样品86份,鹅阳性样品2份,鸽阳性样品30份,各宿主样品阳性率分别为29.18%（1090/3736）、12.23%（86/703）、1.53%（2/131）、13.51%（30/222）。2018年下半年,检测出H9N2亚型阳性样品995份,样品总阳性率为24.14%（995/4122）,在68个场点中51个为阳性,场点总阳性率为75.00%（51/68）。另外,检测出鸡阳性样品813份,鸭阳性样品100份,鹅阳性样品6份,鸽阳性样品76份,各宿主样品阳性率分别为 25.89%（813/3140）、16.23%（100/616）、10.34%（6/58）、25.50%（76/298）。通过淘宝网从13省（直辖市）购买的220只家禽中,未检测出禽流感病毒。试验二2008-2018年H9N2亚型禽流感流行病学统计分析本文对2008至2018年间的H9N2亚型禽流感的流行病学结果进行统计,在十年间采集上海、江苏、湖北、广东、黑龙江、云南、西藏等多个地区的来自各大养殖场、市场、屠宰场以及散养农户家禽的咽肛拭子样品和血清样品以及环境样品,共计采样22次,样品总数为122611份。结果显示:①从2008上半年至2018下半年,H9N2亚型禽流感检测的总体样品阳性率从0.47%增加至24.14%,总体样品阳性率增加了 51.36倍,表明2008年至2018年间H9N2的感染情况总体呈上升趋势,相应的,省份阳性率从2008年的25%到2018年的90%,增加了 3.6倍,此外,总场点阳性率也从2008年的3.33%增加到2018年的75%,增加了 22.52倍,可以说近十年来H9N2亚型禽流感在我国的增殖和扩散速度十分迅猛;②我们通过分析场点阳性率的分布,发现所有场点几乎都呈现H9N2亚型禽流感阳性,覆盖范围十分广泛,其中值得注意的是不论是活禽批发市场还是活禽零售市场,其阳性率均显着高于其他场点,并且近年来有逐渐升高的趋势,批发市场与零售市场相比,2016年之前零售市场的样品阳性率较高,2016年之后批发市场的阳性率开始显着升高;③本研究通过分析H9N2亚型禽流感病毒在各宿主体内的阳性率分布情况,发现鸡在所有宿主中阳性率常年处于较高水平,此外,水禽和鸽子的感染率在2017年之后出现了幅度较大的增高趋势,并在2018年下半年达到历史最高值。试验三 2008-2018年H9亚型HA基因遗传进化分析本次研究共计获得6771条H9亚型HA基因序列,利用MEGA软件对序列进行比对和遗传进化分析,结果显示2008-2018年间检测出h9.4.2.6分支129条,h9.4.2.5分支6610条,h9.4.2.4分支9条,h9.4.1.2分支20条,以及h9.3.3.2分支3条。在h9.4.2.5分支中,鸡、鸭、鹅、鸽、野鸟均出现阳性,其中以鸡的阳性率最高,占总数的88.31%（5837/6610）,说明h9.4.2.5分支可能对鸡有亲嗜性。随着时间的推移,H9N2病毒也在不断地进化,进化树的发展趋势表明2013-2018年分离的毒株与2008-2012年分离的毒株相比产生了较大的差异,这意味着,近年来流行分支虽没有改变,但其内部毒株之间仍然不断发生着重组和变异,随着遗传距离的加大,未来很可能出现新的分支取代 h9.4.2.5。
张萌[10]（2018）在《《猪流感》（节选）翻译报告》文中认为中国是世界第一大市场和第二大重要经济体,农业科技活动发展迅速,介绍和翻译国内外先进的兽医学成果和知识符合中国经济发展需求。笔者选择《猪流感》作为翻译实践材料,一方面,此类翻译贴合社会实用价值,有助于农民和科研工作者了解国外先进的兽医发展动态;另一方面,在一定程度上可以丰富对兽医翻译的研究,对探讨和丰富翻译理论和翻译策略都有一定的实际意义。该翻译实践的指导理论是交际翻译。交际翻译注重交际效果,强调读者反应。该理论指出,应尽可能使译文读者与源文读者获取相似的阅读反应（原传道2005）。源文本的文本类型属于纽马克（2001）所归类的信息型文本,可用交际翻译指导。该文本的主要目标读者是兽医专业的学生,可能在理解诸多专业词汇,长难句和名词化结构等方面存在问题。故笔者尽力提供自然简洁的译文,以符合他们的阅读习惯。本翻译实践报告旨在研究如何在交际翻译框架下完成《猪流感》翻译实践,主要探讨了五个部分。第一部分描述了翻译任务。第二部分阐释了翻译准备工作,介绍了医学英语翻译现状以及交际翻译。第三部分是最重要的一部分,该部分列举了笔者在翻译过程中所遇到的翻译困难,并探讨了用交际翻译以及各种翻译策略解决这些困难。针对专业词汇翻译,笔者采用了直译的翻译策略,以追求交际效果。针对长难句的翻译,在交际翻译的指导下,笔者追求译文的自然和简洁,针对不同长难句,分别采用顺译法,逆译法和拆译法。为了保证目标读者很好的理解译文,在语篇层面上着重解决语篇衔接和连贯问题。第四部分是导师以及目标读者所给的指导性意见。在最后一部分,笔者对本次翻译任务做了系统性总结,反思了任务成果及不足之处,指出了亟待解决的问题。笔者希望本翻译报告能为兽医英语翻译研究提供一定的帮助。
二、禽流感病毒核蛋白研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽流感病毒核蛋白研究进展（论文提纲范文）
（1）H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: 禽流感病毒及其单克隆抗体制备的研究进展 |
| 1 禽流感病毒的分子生物学特性 |
| 2 H9N2亚型禽流感的流行情况 |
