一、胞液型磷脂酶A_2cDNA与载体PRCCMV连接及表达（论文文献综述）
陈钊[1]（2021）在《紫花苜蓿响应石墨烯材料的表达谱分析及其分子机制》文中指出随着纳米材料在工、农、医等领域的广泛应用,其必然会通过各种途径进入环境,并进一步通过食物链在高营养水平生物中积累。许多学者发现纳米颗粒能通过增强植物氮代谢、光合作用能力,以及提高肥料养分吸收利用率等途径来达到改善作物生长,提高产量的目的。同时,当纳米粒子大量存在植物体内时,纳米材料对植物也具有毒性效应,影响植物幼苗的萌发,根系、叶片的生长以及作物的生物产量。近些年,日益严重的土地盐碱化对农场品生产和土地植被保护造成了严重的负面影响。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）具有根系发达,抗性强的特性。作为多年生优质牧草,紫花苜蓿常种植于盐碱地。因此,其生长、发育、产量和品质容易受到盐碱胁迫的影响。为此,开展苜蓿、纳米材料及生态环境的交互作用研究具有重要意义。本研究分为两部分进行,第一,以抗性较弱的紫花苜蓿金皇后为试验材料,以适宜浓度石墨烯作为缓解盐、碱胁迫的重要物质拌在基质中培养,用转录组测序方法筛选出在改性石墨烯作用下响应盐、碱胁迫的差异基因,并对其进行GO与KEGG Pathway富集分析,以转录组学为基础,对其生物学功能、涉及到的生化代谢和信号转导等途径方面进行研究,解析石墨烯改善苜蓿耐盐碱能力的分子机理。同时,结合三代全长转录组测序技术（SMRT）提高数据质控质量,获得紫花苜蓿转录本的全长序列以及功能注释,从转录因子以及转录组结构方面入手进行深层次耐盐、碱性相关的研究,从而揭示石墨烯提高紫花苜蓿抗性的适应机制。第二,以金皇后（抗性较弱）和Bara310SC（抗性较强）为试验材料,采用沙土培养法,对比10和20 g kg-1改性石墨烯胁迫下,两个品种叶片代谢物的变化,寻找胁迫环境下差异代谢物（DEMs）含量及代谢通路的变化规律。同时,以代谢组学为出发点,结合2+3代转录组测序结果,筛选出响应石墨烯胁迫的差异表达基因（DEGs）,探讨它们的生物学功能、参与的生化代谢途径和信号传导途径,通过多组学联合分析揭示了紫花苜蓿对石墨烯纳米材料潜在的适应性分子机制。结论如下:（1）本研究发现适宜浓度的改性石墨烯(5 g kg-1)处理可以有效增加幼苗的鲜重和干重,增加叶片叶绿素含量和提高叶片与根抗氧化还原酶活性。由于渗透胁迫作用以及对细胞膜的氧化损伤,与对照组相比,在盐、碱和重度石墨烯胁迫下,紫花苜蓿叶片和根的过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2·-）和丙二醛（MDA）含量升高,叶绿素a、b含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性明显低于对照组。结果还表明,在盐和碱胁迫下,5 g kg-1石墨烯处理对苜蓿生长具有积极作用,例如可以加强叶片的光合作用,改善体内抗氧化系统,促进根对养分的吸收,增加产量等。（2）基于SMRT测序技术,第一部分试验共得到19.4 GB的clean reads,包括265811个CCS（circular consensus）和219162个全长非嵌合序列（FLNC）,并获得12960个非冗余转录本,其中12389个转录本得到注释。RNA-seq分析显示,石墨烯处理组（C1和C2）、石墨烯-盐处理组（S1、S2和S4）和石墨烯-碱处理组（A1、A2和A4）叶片中分别鉴定了930、1114和880个DEGs,其中数百个DEGs参与激素信号传导、光合作用、呼吸和转录调控等途径。值得注意的是,5 g kg-1石墨烯处理后的苜蓿叶片中与抗氧化防御系统和光合作用相关的特异性差异基因表达模式得到改善,并可迅速赋予苜蓿更高的非生物胁迫耐受性。（3）第二部分试验,我们将结合代谢组学与转录组学的数据特点,使用不同抗性紫花苜蓿品种来揭示苜蓿叶片对石墨烯胁迫的响应机制。结果表明,中度和重度石墨烯胁迫(10和20 g kg-1)对叶片氮代谢、抗氧化防御系统和光合作用过程有显着的干扰。对不同抗性紫花苜蓿品种叶片进行超高效液相色谱-质谱（UPLC-ESI-MS/MS）分析,共确定了406种响应石墨烯胁迫的代谢物,其中金皇后在中度和重度胁迫中分别发现62（26种上调,36种下调）和110种（49种上调,61种下调）差异代谢物,Bara310SC则分别鉴定出13（种8种上调,5种下调）和58种（30种上调,28种下调）差异代谢物。转录组数据结果显示共产生250003个FLNC,和65241个非冗余转录本。金皇后和Bara 310SC叶片在中度胁迫下分别得到7583和6163个DEGs,在重度胁迫处理下分别得到9136和9254个DEGs,且两个品种在中度和重度胁迫下共同表达1125个DEGs。代谢组学和转录组学结果表明差异表达代谢物和差异表达基因的数量与石墨烯胁迫程度呈正相关。（4）进一步分析我们发现在石墨烯胁迫(10和20 g kg-1)实验中,两个苜蓿品种会根据其胁迫程度改变自身氨基酸、脂质、次级代谢物（包括有机酸、异黄酮和黄酮）、核苷酸及其衍生物的含量来适应不同程度的石墨烯胁迫;转录组结果表明DEGs参与光合作用、抗氧化还原反应、氨基酸代谢以及蔗糖和淀粉代谢途径。多组学联合分析结果表明,参与氨基酸代谢通路及烟酸和烟酰胺代谢通路的差异基因和差异代谢物在石墨烯胁迫下得到显着富集,说明氨基酸代谢通路及烟酸和烟酰胺代谢途径是苜蓿适应石墨烯胁迫的关键代谢途径。
王钦[2]（2019）在《鲤鱼Group Ⅲ分泌型磷脂酶A2的原核表达及磷脂酶活性测定》文中研究说明Group Ⅲ 分泌型磷脂酶 A2（secretory phospholipase A2 Group Ⅲ,PLA2g3）是能水解磷脂二位酰基（sn-2）释放脂肪酸和溶血磷脂的酶,参与多种炎症反应、神经分泌、细胞增殖和动脉粥样硬化等过程。脊椎动物PLA2g3除具有催化功能区（PBVR）,还包括较长的N-和C-端。目前,对PLA2g3的N-和C-端的酶活性方面研究鲜有报道。鲤鱼作为世界性养殖鱼类,具有重要的研究价值。本文以鲤鱼为研究对象,构建了 PLA2g3的全长、催化功能区、N-和C-端的原核重组表达载体,获得了有活性的可溶性蛋白,测定了原核表达蛋白的磷脂酶活性。原核表达能得到大量的蛋白,从而可以对蛋白进行功能分析,但由于原核细胞缺乏真核蛋白准确折叠所需的酶或辅助因子,因此如何获得可溶重组蛋白是原核表达体系需要解决的瓶颈。通过与标签蛋白融合表达,来筛选能促进目的蛋白可溶性表达的标签蛋白。本实验比较不同标签蛋白对鲤鱼（Cyprinus carpio）Group Ⅲ磷脂酶A2（PLA2g3a1）催化功能区（PBVR）原核重组蛋白的促溶作用,实验结果表明促溶作用最高的是标签蛋白NusA,可溶重组蛋白占总蛋白的95%,其次是MBP和TrxA,分别占87%和47%,兼顾单位菌中重组蛋白表达量,每克菌获得可溶表达重组蛋白最高的是MBP融合蛋白。使用镍柱纯化原核重组表达蛋白,与BSA蛋白标准品电泳比对得到纯化后蛋白的浓度,结果1g总菌获得MBP-PBVR、NusA-PBVR和TrxA-PBVR可溶蛋白分别为0.43 mg、0.38mg、0.21 mg。采用偶联脂氧合酶法测定该蛋白的磷脂酶活性,结果重组原核表达蛋白MBP-PBVR（13.68±0.12 μmol/（min.μmol））的磷脂酶活性显着高于 TrxA-PBVR（0.94±0.01 μmol/（min·μmol））、NusA-PBVR（0.93±0.04 μmol/（min·μmol））,MBP-PBVR酶促反应最适pH为7.5;在鲤鱼适宜生长温度内酶活性没显着差异;微量Ca2+即能显着提高磷脂酶活性,kd为0.0153（mmol/L）-1;MBP-PBVR酶促反应米氏方程的Vm=2.2μmol/L/min,km=31.9（μmol/L）-1。本实验结果表明MBP具有很好的促溶效果,纯化的MBP-PBVR原核表达蛋白具有MBP-PBVR磷脂酶活性。