| 3 禽流感主要检测方法 |
| 4 单克隆抗体技术 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（2）黄芩苷对小鼠感染H6N6禽流感的治疗效果（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略 |
| 文献综述 |
| 1 禽流感概述 |
| 1.1 禽流感病毒的分类和命名 |
| 1.2 禽流感病毒的结构 |
| 1.3 H6N6亚型禽流感病毒的起源及流行情况 |
| 1.4 H6N6亚型禽流感病毒跨种属感染哺乳动物 |
| 2 禽流感与免疫相关 |
| 2.1 禽流感病毒感染机制 |
| 2.2 禽流感致炎作用 |
| 2.3 肥大细胞(Mast Cell,MC) |
| 2.4 白细胞介素1(IL-1) |
| 2.5 白细胞介素2(IL-2) |
| 2.6 肿瘤坏死因子α(TNF-α) |
| 2.7 干扰素γ(IFN-γ) |
| 2.8 五羟色胺(5-HT) |
| 3.黄芩苷药理作用 |
| 3.1 黄芩苷抗病毒作用 |
| 3.2 黄芩苷抗炎作用 |
| 4 目的与意义 |
| 试验研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物与病毒 |
| 1.2 主要药物与试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 目的基因扩增 |
| 2.1.1 病毒总RNA提取及鉴定 |
| 2.1.2 cDNA第一条链合成 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 RT-PCR扩增 |
| 2.1.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2 目的基因克隆和鉴定 |
| 2.2.1 RT-PCR产物的纯化 |
| 2.2.2 RT-PCR产物的连接与转化 |
| 2.2.3 阳性质粒的提取 |
| 2.2.4 重组质粒的PCR鉴定及测序 |
| 2.3 抗病毒中药的筛选 |
| 2.3.1 中药汤剂的熬制 |
| 2.3.2 中药汤剂在鸡胚中抗H6N6亚型AIV试验 |
| 2.4 黄芩苷对感染H6N6禽流感小鼠治疗效果 |
| 2.4.1 实验动物分组 |
| 2.4.2 攻毒检测与治疗 |
| 2.4.2.1 攻毒 |
| 2.4.2.2 攻毒检测 |
| 2.4.2.3 治疗 |
| 2.5 血液指标的测定 |
| 2.6 病理观察 |
| 2.6.1 临床病理观察 |
| 2.6.2 解剖病理观察 |
| 2.6.3 组织病理观察 |
| 2.6.3.1 组织切片制作 |
| 2.6.3.2 肺脏病理学评分 |
| 2.7 肺脏组织匀浆HA |
| 2.8 肺、气管、脾组织病毒含量检测 |
| 2.8.1 实时荧光定量PCR(RT-q PCR)标准曲线建立 |
| 2.8.2 治疗后肺、气管、脾组织病毒含量检测 |
| 2.8.2.1 治疗后肺、气管、脾组织总RNA提取 |
| 2.8.2.2 cDNA第一条链合成 |
| 2.8.3 病毒的定量检测 |
| 2.9 组织MC观察 |
| 2.9.1 TB染色切片制作 |
| 2.9.2 MC计数 |
| 2.9.3 MC脱颗率的计算 |
| 2.10 主要炎性因子的检测 |
| 2.11 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 N6基因的克隆与制粒的鉴定 |
| 3.2 鸡胚内各组中药抗H6N6亚型禽流感病毒试验结果 |
| 3.3 血液常规指标的测定 |
| 3.3.1 白细胞总数指标 |
| 3.3.2 中性粒细胞指标 |
| 3.3.3 淋巴细胞指标 |
| 3.3.4 红细胞指标 |
| 3.3.5 血小板指标 |
| 3.4 病理变化 |
| 3.4.1 临床病理观察 |
| 3.4.2 解剖病理观察 |
| 3.4.3 组织病理观察 |
| 3.4.4 肺脏系数 |
| 3.4.5 肺脏评分结果 |
| 3.5 肺脏组织匀浆病毒滴度结果 |
| 3.6 肺、气管、脾脏中病毒含量结果 |
| 3.6.1 实时荧光定量PCR(RT-q PCR)标准曲线 |
| 3.6.2 敏感性与重复性实验 |
| 3.6.3 病毒在肺组织的复制情况 |
| 3.6.4 病毒在气管组织的复制情况 |
| 3.6.5 病毒在脾组织的复制情况 |
| 3.7 MC的观察 |
| 3.7.1 肺脏MC计数 |
| 3.7.2 肺脏MC脱颗粒率 |
| 3.8 炎性细胞结果 |
| 3.8.1 IL-1结果 |
| 3.8.2 IL-2结果 |
| 3.8.3 TNF-α结果 |
| 3.8.4 IFN-γ结果 |
| 3.8.5 5-HT的结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 黄芩具有较佳的抗流感效果 |
| 4.2 黄芩苷对患鼠血液指标的影响 |
| 4.2.1 黄芩苷可抑制患鼠的白细胞总数升高 |
| 4.2.2 黄芩苷可降低患鼠的中性粒细胞数目 |
| 4.2.3 黄芩苷可升高患鼠的淋巴细胞数目 |
| 4.2.4 黄芩苷可以减少患鼠炎症中出血反应 |
| 4.3 黄芩苷能减轻患鼠肺脏损伤 |
| 4.4 黄芩苷有效降低患鼠肺脏中病毒含量 |
| 4.5 黄芩苷能有效抑制患鼠肺组织中MC脱颗粒 |
| 4.6 黄芩苷对H6N6亚型禽流感患鼠部分炎性因子的影响 |
| 4.6.1 黄芩苷有效抑制患鼠IL-1、TNF-α、5-HT升高 |
| 4.6.2 黄芩苷使患鼠IFN-γ升高 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录一 发表文章 |
| 附录二 部分试剂的配置及试验步骤 |
| 附录三 图版 |
| 致谢 |
（3）基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1 H7N9流感病毒的流行现状 |
| 1.1 流行现状 |
| 1.2 基本结构 |
| 2 流感疫苗的研究进展 |
| 2.1 流感病毒疫苗的研究现状 |
| 2.2 通用型流感病毒疫苗的研究 |
| 3 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 3.1 流感VLP疫苗的制备 |
| 3.2 VLP表达系统 |
| 3.3 流感病毒样颗粒疫苗的研究进展及前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、质粒、菌株和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 鸡胚和实验动物 |
| 1.5 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 疫苗的制备 |
| 2.8 攻毒用病毒的准备 |
| 2.9 疫苗免疫实验 |
| 2.10 攻毒保护实验 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 3.4 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.5 H7N9 VLP的HA滴度测定 |
| 3.6 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.7 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株、细胞、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 鸡胚和实验动物 |
| 1.4 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 VLP疫苗的制备 |
| 2.8 疫苗免疫实验 |
| 2.9 攻毒保护实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.4 H7N9 VLP的滴度测定 |
| 3.5 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.6 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 A型流感病毒简介 |
| 1.2 禽流感病毒病原学特征 |
| 1.2.1 病毒形态结构 |
| 1.2.2 禽流感基因编码的蛋白及其功能 |
| 1.2.3 禽流感病毒的抗原漂移和抗原转变 |
| 1.3 H9N2亚型禽流感病毒 |
| 1.3.1 H9N2亚型禽流感病毒在中国的爆发和流行 |
| 1.3.2 H9N2亚型禽流感病毒诊断技术 |
| 1.4 环介导等温核酸扩增检测技术(LAMP)研究进展 |
| 1.4.1 LAMP技术基本原理 |
| 1.4.2 可视化LAMP技术 |
| 1.4.3 与其它技术相结合的LAMP技术 |
| 1.5 本课题研究的意义 |
| 第二章 广西野鸟源H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 鸡胚与标准血清 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 病毒鉴定 |
| 2.2.3 分离株生物学特性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定 |
| 2.3.2 分离株HA和NA基因型鉴定及标准命名 |
| 2.3.3 分离株生物学特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 15株广西野鸟源H9N2亚型禽流感病毒分离株全基因组序列测定及遗传进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分离株RT-PCR全基因组扩增 |
| 3.2.2 RT-PCR扩增产物胶回收与连接转化 |
| 3.2.3 阳性菌液的鉴定与测序 |
| 3.2.4 测序结果分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扩增及序列测定结果 |
| 3.3.2 遗传进化分析结果 |
| 3.3.3 15株野鸟源H9N2亚型AIV分离株基因分型 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 H9和N2 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 标准品的制备 |