为了探究PLA2g3的N-和C-端对该蛋白的磷脂酶活性影响,本实验构建了 pMAL-c2X-N-PBVR和pMAL-c2X-PBVR-C原核表达载体,获得了可溶的原核重组蛋白,测定了该蛋白的磷脂酶活性。结果显示:1g总菌获得MBP-N-PBVR、MBP-PBVR-C可溶蛋白分别为0.375 mg、0.125 mg。采用偶联脂氧合酶法测定该蛋白的磷脂酶活性,MBP-N-PBVR（4.86±0.06μmol/（min·μmol））磷脂酶活性低于 PBVR（13.68±0.12 μmol/（min·μmol））（P<0.05）,而 MBP-PBVR-C（16.46±0.4μmol/（min·μmol））磷脂酶活性高于PBVR（13.68±0.12μmol/（min·μmol））但不显着（P>0.05）,表明PLA2g3的N-端存在时会降低该蛋白的磷脂酶活性,PLA2g3的C-端存在时不会影响磷脂酶活性。MBP-N-PBVR、MBP-PBVR-C 的酶促反应最适 pH 与 MBP-PBVR 相同,均为 7.5。10mmol/L Ca2+能显着提高MBP-N-PBVR和MBP-PBVR-C磷脂酶活性,这与Ca2+对MBP-PBVR磷脂酶活性促进趋势不同,显示出N-和C-端存在时会延缓Ca2+激活磷脂酶活性。本实验结果表明PLA2g3的N-端存在时会降低该蛋白的磷脂酶活性和延缓Ca2+激活作用,C-端存在时不会影响磷脂酶活性,但会延缓Ca2+激活磷脂酶活性。
王曼[3]（2019）在《H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究》文中进行了进一步梳理原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）作为精子和卵子的祖细胞,对物种的延续和繁衍具有重要作用,并且PGCs为发育生物学研究、移植治疗、转基因动物生产等方面提供了巨大的便利。然而,如何迅速有效地获取大量PGCs来满足研究和生产实际的需要,是突显在人们面前的问题。为此,研究者们致力于体外诱导分化为PGCs的研究,试图使得PGCs能源源不断地通过体外分化产生,但由于PGCs诱导分化效率低,诱导细胞技术体系不成熟,难以获得大量PGCs,其关键在于不完全清楚哪些因素能影响PGCs的形成,所以亟需建立健全PGCs发生的具体机制。长期以来,人们对PGCs形成的具体调控机制的研究主要局限于遗传学因素包括信号通路和关键基因的研究上,然而随着理论发展和技术手段的不断深入,研究人员更加清晰地认识到生殖干细胞发育过程是一个极其精密而复杂的调控过程,除了遗传学因素,研究者们还发现PGCs的形成离不开细胞特异性的组蛋白甲基化修饰。所以,从表观遗传修饰的角度探索组蛋白甲基化如何联系遗传学参与PGCs命运决定过程,将有助于人们更加全面地揭示PGCs的发生。为此,本研究基于本课题组前期对鸡胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESCs）、PGCs和精原干细胞（Spermatogonial stem cel1s,SSCs）三种细胞进行的全基因组RNA-seq和H3K4me2的ChIP-seq结果,以调控PGCs形成的关键信号通路和组蛋白H3K4me2修饰为切入点,对RNA-seq筛选的候选信号通路和ChIP-seq富集的关键信号通路进行联合分析,从中筛选出参与PGCs形成的关键信号通路—Wnt信号。利用分子生物学方法探索组蛋白甲基化修饰如何协同信号通路调节PGCs形成相关基因表达进而影响PGCs形成。该研究为弄清PGCs形成的机制提供理论依据,并为后续深入研究其表观遗传调控机制奠定基础。研究结果如下:（1）H3K4me2 通过 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2 信号链调控 PGCs 形成的研究对 ESCs、PGCs和SSCs三种细胞的RNA-seq和ChIP-seq结果进行联合分析,确认PGCs发生过程中受H3K4me2调控的关键信号通路—Wnt信号通路及其关键信号分子Wnt5A、β-Catenin和TCF7L2。通过体内外实验在RNA水平和蛋白水平上验证PGCs形成过程中Wnt5a介导Wnt5a/β-Catenin/Tcf712信号链的激活,并成功构建了 Myc标记的Tcf712融合表达载体,通过免疫共沉淀实验验证了鸡β-Catenin和TCF7L2蛋白之间的互作关系,从而确定了鸡PGCs形成过程中Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链的存在,为后续探究具体调控PGCs形成的机制做铺垫。通过ChIP-qPCR在ESCs和PGCs两种细胞中验证了 H3K4me2在Wnt5A启动子区存在 2 个富集位点（P1:3.072±0.513 和 17.3±1.924；P2:2.40±0.094 和 9.97±0.625）、在β-Catenin 启动子区存在 4 个富集位点（P1:7.41±0.413 和 12.23±1.952;P2:2.23±0.155 和11.54±1.602;P3:4.19±0.516 和 7.75±0.619;P4:5.61±0.641 和 9.68±0.547）、在 TCF7L2 启动子区存在 2 个富集位点（P1:3.02±0.032 和 15.8±1.63;P2:5.9±0.413 和 8.59±0.31）,且 H3K4me2修饰在PGCs上的富集水平显着高于ESCs（P<00.5）,进一步研究发现LSD1和MLL2能够介导Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区发生差异性H3K4me2富集。以上结果在RNA水平和蛋白水平上验证了 H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导,为深入探究组蛋白如何介导信号通路参与PGCs的调控研究奠定基础。（2）H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28A/B促进PGCs形成通过生物信息学分析对Wnt信号下游TCF7L2转录因子的靶基因进行预测,并根据GO功能注释筛选其中参与生殖细胞发育及干细胞分化的高度保守的靶基因Lin28A和Lin28B;体内外实验证实Wnt5A/β-Catenin信号和组蛋白H3K4me2能够正向促进Lin28A和Lin28B的转录。成功构建了重组表达载体pEGFP-Lin28A/B,以此确定长片段具有启动活性;同时成功构建缺失载体PGL3-Lin28A/B,并确定Lin28A启动子核心调控区域为-584+100bp和Lin28B启动子核心区域为-1431bp-1034bp;进一步分析发现,Lin28A/B核心启动子核心区存在TCF7L2结合位点,将结合位点突变发现Lin28A/B启动子核心区域的活性几乎完全丧失。接下来,通过双荧光素报告基因检测系统证实Lin28A和Lin28B核心启动子区能够响应Wnt信号;通过ChIP-qPCR在PGCs中验证了 β-Catenin在Lin28A启动子区存在2个富集位点（P1:26.52±2.14;P2:8.32土 1.20）,在 Lin28B 启动子区存在 3 个富集位点（P1:9.33土0.88；P2:4.90±0.53;P3:1.20土0.23）,且β-Catenin水平变化能够差异性富集Lin28A/B启动子区,以上实验确定Lin28A/B是Wnt信号的直接靶基因。成功构建Lin28A/B过表达载体和干扰载体,并通过体内外实验探究Lin28A/B对PGCs形成的影响,结果发现:在过表达组诱导第4d出现类胚体,第6d类胚体数量变多,并且同时过表达Lin28A和Lin28B诱导第2天便开始出现较大的EB,第4d类胚体数量变大变多,第6d类胚体出现大量的细胞分裂,与 0d（1±0）相比,第 6d PGCs 标记基因 Cvh、C-kit 和 Blimp1 显着上升至 1.61±0.07、2.21±0.07和3.08±0.09（P<0.05）,干扰组在同样的条件下则不能。体内对经Lin28A/B不同处理孵化至4.5d的鸡胚生殖嵴进行qRT-PCR检测发现相同的结果。流式细胞分析发现相较BMP4和BMP4+NC（3.31%±0.37和4.21%±0.21）组,体外同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH阳性率（5.86%±0.35）,而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率（1.91%±0.02）极显着下调（P<0.01）;体内流式细胞分析结果出现类似表达趋势:与Blank和NC（54.7%±3.12和52.6%±2.18）组相比,同时过表达Lin28A/B显示较高的CVH 阳性率（66.7%±4.31）,而同时敲低Lin28A/B,CVH阳性率（37.1%±1.97）极显着下调（P<0.01）。以上结果表明Lin28是受H3K4me2和Wnt信号调控的直接靶基因,且Lin28能正向调控PGCs的形成。（3）β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录通过ChIP-qPCR验证H3K4me2在Lin28A核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点（P1:14.96±1.41;P2:11.74±1.41）,在Lin28B核心启动子区TCF7L2结合元件附近存在2个富集位点（P1:3.08±0.041;P2:6.39±0.522）,且 MLL2 和 LSD1 能够介导 Lin28A/B 启动子区 H3K4me2的差异富集;双荧光素报告基因检测发现H3K4me2甲基化能增强Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应,而H3K4me2去甲基化则降低Lin28A/B启动子区对Wnt信号的响应。成功构建LSD1-flag融合表达载体,并将LSD 1分别与TCF7L2和β-Catenin进行共转染DF1细胞,COIP验证发现LSD1能够与TCF7L2蛋白结合而不是β-Catenin蛋白,进一步将LSD1、TCF7L2和β-Catenin以不同组合形式转染DF1细胞,COIP检测发现β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2。以上实验结果表明β-catenin能够与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录,解除LSD1对靶基因Lin28启动子区的H3K4me2去甲基化作用,激活Lin28表达。（4）Lin28A/B通过抑制gga-let7a-3p促进PGCs形成标记基因Blimp1的转录在线软件预测筛选了 micRNA-let7 家族 17 个鸡的 micRNA-let7s 成熟体（gga-let7s）,在 ESCs、PGCs和DF1三种细胞中进行同时干扰或过表达Lin28A/B处理,通过qRT-PCR筛选处关键候选的micRNA,即gga-let-7a-2-3p。进一步预测发现gga-let7a-3p共有558个靶基因,根据Target Score由高到低对靶基因进行筛选,发现调控PGCs形成的关键标记基因Blimp1。对Blimpl 3’UTR区域的gga-let7a-3p三个结合位点进行全部缺失,成功构建了 Blimp1 3’UTR野生型和突变型载体,即Blimp1-3’UTR-WT和Blimp1-3’UTR-Mut;通过双荧光素酶报告基因检测验证gga-let-7a能够结合到Blimp1的3’UTR区域抑制其表达。以上结果表明Lin28A/B可能通过抑制gga-let7a-3p促进Blimp1的转录进而调控PGCs形成。
何玲[4]（2019）在《低温胁迫下菊花叶转录组联合测序分析及DgMYB1基因的克隆与功能鉴定》文中认为‘神马’菊花（Dendranthema grandiflorum）是市场上普遍受欢迎的一个白色秋菊品种,有着悠长的栽培历史,观赏、药用、食用及经济价值都极高。菊花在生长和开花的过程中,极易受气温变化的影响,尤其是低温,严重降低其经济观赏价值。MYB转录因子作为植物最大的转录因子家族,在植物对外部胁迫环境的响应中起重要作用。本研究以正常条件和低温胁迫下的‘神马’菊花叶片为实验材料,采用单分子实时测序技术与Illumina HiSeqTM 4000双末端测序技术对菊花进行转录组数据信息的联合分析建立了6个cDNA文库。克隆得到1个MYB基因并遗传转化‘神马’菊花,对其生理指标进行测定,验证了转DgMYB1基因菊花的抗寒性,为通过分子生物学手段提高栽培菊花的耐寒性提供理论依据。主要研究结果如下:1.采用单分子实时测序技术与Illumina HiSeqTM 4000双末端测序技术对低温胁迫下的菊花叶片进行转录组数据信息的联合分析,建立了6个cDNA文库,共获得8.34 GB数据,最终获得3,717,516条subreads数据,平均长度为2,243bp;获得305,231条CCS序列,全长reads有257,144条;经过位点错配修饰后,获得141,445个consensus序列,经过校正和去除冗余后,共收集418,153个unigene。共有283,566个unigene注释到了7大数据库中;另外,还鉴定出18,592个基因发生差异表达,其中10,021个上调基因,8,571个下调基因。2.从低温胁迫下菊花转录组数据库中筛选1条MYB基因序列,设计全长引物并克隆得到该MYB基因的全长基因序列,命名为DgMYB1。序列分析显示:DgMYB1全长1240bp,开放阅读框为990bp,编码328个氨基酸,其编码产物的氨基酸的分子量为36.47kDa,理论等电点为PI=7.74。序列比对发现,DgMYB1与AtMYB73、NtMYB44、ZmMYB44、GmMYB29、MdMYB7和HvMYB6具有较高的同源性。系统进化树分析表明,DgMYB1与拟南芥AtMYB73、欧洲油菜BnMYB44的亲缘关系较近。3.构建植物表达载体pCAMBIA2300-MYB1,用SacⅠ和XbaⅠ对含有pEASY-MYB1和pCAMBIA2300表达载体质粒进行双酶切,最后利用农杆菌介导法将DgMYB1转入菊花,提取转基因菊花DNA作为PCR检测模板,通过荧光定量检测菊花中DgMYB1的表达水平,试验表明,菊花叶片中DgMYB1基因的表达水平高于茎和根。4.鉴定转DgMYB1基因菊花的耐寒性。在正常生长条件下,转基因菊花和野生型菊花表型并无明显差异,在低温胁迫下,野生型菊花叶片逐渐萎焉、脱水,甚至整株死亡,而转基因菊花长势良好。经过生理指标测定发现,在低温胁迫下,转DgMYB1基因菊花的存活率显着高于野生型;转基因菊花的相对电解质渗透率、丙二醛（MDA）含量、H2O2含量、O2-含量显着低于野生型,且DAB和NBT染色也比野生型浅,而抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均显着高于野生型,初步证明转基因菊花比野生型菊花表现出更强的耐寒性。5.运用实时荧光定量PCR的方法研究了与耐寒相关调控基因CuZnSOD、CAT、APX、DREB1A、DREB2A、P5CS、CSD1和CSD2的表达,结果表明在转基因菊花中,这些基因的表达水平均显着高于野生型菊花。综上所述,本研究完善了低温胁迫下菊花叶的转录组信息,并通过过表达DgMYB1基因,获得转基因‘神马’菊花植株,通过低温胁迫鉴定发现转基因植株耐寒性有所提高,为培育新品种的耐低温植物提供有效的基因储备。