| 4.2.3 反应体系的优化 |
| 4.2.4 特异性试验 |
| 4.2.5 干扰性试验 |
| 4.2.6 敏感性试验 |
| 4.2.7 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 反应体系 |
| 4.3.2 结果观察 |
| 4.3.3 特异性试验 |
| 4.3.4 干扰性试验 |
| 4.3.5 敏感性试验 |
| 4.3.6 临床样品检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 H9和H5 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 标准品的制备 |
| 5.2.3 反应体系的优化 |
| 5.2.4 特异性试验 |
| 5.2.5 干扰性试验 |
| 5.2.6 敏感性试验 |
| 5.2.7 临床样品检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 反应体系 |
| 5.3.2 结果观察 |
| 5.3.3 特异性试验 |
| 5.3.4 干扰性试验 |
| 5.3.5 敏感性试验 |
| 5.3.6 临床样品检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（5）基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 禽流感概论 |
| 1.1.1 AIV病原学特点 |
| 1.1.2 致病机制 |
| 1.1.3 H9N2 亚型禽流感流行现状 |
| 1.1.4 禽流感病毒主要外膜蛋白 |
| 1.2 禽流感诊断技术研究进展 |
| 1.2.1 病毒分离鉴定 |
| 1.2.2 血清学鉴定 |
| 1.2.3 分子生物学鉴定 |
| 1.2.4 禽流感生物传感器检测方法进展 |
| 1.3 交流动电效应与阻抗免疫传感技术 |
| 1.3.1 交流动点效应与阻抗免疫传感技术检测特点 |
| 1.3.2 交流动点效应与阻抗免疫传感技术检测原理 |
| 第2章 H9N2 AIV HA蛋白的原核表达及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pET28a(+)-HA重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.1.1 HA序列的分析及合成 |
| 2.2.1.2 pET28a(+)-HA重组质粒的提取 |
| 2.2.1.3 pET28a(+)-HA重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.2.1.4 重组质粒转化及菌种保存 |
| 2.2.2 HA重组蛋白的原核表达与鉴定 |
| 2.2.2.1 HA重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定 |
| 2.2.2.2 HA重组蛋白最佳诱导表达条件的筛选 |
| 2.2.2.3 HA重组蛋白的大量表达 |
| 2.2.2.4 HA重组蛋白的纯化 |
| 2.2.2.5 HA重组蛋白浓度的测定 |
| 2.2.2.6 HA重组蛋白Western-blot检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 pET28a(+)-HA重组质粒的酶切鉴定及测序结果 |
| 2.3.2 HA蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.3.2.1 pET28a(+)-HA/BL21(DE3)重组菌株诱导条件的筛选 |
| 2.3.2.2 HA重组蛋白纯化及浓度测定 |
| 2.3.2.3 纯化后HA重组蛋白Western blot分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 抗禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物及细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫方案 |
| 3.2.2 最佳抗原包被浓度及阴阳性血清稀释度的筛选 |
| 3.2.3 融合前小鼠效价的测定 |
| 3.2.4 小鼠腹腔饲养细胞的制备 |
| 3.2.5 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 的制备 |
| 3.2.6 脾细胞制备 |
| 3.2.7 细胞融合 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.9 阳性杂交瘤细胞的克隆化 |
| 3.2.10 腹水型单抗的制备 |
| 3.2.11 腹水型单抗的纯化 |
| 3.2.12 HA单克隆抗体的生物特性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 抗原最佳包被浓度以及阴阳血清稀释度的确定 |
| 3.3.2 融合前小鼠血清效价ELISA测定结果 |