黄立鑫[5]（2019）在《拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究》文中指出蜘蛛是一类有超过3亿年进化历史的类群,其进化的成功很大程度上归功于对蛛丝的巧妙应用和毒液的成功进化。除捕食性甲虫外,蜘蛛是最丰富的陆地捕食者。蜘蛛主要捕食节肢动物,部分蜘蛛也能捕食小型的脊椎动物,如老鼠、鸟类、蜥蜴等。毒液是蜘蛛进行捕食的主要武器,大部分蜘蛛都具有成对的毒腺以产生毒液。蜘蛛毒液是由多种化合物组成的混合物,根据对蜘蛛毒液的化学成分和药理多样性的总结,可以将其分为六大类:小分子化合物类、酰基多胺类、线性多肽、富含二硫键的多肽毒素、高分子量蛋白质类毒素以及酶类。富含二硫键的多肽毒素是大多数蜘蛛毒液中的主要毒性物质,毒素是蜘蛛进行捕食或防御的主要活性物质。大多数富含二硫键的蜘蛛毒素作用于外周神经肌肉接头或昆虫中枢神经系统的突触处,靶向突触前离子通道或突触后受体。蜘蛛神经毒素在昆虫中的作用靶标主要包括电压门控钙通道、电压门控钠通道、电压门控钾通道和谷氨酸受体,这些多肽毒素可以减弱昆虫神经系统功能,导致弛缓性麻痹,或过度激活神经系统功能,引起惊厥性麻痹,最终使受到攻击的猎物迅速丧失活动能力。本文以害虫天敌拟环纹豹蛛为研究对象,系统地分析了其毒液的组成,并对各种类型的毒素进行了总结。为了深入研究拟环纹豹蛛神经毒素的功能,本论文建立了富含二硫键的多肽毒素的表达和纯化系统,成功地表达并纯化了包含PPTX-22在内的多个神经毒素,并对PPTX-22的杀虫活性和作用机制进行了研究。一、拟环纹豹蛛毒素鉴定与分析通过拟环纹豹蛛毒腺转录组测序,共得到了 75,980个转录本。根据序列比对及注释信息分析,共鉴定出43个富含二硫键的多肽毒素。通过结构域分析,发现其中包括38个假定的神经毒素和5个假定的非神经毒性毒素。根据半胱氨酸排列方式、系统发育和结构域分析,将32种神经毒素分为6个家族;而另外的6种神经毒素,未能进行归类,命名为未能分类的类群。根据基因组结果,我们对拟环纹豹蛛神经毒素基因的基因结构进行了分析,结果显示,除Family F中神经毒素的成熟肽序列含有2-3个外显子,剩余5个家族中的神经毒素的成熟肽序列均只含有1个外显子。除了富含二硫键的多肽毒素,拟环纹豹蛛的毒液中还含有一些其它的组分,主要有虾红素样金属蛋白酶、Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂、毒液过敏原和透明质酸等。为了探索拟环纹豹蛛毒素相关基因的组织分布和表达,我们选取了毒腺、脑和脂肪体用于组织表达谱分析。结果显示,大多数假定的神经毒素基因主要在毒腺中特异性表达或者特异高表达。此外,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、毒液过敏原和透明质酸酶基因也在毒腺中特异性表达或者特异高表达。二、富含二硫键多肽毒素体外表达和纯化系统的建立为了建立适合富含二硫键的蜘蛛毒素的表达系统,本研究选取了的昆虫杆状病毒表达系统的载体pFastBacTM1、毕赤酵母表达系统的载体pPICZ A和pPICZα A、大肠杆菌表达系统的表达载体pET32a和pLicC-MBP。采用真核表达载体pFastBacTM1和pPICZα A表达毒素的成功率比较低,无法满足后续实验需求。采用真核表达载体pPICZA表达毒素成功率比较高,但是由于非目的条带较多,会影响后续纯化,也无法满足后续实验需求。采用原核表达载体pET32a表达毒素成功率比较高,但是由于融合蛋白不能正确折叠,多聚体严重,因此该载体也不适用于后续实验。采用原核表达载体pLicC-MBP表达毒素成功率比较高,同时目的条带比较单一,利于后期纯化,而且无二聚体。因此,在后续实验中,将采用原核表达载体pLicC-MBP表达富含二硫键的多肽毒素。采用HisTrap HP层析柱,可以得到纯度较高的融合蛋白,融合标签MBP的分子量约为42 kDa,而目的毒素的分子量通常小于10 kDa,因此需要利用TEV蛋白酶将融合标签切除。利用HiPrep 26/10 Desalting脱盐柱,可以对融合蛋白进行置换缓冲液的处理,以提供TEV蛋白酶的酶切条件。采用超滤管、分子筛、HisTrap Excel层析柱、MBPTrap HP层析柱等方法,均无法有效的将融合标签去除,无法得到较高纯度的重组毒素。最终,采用层析柱MBPTrap HP先除去酶切液中大部分的融合标签,再采用层析柱HisTrap HP将流穿液中剩余的融合标签除去,采用这种方法可以得到满足后续实验需要纯度的重组毒素。以此为基础,重组毒素的纯化系统构建成功。三、神经毒素PPTX-22的作用机制研究拟环纹豹蛛是亚洲稻区农业害虫的优势天敌,主要捕食稻飞虱、稻叶蝉等害虫,其中毒素在拟环纹豹蛛捕食过程中起到非常重要的作用。PPTX-22是拟环纹豹蛛毒液中的一种富含二硫键的神经毒素,含有109个氨基酸残基,主要由信号肽、前肽和成熟肽组成,成熟肽含有69个氨基酸残基,其中有10个半胱氨酸形成的5个二硫键。采用原核表达载体pLicC-MBP成功表达PPTX-22,切除融合蛋白后,重组毒素的分子量约为7.78 kDa。重组毒素PPTX-22可以引起褐飞虱麻痹甚至死亡,其2 h后的PD50为1402 pmol/g,95%置信区间分别为1297-1515 pmol/g,R2为0.9795。钙离子成像实验表明,无论细胞外液中是否含有钙离子,PPTX-22均能引起细胞内钙离子浓度增加;此外,在阻断细胞膜Ca2+通道的情况下,PPTX-22同样可以引起细胞内Ca2+浓度增加,说明该毒素不作用于细胞膜上的钙离子通道。进一步的实验结果表明,用IP3受体的抑制剂2-APB处理细胞后,PPTX-22依然可以引起细胞内钙离子浓度增加;而用高浓度的鱼尼丁处理细胞、阻断鱼尼丁受体后,PPTX-22不能引起细胞内钙离子浓度增加。结果表明,PPTX-22能够激活昆虫鱼尼丁受体,引起细胞内钙离子浓度增加。该研究通过拟环纹豹蛛毒腺进行转录组测序,获得了比较完整的毒素序列信息,在建立富含二硫键多肽毒素表达和纯化系统的基础上,获得了高纯度的重组毒素PPTX-22,并明确了该毒素的分子靶标为鱼尼丁受体,为第一个作用于鱼尼丁受体的生物毒素。拟环纹豹蛛是重要的农业害虫天敌,在农业生态环境中起着重要的作用,其毒素是重要的生物杀虫资源,可成为害虫防治的新资源。
张海珍[6]（2019）在《大青杨PuHSFA4a转录因子调控高锌胁迫应答的机理研究》文中进行了进一步梳理锌（Zn）作为一种营养元素在植物体内发挥着重要的作用,是植物体内多种酶的必需成分,对植物的生长发育有着很重要的作用。随着人类排放的废物废水的增多,大量的重金属进入土壤中。当土壤中大量的锌元素被植物吸收后,会导致植物的生长受到抑制,严重时会导致植物死亡。当植物在高含量锌的土壤中生长时,自身也会有一系列的抗逆机制来应对高锌胁迫。目前大部分的研究都集中在锌转运子上,对锌解毒的转录因子及其调控机理的研究很少。本研究的目的是初步阐明大青杨PuHSFA4a转录因子调控高锌胁迫应答的分子作用机制。（1）在大青杨中克隆了 PuHSFA4a转录因子,发现这个转录因子能够特异性地提高大青杨的抗高锌能力。在大青杨受到高锌胁迫后,通过qRT-PCR和GUS染色发现这个转录因子在根部发挥作用。通过亚细胞定位发现这个转录因子定位于细胞核和细胞质中,说明了这个转录因子是组成型表达蛋白。转录自激活实验展现出PuHSFA4a的转录激活区域在蛋白序列上的214 AA到278 AA处,包含一个AHA1激活部位。（2）将获得的PuHSFA4a过表达、抑制表达转基因株系和野生型大青杨进行高锌胁迫,结果表明:在高锌胁迫下,与野生型大青杨相比PuHSFA4a过表达转基因株系有着更健壮的根系和产生更少量的活性氧（ROS）,说明过表达PuHSFA4a基因提高了大青杨的抗高锌能力;而PuHSFA4a抑制表达转基因株系与野生型相比有着更矮小的根系同时产生了更多的ROS,最终对高锌胁迫更敏感了。（3）对PuHSFA4a转录因子抗高锌胁迫的机理进行了更深入的探究。在正常生长和高锌胁迫后,将PuHSFA4a过表达和野生型大青杨的根部进行转录组测序,结果表明:PuHSFA4a转录因子通过调控下游与非生物胁迫相关或者是和根生长相关的基因来提高植物的抗高锌能力。（4）通过染色质免疫共沉淀（ChIP）、酵母单杂实验（Y1H）、双荧光素酶实验（LUC）和凝胶阻滞实验（EMSA）发现:PuHSFA4a结合谷胱甘肽-S-转移酶（PuGSTU17）和马铃薯糖蛋白型磷脂酶（PuPLA2）基因启动子上的HSE元件从而直接调控这两个基因的表达。（5）通过对PuGSTU17转基因株系和野生型大青杨进行表型观察和生理指标测定:发现过表达PuGSTU17基因提高了大青杨根部的GST酶活,降低了根部的ROS水平,最终提高了整个植物的抗高锌能力。对另一个靶基因PuPLA2进行了转基因表型观察:发现在正常生长和高锌胁迫后,PuPLA2过表达株系根部生长比野生型更茂盛。综上所述:PuHSFA4a转录因子一方面通过直接调控PuGSTU17功能基因来提高大青杨根部GST酶活,最终降低了胁迫后产生的ROS。另一方面通过正调控下游靶基因PuPLA2的表达来促进根部的生长,最终提高植物的抗高锌能力。本研究不仅首次发现了热激转录因子能够提高植物的的抗高锌能力,而且拓宽了转录因子调控高锌胁迫的机制。为林木重金属土壤修复提供了理论依据和参考,对于培育出重金属抗逆性强的植物具有重要意义,有很重要的应用前景。