| 3.3.3 细胞融合结果 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆结果 |
| 3.3.5 HA单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.3.6 单抗的纯化 |
| 3.3.7 单抗纯度鉴定 |
| 3.3.8 单抗浓度测定 |
| 3.3.9 效价测定 |
| 3.3.10 ELISA检测HA单抗与标准的H9N2 病毒反应性 |
| 3.3.11 1F10E7 HA单抗Western-Blot检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 抗原及抗体 |
| 4.1.2 实验主要试剂 |
| 4.1.3 实验主要设备 |
| 4.1.4 主要试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 H9N2 禽流感阴阳性禽咽拭子的鉴定 |
| 4.2.2 开盖芯片及镜检清洗 |
| 4.2.3 活化芯片 |
| 4.2.4 包被及扫频 |
| 4.2.5 封闭过程 |
| 4.2.6 检测及扫频 |
| 4.2.7 交流动电的阻抗免疫传感器检测禽流感的方法优化 |
| 4.2.7.1 芯片清洗方式的优化 |
| 4.2.7.2 抗H9N2 HA单抗浓度以及时间对富集和传感效果的影响 |
| 4.2.7.3 封闭时间对富集和传感效果的影响 |
| 4.2.7.4 交流电频率及电压对富集传感效果的影响 |
| 4.2.8 重复性实验 |
| 4.2.9 特异性实验 |
| 4.2.10 灵敏度实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 H9N2 禽流感阴阳性咽拭子样品的鉴定结果 |
| 4.3.2 交流动电效应与阻抗免疫传感检测方法的优化结果 |
| 4.3.2.1 芯片清洗方式优化结果 |
| 4.3.2.2 包被浓度以及时间的优化结果 |
| 4.3.2.3 封闭时间的优化结果 |
| 4.3.2.4 交流电频率及电压的优化结果 |
| 4.3.3 免疫传感器重复性实验结果 |
| 4.3.4 免疫传感器特异性实验结果 |
| 4.3.5 免疫传感器灵敏度实验（检出限）结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（6）中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 甲型流感病毒 |
| 1.1.1 甲型流感病毒的结构 |
| 1.1.2 血凝素HA |
| 1.1.3 H7N9 禽流感 |
| 1.2 全人源单克隆抗体 |
| 1.2.1 全人源单克隆抗体技术的研究进展 |
| 1.2.2 记忆B细胞PCR技术 |
| 1.3 中和流感病毒的全人源单克隆抗体 |
| 1.3.1 靶向HA杆部的中和抗体 |
| 1.3.2 靶向HA受体结合位点的中和抗体 |
| 1.3.3 靶向HA头部抗原位点A的中和抗体 |
| 1.3.4 没有中和活性的抗流感病毒人源抗体 |
| 1.4 本文选题及研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 伦理声明 |
| 2.2 耗材与试剂 |
| 2.3 病毒 |
| 2.4 重组蛋白的表达和多肽合成 |
| 2.5 稳定表达CD40 配体的细胞系构建 |
| 2.6 康复病人的血液收集 |
| 2.7 酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 2.8 记忆B细胞法制备全人源单克隆抗体 |
| 2.8.1 分选CD19+ IgM–IgA–IgD–B 细胞 |
| 2.8.2 记忆B细胞的激活、分化和培养 |
| 2.9 微量中和实验 |
| 2.10 抗体基因的克隆 |
| 2.11 抗体基因的表达和纯化 |
| 2.12 血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HAI或 HI)实验 |
| 2.12.1 血凝(Hemagglutination,HA)实验 |
| 2.12.2 血凝抑制实验 |
| 2.13 抗体的特异性和亲和力检测 |
| 2.13.1 抗体的特异性结合检测(间接免疫荧光实验,Indirect immunofluorescent assay,IFA;流式细胞技术,Flow Cytometry) |
| 2.13.2 抗体结合抗原的亲和力检测 |
| 2.14 稳转抗体基因细胞株的构建以及抗体生产 |
| 2.14.1 稳转抗体基因细胞株的构建 |
| 2.14.2 抗体生产 |
| 2.15 中和抗体预防和治疗H7N9 病毒感染小鼠 |
| 2.16 ADCC实验 |
| 2.17 利用质谱(mass spectroscopy,MS)技术分析抗体的表位多肽 |
| 2.18 利用氢氘交换质谱(hydrogen deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)分析抗体的抗原表位 |
| 2.19 H7N9 病毒逃逸突变株的筛选 |
| 2.20 膜融合抑制实验 |