娄晓鸣[7]（2018）在《枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）抗寒种质鉴定及其抗寒机制》文中进行了进一步梳理枇杷（Eriobotryajaponica Lindl.）为原产我国的特色水果,因其风味独特,营养丰富,医疗保健价值高,植株兼具绿化功能,深受广大群众喜爱。白肉枇杷是枇杷中的极品,鲜食品质佳,已被江苏省列为重点发展的应时鲜果之一。枇杷通常秋冬开花,幼果越冬,此时正值一年中气温最低的季节,花果、晚秋梢甚至叶片均会受到冻害的威胁,因此冻害是枇杷栽培北缘地区生产上的瓶颈问题,进行抗寒种质的筛选和抗寒机理的研究具有重要意义。因此本文以白肉枇杷叶片为试材,首先评价了 25份白肉枇杷品种的抗寒性,然后通过生理生化分析、转录组和蛋白质组分析等进一步研究了白肉枇杷抗寒种质的抗寒机理,为揭示枇杷抗寒分子机理和培育抗寒品种提供依据。主要研究结果如下:1.以电导法配合Logistic方程的方法建立了白肉枇杷抗寒性测定体系,并鉴定了25份白肉枇杷资源的抗寒性。结果表明:以不同的处理时间、低温处理下‘白玉’叶片的相对电导率（REC）的变化作曲线,在低温处理8 h以上时,REC随着处理温度的降低而呈“S”形变化,可以利用Logistic方程计算半致死温度（LT50）。25份白肉枇杷LT50检测结果表明‘冠玉’最抗寒,其LT50为-15.95℃,‘美国种’、‘铜皮’、‘上海种’、‘白玉’、‘美玉’等次之。2.低温胁迫下,‘冠玉’枇杷叶片SP含量随温度降低呈现上下波动的趋势。SS、MDA含量随温度的降低总体呈现上升趋势。表明在适度的低温下,枇杷通过增加MDA和合成SS来抵御低温。Pro、PAL、An 4℃低温下,随着低温胁迫时间的延长,4℃胁迫0-12h间,一直呈上升趋势,至24h有所回落,从生理上推断Pro和PAL、An三者参与了白肉枇杷抵御低温的过程。3.应用RNA-Seq高通量测序技术分析了 4℃低温胁迫0h,4h白肉枇杷‘冠玉’叶片转录组情况。结果显示,共获得了 122,081个Unigene,61,357个基因上调,60,724个基因下调。其中有101,013个Unigene在NR,NT,Swiss-Prot等公共数据库中得到了注释。88,120个Unigene被注释在NR数据库中,枇杷转录组有53.8%的序列与桃序列高度匹配;有38,604个Unigene在COG数据库中有具体功能定义;60,464个Unigene在GO中有具体功能定义;有55,138个Unigene可以归入128条生物学通路。差异基因表达分析表明有1,210个DEGs,其中有599个上调,611个下调;上调基因中特异上调表达的DEGs有15个,表达直接降为0的DEGs有28个。上调表达最高的前50个DEGs,主要以COL、AP2、MYB类转录因子为主。下调表达最高的前50个DEGs,无转录因子,大部分为糖类代谢、信号转导、RNA转运等有关的基因在整个代谢通路中。KEGG功能分析表明,带有通路注释的DEGs基因765个,一共被注释在106个通路中,其中DEGs基因中显着富集的有7条,所涉及的主要代谢途径有昼夜节律植物、黄酮和黄酮醇的生物合成、类黄酮生物合成、光合作用-天线蛋白质、二苯乙烯类和姜酚生物合成、柠檬烯和蒎烯降解、植物激素信号转导。4.利用iTRAQ方法分离和鉴定了 4℃低温胁迫0h、4h、8h白肉枇杷‘冠玉’叶片的蛋白质。结果显示,共获得肽段22765个,鉴定蛋白质4582个。选择GO、COG、KEGG 3个库进行功能注释,其中,GO功能注释到的蛋白质最多,为4307个蛋白质。共有3038个蛋白质被COG数据库注释到功能。KEGG注释到的2705个蛋白质集中在261条通路中。差异蛋白分析表明,4℃低温胁迫差异蛋白分析表明,4℃低温胁迫0h、4 h、8h两两对照,三者所共有的差异蛋白质数目很少,为33个,占差异蛋白质并集（444个）的7.43%。与0h相比,4 h蛋白质总差异数为300个,上调179个,下调121个;8h总差异数97个,上调91个,下调6个。与4h相比,8h总差异数318个,上调192个,下调126个。通路富集分析表明,有共同的6条KEGG途径在PD4:PD0和PD8:PD4两组试验中同时出现,包括抗原处理和呈递、氮代谢、谷胱甘肽代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、戊糖和葡萄糖的相互转换和四环素生物合成途径。转录组和蛋白组的关联分析显示,只有27个基因是在显着差异表达的基因和蛋白间共享。经转录组和蛋白质组共同分析及qRT-PCR验证,S6PDH、ANS和PAL这3个基因可能在枇杷的冷响应中起重要作用。5.在转录组测序结果的基础上,运用RACE的方法克隆了‘冠玉’枇杷EjCBF13’RACE片段和EjCBF3、EjCBF4基因的ORF。其中EjCBF3 ORF 711bp,编码236个aa,EjCBF4 ORF为789bp,编码262个aa。枇杷EjCBF3和EjCBF4基因均包含AP2结构域、侧边的DSAWR特征序列和核定位信号。Blast程序显示枇杷EjCBF3和EjCBF4基因与苹果、梨的CBF基因在核酸、氨基酸序列水平上同源性较高,与拟南芥的同源性较差。‘冠玉’枇杷叶4℃低温胁迫时空表达分析表明,EjCBF3和EjCBF4基因表达趋势基本一致,在0.5-1h表达快速增加,在处理4h至12h之间维持较高水平,其中EjCBF4在处理10h时表达量最高,EjCBF3在12h时表达量最高。
王培培[8]（2018）在《拟南芥磷脂酶D调控生长素信号转导和应答盐胁迫的分子机理》文中研究说明土壤盐渍化是一个全球性问题,对生态环境和农业生产带来了巨大的负面影响。盐胁迫导致植物生长发育迟缓,由此引发多种生理反应。植物形成各种生理、细胞和遗传机制使其在高盐胁迫下得以生存,其中包括SOS（Salt overly sensitive）系统、植物激素、抗氧化防护系统、渗透调节物质和膜脂信号等。植物磷脂酶D（Phospholipase D,PLD）是磷脂代谢和应答非生物胁迫的重要酶类。PLD及其水解产物磷脂酸（Phosphatidic acid,PA）参与多种胁迫反应。因此,揭示PLD和PA调控植物耐盐的分子机制,对研究植物应答高盐胁迫和农作物抗逆分子遗传改良具有重要的意义。拟南芥基因组有12个PLD基因,根据蛋白结构和催化区域,分为PLDα（3）、PLDβ（2）、PLDy（3）、PLDδ、PLDε 和 PLDζ（2）。其中,PLDα1 和 PLDδ含量最多。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,研究PLD和PA对植物激酶蛋白PINOID（PID）活性的调控,及其对耐盐性的影响。主要研究结果如下:我们利用Western blotting验证了pld突变体材料的可用性,包括plda1、pldδ-1、pldδ-2、pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2。利用3H标记的PC（磷脂酰胆碱）和专一性的酶反应缓冲液,测定了野生型（WT）和pld体内的PLDα1和PLDδ活性。