| 2.21 统计学分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 记忆B细胞PCR技术筛选中和人源单克隆抗体 |
| 3.1.1 构建稳定表达人CD40L的 NTH-3T3 饲养细胞 |
| 3.1.2 流式分选记忆B细胞 |
| 3.1.3 活化记忆B细胞 |
| 3.1.4 筛选中和H7N9 病毒抗体 |
| 3.1.5 PCR克隆抗体基因 |
| 3.1.6 抗体基因瞬时转染和表达 |
| 3.1.7 抗体基因的稳转株构建和生产 |
| 3.2 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的中和活性 |
| 3.3 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的血凝抑制活性 |
| 3.4 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的特异性结合检测 |
| 3.5 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的亲和力检测 |
| 3.6 人源单克隆抗体预防和治疗H7N9 病毒感染的小鼠 |
| 3.6.1 评估人源抗体预防H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.6.2 评估人源抗体治疗H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.7 人源单克隆抗体的抗原表位鉴定(Epitope mapping) |
| 3.7.1 3L11 抗体的抗原表位鉴定 |
| 3.7.2 5J13 抗体的全新的抗原表位 |
| 3.8 3L11 抗体的保护机制研究 |
| 3.9 5J13 抗体的中和机制研究 |
| 3.9.1 位阻效应的研究 |
| 3.9.2 膜融合抑制作用的研究 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 快速筛选抗禽流感病毒人源抗体及鉴定中和表位 |
| 4.2 记忆B细胞PCR技术是研究流感病毒致病及变异新机制的重要工具 |
| 4.3 人源单克隆抗体3L11 及其保守的表位 |
| 4.4 人源单克隆抗体5J13 及其全新的中和表位 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全人源单克隆抗体3L11 的研究结果 |
| 5.2 全人源单克隆抗体5J13 的研究结果 |
| 5.3 不足及下一步研究计划 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 博士期间发表的论文 |
| 博士期间申请的发明专利 |
（7）辽宁地区猪流感血清流行病学调查（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要英文缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流感病毒研究进展 |
| 1.1 猪流感病毒概述 |
| 1.2 猪流感的流行病学 |
| 1.3 SIV的临床症状及致病性 |
| 1.4 猪流感病毒生物学特性 |
| 1.5 流感病毒的致病机制 |
| 1.6 猪流感的诊断 |
| 1.7 猪流感的防治 |
| 1.8 本研究的意义 |
| 第二章 辽宁地区猪流感血清流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 辽宁地区2016~2018 年甲型H1N1pdm09 亚型SIV抗体检测结果 |
| 2.2 辽宁地区2016~2018 年类禽型H1N1 亚型SIV抗体检测结果 |
| 2.3 辽宁地区H1N1pdm09 亚型SIV与类禽型H1N1 亚型SIV混合感染结果与分析 |
| 2.4 辽宁地区2016~2018 年甲型H3N2 亚型及H5、H7 亚型SIV抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于几种亚型免疫抗体结果的比较讨论 |
| 3.2 关于几种SIV亚型感染的季节特性讨论 |
| 3.3 关于辽宁省内不同亚型SIV感染区域性差异的讨论 |
| 3.4 关于 H5、H7 亚型 IV 检测原因及结果的分析讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）2017-2018年我国H9N2亚型禽流感流行病学调查及疫苗候选株的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 绪论 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 禽流感概述及疫苗研究进展 |
| 1 禽流感概述 |
| 1.1 分类与命名 |
| 1.2 基因结构及其编码蛋白 |
| 1.3 理化特性 |
| 2 H9N2亚型禽流感概述 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 禽流感的诊断方法 |
| 2.3 H9N2亚型禽流感防控措施 |
| 3 禽流感疫苗 |
| 3.1 全病毒灭活苗 |
| 3.2 重组活载体疫苗 |