结果表明:pld单突变体中PLD蛋白的活性显着低于WT,pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2双突变体中PLD活性最低;用125 mM NaCl处理WT幼苗3 min后,PLD总活性（PLDα1和PLDδ）开始升高,5分钟达到最高,而后随着处理时间的延长（30分钟开始）,其活性开始下降;同时,利用ESI-MS/MS技术测定拟南芥磷脂组分。结果表明:盐处理10 min后,WT总PA含量显着升高,其中主要包括分子种34:2 PA、34:3 PA、36:4 PA、36:5 PA 和 36:6 PA,而pldα1 pldδ-1中无显着变化。利用 125 mM NaCl 处理WT和pld突变体幼苗,7天后统计主根根长发现:NaCl显着抑制WT和pld单突变体主根伸长,其对pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2的抑制最严重;外源PA能够在一定程度上恢复pld突变体主根生长。上述结果表明,PLD和其产物PA参与拟南芥主根耐盐的调控。PA通过结合靶蛋白,调控其细胞定位、活性或下游靶基因表达,调节植物对高盐、高温、冻害和渗透胁迫等多种逆境的响应。为了确定PA是否与PID蛋白激酶结合,我们从拟南芥中克隆了 PID的CDS区域和其三个截断,并将其连接到带有His标签的表达载体pET-28a（+）上,在大肠杆菌中诱导重组蛋白表达并纯化。利用脂印迹（Fat-blot）实验技术发现PA特异性与PID蛋白结合,其结合区域位于1-228氨基酸片段;结合定点突变技术进一步确定了 PID中第119-121位的三个赖氨酸（KKK）是PA的结合的关键位点。PID通过磷酸化质膜PIN蛋白调控其活性、极性分布。我们比较了盐胁迫对质膜上PID和PIN2丰度的影响。125 mM NaCl处理6 h显着降低质膜中PID-GFP（ProPID:PID-GFP）和PIN2-GFP（ProPIN2:PIN2-GFP）的丰度;而pldα1 pldδ-1 中二者丰度降低更多;外源添加25 μM PA处理显着缓解盐效应。同时,我们将PID和PA的结合关键位点KKK突变为GGG,获得了pid-1的野生型回补（ProPID:PID-GFP,pid-1）和突变体回补（ProPID:mPID-GFP;pid-1）等材料并进行盐处理。125 mMNaCl处理后,与野生型回补相比,突变体回补膜上荧光值降低的更多;外源添加PA能缓解野生型回补材料膜上PID丰度,而对突变体回补无显着效果。上述结果表明,盐胁迫能通过某种机制抑制质膜PID和PIN2的蛋白丰度,而PLD/PA能够促进二者的稳定性,并且其可能依赖于PA-PID的互作。我们用125 mM NaCl处理WT、pid突变体（pid-1和pid-2）及pid-1回补等材料6天后,比较各遗传材料根发育的差异。结果表明,与WT相比,在主根伸长方面,pid突变体表现为盐超敏感表型。野生型回补材料ProPID:PID-GFP pid-1恢复到野生型水平,而突变体回补中,盐胁迫下其主根表型与pid-1无显着差异。外源PA处理有效缓解 WT 和 ProPID:PID-GFP;pid-1主根长度,而对pid-1和ProPID:mPID-GFP;pid-1无显着影响。另外,pid-1突变体会形成针状花序、异常花和异常子叶,其中三个子叶是最常见的表型;其根向重力性降低。我们结果表明,与WT相比,野生型和突变PID转基因能够均能恢复其发育表型和向重力性。上述结果暗示,PA-PID互作特异性调控PID应答高盐胁迫,其可能不参与调控其他发育过程。脂印迹实验发现PA可以结合PIN2蛋白的胞质部分PIN2CL,其结合位点位于第496位精氨酸氨和第497位的赖氨酸。我们构建了pin2-1野生型回补材料（ProPIN2:PIN2;pin2-1）和结合位点突变的回补材料（ProPIN2:mPIN2;pin2-1）,并进行盐胁迫处理。结果表明:125 mM NaCl处理后,与WT相比,pin2-1和pin2-2突变体在主根生长方面均表现为盐超敏感表型,且外源添加PA不能恢复其表型;进一步研究发现ProPIN2:PIN2;pin2-1和ProPIN2:mPIN2;pin2-1回补材料的表型均与WT一致。上述研究结果表明,在盐信号过程中,PIN2处于PLD/PA信号的下游,且PA-PIN2的互作可能没有直接参与植物耐盐性的调控。我们利用蛙卵异源表达技术进一步研究了 PA对PID介导的PIN2活性的调控作用。单独表达PIN2的细胞并没有检测到生长素转运,而同时表达PID和PIN2检测到生长素的外向转运活性,表明PIN2的转运活性依赖于PID磷酸化。外源PA显着提高PIN2的转运活性,而当只表达PIN2蛋白时,PA无明显作用。同时,PC对PIN2的生长素转运活性无调控作用。另外,当共表达与PA不结合的PID和PIN2时,PA促进PIN2转运活性的效应消失。利用生长素标记材料DII-VENUS,观察了不同遗传材料根尖分生组织生长素的实时变化。当DII-VENUS荧光升高,表示生长素含量下降,反之则升高。对照条件下,与WT相比,pldα1 pldδ-1,pid和pin2根尖分生组织生长素含量较高;125 mM NaCl处理后,WT根尖分生组织DII-VENUS荧光升高,生长素下降,而pldα1 pldδ-1,pid-1和pin2-1基本不变;外源补充的PA,促使WT和pldα1pldδ-1根尖分生组织荧光升高,生长素更低,而pid和pin2的荧光无显着变化。另外,观察了回补材料 ProPID:PID-GFP;pid-1 和 ProPID:mPID-GFP;pid-1背景下DII-VENUS的荧光变化,结果表明:对照条件下,它们的荧光和WT无显着区别;NaCl处理后,ProPID:PID-GFP;pid-1和WT根尖分生组织DII-VENUS荧光值相近,而ProPID:mP1D-GFP;pid-1和pid-1突变体荧光值一致。上述结果表明,PA-PID互作参与调控植物根尖生长素的动态分布和高盐应答过程。综上所述,盐胁迫下,PLDα1和PLDδ被激活,产生信号分子PA,结合并激活PID磷酸化PIN2的活性,提高质膜PIN2转运生长素的活性,促使生长素的动态再分布和植物的盐应答。本研究揭示了一条基于磷脂信号调控生长素信号转导和植物应答高盐胁迫的分子机制,为后期农作物的耐盐分子遗传改良提供了重要的理论基础和基因资源。
包臣昌[9]（2018）在《拟穴青蟹神经肽及其受体的发掘及sNPF生殖调控作用研究》文中研究指明神经肽作为多样化、普遍存在的信号分子,具有多项重要生理调节作用。它们中的大多数通过与跨膜的G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor,GPCR）结合而行使其功能。拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国重要的经济物种,了解其卵巢发育对于水产养殖和资源保护都具有重要意义。本研究采用二代测序的方法,鉴定了来自32个转录本的100个不同的成熟肽。同时,通过转录组数据的发掘,预测得到65个神经肽GPCR转录本。采用人胚肾上皮细胞系（Human embryonic kidney cells 293T,HEK293T）异源表达和双荧光素酶分析系统,从功能上鉴定了 甲壳动物动心肽受体（Crustacean cardioactive peptide receptor,CCAPR）和短神经肽F受体（Short neuropeptide F receptor,sNPFR）。此外,我们采用核酸原位杂交、Ca2+动员和信号转导等手段探究了 sNPF可能以卵巢内部的自分泌/旁分泌因子抑制卵巢发育的作用机制。本研究主要成果如下:1)本研究采用二代测序、RT-PCR和实时荧光定量PCR技术鉴定了可能参与拟穴青蟹卵巢发育的神经肽。通过转录组数据发掘,从雌性拟穴青蟹脑神经节中得到来自24个神经肽家族的32个神经肽转录本以及100个不同的神经肽成熟肽。在这些神经肽家族中,GSEFLamide和WXXXRamide在甲壳动物脑神经节中首次被鉴定。这些神经肽中的21个转录本被用于后续研究,结果证实这些转录本都在脑神经节有表达,并且广泛分布于包括卵巢在内的多个组织中;它们中的大多数在不同卵黄发生期呈现差异表达,提示这些神经肽可能参与拟穴青蟹卵黄发生及卵巢成熟的调控过程。本实验结果为进一步研究神经肽在拟穴青蟹生殖调控中的作用提供重要的研究基础。2)本研究采用组合的生物信息学分析策略来鉴定拟穴青蟹神经肽GPCR（SpGR）。通过转录组数据库的发掘,我们获得65个预测的SpGR序列。随后,以已经报道的GPCR为参考序列,采用以序列相似性为基础的聚类分析和进化树比对的方法鉴定这些SpGR。其中,多数的SpGR转录本在拟穴青蟹的各组织中均有表达,并且有些呈现性别差异表达的现象。提示它们可能参与包括性别分化在内的多种生理调节过程。另外,配体-受体结合实验结果显示,预测的SpGR-A54可以被CCAP多肽通过浓度依赖的作用方式激活。这是甲壳动物第一个经过功能鉴定的CCAP受体。本研究鉴定了大量的神经肽GPCR,并缩小了用于配体-受体结合检测的候选SpGR范围,为后续研究拟穴青蟹神经肽/GPCR信号通路提供了参考信息。3)通过以上生物信息学的分析,我们获得了 sNPF的候选受体（SpGR-A8）。采用HEK293T细胞表达系统鉴定了该受体可以被sNPF特异性激活,因此我们将其命名为sNPFR。通过卵黄发生前期卵巢的原位杂交定位以及在剥离的卵母细胞和滤泡细胞层的RT-PCR检测,我们发现sNPF特异性地表达于滤泡细胞中,而sNPFR则在滤泡细胞和卵母细胞中均有表达。同时,研究结果显示sNPF可部分抑制裸露卵母细胞的自发成熟,并伴随着细胞内的cAMP积累和Ca2+动员。此外,活体注射合成的sNPF肽可以抑制卵黄蛋白原及其受体的基因表达水平。综合以上研究结果,我们首次提出了 sNPF可以作为卵巢内部自分泌/旁分泌因子抑制青蟹卵母细胞成熟及卵黄发生的观点。
王立建[10]（2017）在《过氧化物酶体上茉莉酸外运蛋白调控茉莉酸异亮氨酸和茉莉酮的内稳态》文中进行了进一步梳理过氧化物酶体是细胞新陈代谢的中心,参与了植物激素生长素（Auxin）,茉莉酸（Jasmonic acid,JA）和苯甲酸（Benzoic acid,BA）的生物合成。尽管过氧化物酶体参与植物激素的合成早已为人所知,但这些过氧化物酶体中合成的植物激素的外运机制以及其在调控植物激素信号中的作用目前尚不清楚。JA作为植物激素参与调控植物生长发育以及应对外界生物和非生物胁迫。JA的生物合成是从细胞质膜释放的亚麻酸氧化开始,ATP binding cassette（ABC）转运蛋白COMATOSE（CTS）转运其前体物质 12-氧-植物二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid,OPDA）至过氧化物酶体中,再经过OPDA reducdase 3（OPR3）还原和三轮β氧化生成JA,但关于JA是如何被运出过氧化物酶体的目前还不清楚。Arabidopsis thaliana JA transporter 2（AtJAT2）参与酵母细胞中JA的内运运和介导过氧化物酶体中JA的外运。为了鉴定拟南芥中的JA转运蛋白,我们基于JA抑制酵母细胞的生长将候选基因连接到PDR195载体上转化酿酒酵菌株YPH499细胞。发现表达AtjAT2的细胞比空载体的转化子对外源JA的抗性变弱。3H-JA吸收实验表明AtJAT2在酵母细胞中具有内运JA的功能。AtJAT2启动子活性主要在拟南芥的根,叶和花等的维管组织中,与OPR3启动子活性部位高度一致。AtJAT2-GFP（Green Fluorescent Protein）和 PTS1（Peroxisomal Targeting Signal）-RFP（Red Fluorescent Protein）信号共定位于过氧化物酶体,Western印迹证明AtJAT2-GFP定位于过氧化物酶体膜上。与野生型拟南芥（Col）相比,atat2叶片分离的过氧化物酶体中有更高的3H-JA累积,说明AtJAT2/AtABCG1参与过氧化物酶体中JA的外运。AtJAT2外运过氧化物酶体JA受到ATP、ABC蛋白特异性抑制剂钒酸钠（vanadate,VD）、维拉帕米（verapramil,VP）和格列本脲（gilbenclamide,GC）的影响。动力学研究显示AtJAT2/AtABCG1介导过氧化物酶体JA外运具有高亲和性,其Km为137.5±38.6 nM,底物竞争实验表明AtJAT2/AtABCG1优先转运JA。AtJAT2调控细胞中核心JA信号转导途径。与ctsl表型相似,atjat2雄蕊发育正常,表现出正常的育性。然而,atjat2-1;cts1双突变体表现雄性不育,且外源茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate,MeJA）能够恢复其育性。证明AtJAT2和CTS在调控JA介导的雄蕊成熟中具有协同作用。atjat2过氧化物酶体中的JA含量高于Col;而Col细胞中总的JA和茉莉酸异亮氨酸（Isoleucine-jasminate,JA-Ile）含量则显着高于atjat2细胞。在atjat2中,JA信号途径响应基因相对转录水平均显着低于Col。Col细胞核中JAZ1-GFP信号低于atjat2细胞,无论在Col和atjat2细胞中,外源JA都引起JAZ1-GFP信号的消失。和Col相比,atjat2对坏死性真菌灰霉菌（Botrytis cinerea）和甘蓝链格孢菌（Alternaria brassicicola）的抗性都显着降低。这些结果表明AtJAT2通过调控细胞质中JA分布来调控JA-Ile介导的核心JA信号转导途径。AtJAT2通过调节JA在细胞质和过氧化物酶体中的分布调控细胞中JA-Ile和茉莉酮（cis-Jasmone,CJ）的代谢流。有趣的是,与opr3相反,atjat2细胞中CJ的含量远大于Col细胞。同时,CJ的响应基因OPR1和KMD3在atjat2细胞中的相对转录水平均高于Col。桃蚜吸引实验表明桃蚜更趋向于选择Col而避开atjat2植物。这些结果显示AtJAT2通过调节过氧化物酶体中JA的积累来调控CJ的合成。以上研究结果表明AtJAT2参与调节过氧化物酶体和细胞质中JA的分布进而调控JA-Ile和CJ代谢流。AtJAT2启动子活性及基因的表达均受到JA的诱导,但受到CJ的抑制。总而言之,我们的结果提示AtJAT2通过调控细胞中JA-Ile和CJ的内稳态来迅速协调植物发育、防卫反应以及植物与昆虫之间的互作。
二、胞液型磷脂酶A_2cDNA与载体PRCCMV连接及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胞液型磷脂酶A_2cDNA与载体PRCCMV连接及表达（论文提纲范文）
（1）紫花苜蓿响应石墨烯材料的表达谱分析及其分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.2 植物抗逆性研究进展 |
| 1.2.1 植物抗逆相关指标 |
| 1.2.2 逆境胁迫下植物的生理变化 |
| 1.2.3 逆境胁迫下植物响应的分子机制 |
| 1.3 纳米材料在植物中的生物效应 |
| 1.3.1 纳米材料在土壤中的作用 |
| 1.3.2 纳米材料对植物生长的影响 |
| 1.3.3 纳米材料的植物毒性研究 |
| 1.4 石墨烯材料的植物效应研究 |
| 1.4.1 石墨烯材料介绍 |
| 1.4.2 植物对石墨烯的生理响应 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 不同程度石墨烯处理下紫花苜蓿对盐、碱胁迫的形态及生理响应差异 |
| 引言 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 试验材料及方法 |
| 2.1.2 盐、碱胁迫试验方法 |
| 2.1.3 测定指标与方法 |
| 2.1.4 数据统计 |