| 3.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.4 DNA疫苗 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 SPF鸡胚 |
| 1.3 标准抗原及标准阳性血清 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料处理 |
| 2.2 接种鸡胚 |
| 2.3 血凝试验 |
| 2.4 血凝抑制试验(HI) |
| 2.5 RT-PCR |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状与剖检病变 |
| 3.2 病毒的分离与鉴定 |
| 3.3 HA基因进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2疫苗株筛选及免疫效果评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 细胞 |
| 1.4 标准抗原及阳性血清 |
| 1.5 主要试剂 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒纯化 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 H9N2疫苗株的筛选 |
| 2.4 免疫效果评估 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒纯化结果 |
| 3.2 灭活疫苗的制备 |
| 3.3 免疫效果评估 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（9）2018年我国部分地区H9N2禽流感流行病学调查及HA基因遗传进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTARCT |
| 缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 禽流感概述 |
| 1 禽流感的来源和发展历史 |
| 2 禽流感病毒的病原学特征 |
| 2.1 禽流感病毒的理化性质 |
| 2.2 禽流感病毒的基本结构 |
| 2.3 主要蛋白质结构与功能 |
| 3 禽流感病毒的感染机制 |
| 4 禽流感病毒的遗传变异特点 |
| 5 禽流感的流行病学特点 |
| 5.1 传染源 |
| 5.2 传播途径 |
| 5.3 易感动物 |
| 6 禽流感的检测方法 |
| 6.1 免疫学检测技术 |
| 6.2 分子生物学检测技术 |
| 7 禽流感疫苗 |
| 7.1 亚单位疫苗 |
| 7.2 重组活载体疫苗 |
| 7.3 DNA疫苗 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感概述 |
| 1 H9N2的遗传进化和流行情况 |
| 2 H9N2相关疫苗 |
| 3 H9N2研究的目的和意义 |
| 第三章 动物流行病学调查指南 |
| 1 流行病学调查简介 |
| 2 流行病学调查方法 |
| 3 动物疫病流行性病学调查的意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 2018年我国部分地区H9N2亚型禽流感流行病学调查 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验耗材 |
| 1.2 试验所需溶液的配制方法 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 引物设计 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 病毒分离 |
| 2.3 病毒RNA提取 |
| 2.4 一步法RT-PCR扩增HA与NA基因 |
| 2.5 RT-PCR产物实时毛细电泳 |
| 2.6 核苷酸序列测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 采样结果 |
| 3.2 RT-PCR检测结果 |
| 3.3 总体阳性结果 |
| 3.4 省份与阳性率的关系 |
| 3.5 宿主与阳性率的关系 |
| 3.6 场点与阳性率的关系 |
| 4 讨论 |
| 第五章 2008-2018年H9N2亚型禽流感流行病学统计分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计结果 |
| 2.1 采样结果 |
| 2.2 样品阳性结果 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 总体阳性结果分析 |
| 3.2 场点阳性率分布情况 |
| 3.3 批发市场与零售市场的阳性率比较 |
| 3.4 宿主阳性率分布情况 |
| 4 讨论 |
| 第六章 2008-2018年H9亚型HA基因遗传进化分析 |
| 1 试验方法 |
| 1.1 上传序列 |
| 1.2 分离毒株的基因谱系分析 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（10）《猪流感》（节选）翻译报告（论文提纲范文）
| Acknowledgements |
| Abstract |
| 摘要 |
| 1. Task Description |
| 1.1 Brief Description of the Author |
| 1.2 Brief Description of the Source Text |
| 1.3 Stylistic Features of the Source Text |
| 1.4 Significance of the Report |
| 2. Task Preparation |
| 2.1 The Establishment of Term Database |
| 2.2 Translation Tools |
| 2.3 Thesis Schedule |
| 2.4 Previous Researches on Medical English Translation and the Theoretical Basis |
| 2.4.1 Previous Researches on Medical English Translation |
| 2.4.1.1 Previous Researches on Medical English Translation at Home |
| 2.4.1.2 Previous Researches on Medical English Translation Abroad |
| 2.4.1.3 Reflections on the Previous Studies |
| 2.4.2 Theoretical Basis: Communicative Translation |
| 2.4.2.1 A Brief Introduction to Communicative Translation |
| 2.4.2.2 Theoretical Basis for Selecting Communicative Translation |
| 3. Case Analysis |
| 3.1 Translation Difficulties |
| 3.2 Problem Solutions |
| 3.2.1 Lexical Level |
| 3.2.1.1 Technical Terms |
| 3.2.1.2 Abbreviation Words |
| 3.2.2 Syntactic Level |
| 3.2.2.1 Translation of the Nominalization Structure |
| 3.2.2.2 Translation of the Long and Complex Sentences |
| 3.2.3 Discourse Level |
| 3.2.3.1 Coherence |
| 3.2.3.2 Cohesion |
| 3.3 Summary |
| 4. Task Assessment |
| 4.1 From the Supervisor |
| 4.2 From the Target Readers |
| 5. Conclusion |
| 5.1 Lessons Learned from the Translation Practice |
| 5.2 Problems to be Solved |
| 5.3 Suggestions for Further Studies |
| References |
| Appendices |
| Appendix Ⅰ |
| Appendix Ⅱ |
四、禽流感病毒核蛋白研究进展（论文参考文献）
- [1]H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用[D]. 孙兰. 扬州大学, 2020(01)
- [2]黄芩苷对小鼠感染H6N6禽流感的治疗效果[D]. 李卫鹏. 贵州大学, 2020
- [3]基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究[D]. 李如梦. 扬州大学, 2020(04)
- [4]广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立[D]. 李云燕. 广西大学, 2020(02)
- [5]基于交流动电效应与阻抗免疫传感的禽流感快速诊断方法研究[D]. 侯力嘉. 重庆理工大学, 2020(08)
- [6]中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究[D]. 李俊鑫. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2019(02)
- [7]辽宁地区猪流感血清流行病学调查[D]. 高原. 沈阳农业大学, 2019(02)
- [8]2017-2018年我国H9N2亚型禽流感流行病学调查及疫苗候选株的筛选[D]. 张婷钰. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]2018年我国部分地区H9N2禽流感流行病学调查及HA基因遗传进化分析[D]. 陆勤勤. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]《猪流感》（节选）翻译报告[D]. 张萌. 华南农业大学, 2018(08)