| 2.1.5 透射电镜观察 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 生理和形态指标差异分析 |
| 2.2.2 相关分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 石墨烯调控紫花苜蓿适应盐、碱胁迫的分子机制 |
| 引言 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 胁迫处理 |
| 3.1.3 RNA提取和检测 |
| 3.1.4 cDNA文库构建 |
| 3.1.5 转录本表达量评估和功能注释 |
| 3.1.6 转录本数据分析 |
| 3.1.7 差异表达基因鉴定及功能注释 |
| 3.1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.1.9 加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA测序数据产出统计 |
| 3.2.2 转录本的功能注释 |
| 3.2.3 对照组与石墨烯处理组的差异基因表达分析 |
| 3.2.4 盐胁迫下石墨烯处理苜蓿叶片的差异基因表达分析 |
| 3.2.5 碱胁迫下石墨烯处理苜蓿叶片的差异基因表达分析 |
| 3.2.6 石墨烯处理下DEGs对非生物胁迫响应的WGCNA分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 紫花苜蓿快速响应石墨烯毒害的适应性机制 |
| 引言 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 氮代谢指标测定 |
| 4.1.3 数据统计 |
| 4.1.4 RNA提取和检测 |
| 4.1.5 cDNA文库构建 |
| 4.1.6 转录组数据分析 |
| 4.1.7 加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
| 4.1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 石墨烯胁迫下苜蓿的生理变化 |
| 4.2.2 石墨烯胁迫下苜蓿叶片的转录组学分析 |
| 4.2.3 差异基因功能分析 |
| 4.2.4 石墨烯胁迫条件下氨基酸代谢途径中的基因表达 |
| 4.2.5 石墨烯胁迫下DEGs的 WGCNA分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 转录组和代谢组学分析紫花苜蓿适应石墨烯胁迫的分子机制 |
| 引言 |
| 5.1 材料方法 |
| 5.1.1 植物材料和生长条件 |
| 5.1.2 测定指标与方法 |
| 5.1.3 数据统计 |
| 5.1.4 RNA提取和检测 |
| 5.1.5 cDNA文库构建 |
| 5.1.6 转录本表达量评估和功能注释 |
| 5.1.7 转录本数据分析 |
| 5.1.8 差异表达基因鉴定及功能注释 |
| 5.1.9 代谢组样品代谢物提取 |
| 5.1.10 样品代谢物检测 |
| 5.1.11 代谢物定性定量分析 |
| 5.1.12 代谢组数据统计 |
| 5.1.13 组学数据联合分析 |
| 5.1.14 加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
| 5.1.15 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 生理指标 |
| 5.2.2 代谢组学分析 |
| 5.2.3 差异表达代谢物(DEMs) |
| 5.2.4 转录组学分析 |
| 5.2.5 差异表达基因(DEGs) |
| 5.2.6 差异基因的功能表达 |
| 5.2.7 转录组和代谢组联合分析结果 |
| 5.2.8 DEGs对石墨烯胁迫响应的WGCNA分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）鲤鱼Group Ⅲ分泌型磷脂酶A2的原核表达及磷脂酶活性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 绪论 |
| 1 前言 |
| 2 Group Ⅲ分泌型磷脂酶A_2研究进展 |
| 2.1 Group Ⅲ分泌型磷脂酶A_2的发现 |
| 2.2 Group Ⅲ分泌型磷脂酶A_2的结构和性质 |
| 2.3 Group Ⅲ分泌型磷脂酶A_2的功能 |
| 2.4 磷脂酶A_2活性测定方法 |
| 3 重组蛋白可溶性原核表达的研究进展 |
| 3.1 选择合适的宿主菌 |
| 3.2 使用分子伴侣或折叠酶共表达 |
| 3.3 融合标签技术 |
| 3.4 表达条件的优化 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鲤鱼PLA2g3功能区可溶性原核蛋白的获得及酶活特性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.3 序列分析 |
| 1.4 原核重组表达载体的构建 |
| 1.5 原核表达蛋白的诱导和纯化 |
| 1.6 磷脂酶A_2活性的测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 序列分析 |
| 2.2 原核蛋白的诱导和纯化 |
| 2.3 重组蛋白磷脂酶活性特性 |
| 3 讨论 |
| 第三章 鲤鱼Group Ⅲ分泌型磷脂酶A_2的N-端和C-端对磷脂酶活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂及仪器 |
| 1.2 鲤鱼PLA2g3序列分析及三维结构预测 |
| 1.3 原核重组质粒的构建 |
| 1.4 原核表达蛋白的诱导和纯化 |
| 1.5 磷脂酶A_2活性的测定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 鲤鱼PLA2g3a1序列及其结构分析 |
| 2.2 原核蛋白的诱导和纯化 |
| 2.3 重组蛋白磷脂酶酶活特性 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 科研情况 |
（3）H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PGCs的发生及生物学特性 |
| 1.1 PGCs的发生 |
| 1.2 PGCs的生物学特性 |
| 2 PGCs发生的分子调控研究进展 |
| 2.1 细胞因子调节PGCs形成 |
| 2.2 RNA结合蛋白调节PGCs形成 |
| 2.3 关键基因调节PGCs形成 |
| 3 Wnt/β-catenin信号通路对雄性生殖细胞形成的研究进展 |
| 3.1 Wnt信号通路概述 |
| 3.1.1 经典Wnt信号通路 |
| 3.1.2 非经典Wnt信号通路 |
| 3.2 Wnt/β-catenin信号通路对靶基因转录的调控研究 |
| 3.2.1 β-catenin/TCF核心效应因子 |
| 3.2.2 表观遗传学机制 |
| 3.3 Wnt/β- catenin信号通路在雄性生殖细胞形成过程中的研究 |
| 4 PGCs形成过程的表观遗传调控 |
| 4.1 DNA甲基化在PGCs发育过程中的研究进展 |
| 4.1.1 哺乳动物PGCs发育过程的DNA甲基化 |
| 4.1.2 家禽PGCs形成过程的DNA甲基化 |
| 4.2 组蛋白甲基化修饰在PGCs发育过程中的研究进展 |
| 4.2.1 哺乳动物PGCs发育过程中的组蛋白甲基化修饰 |
| 4.2.2 家禽PGCs形成过程中的组蛋白甲基化修饰 |
| 4.3 组蛋白甲基化修饰发挥功能的机制研究 |
| 4.3.1 抑制性和激活性赖氨酸甲基化修饰 |
| 4.3.2 组蛋白赖氨酸甲基化修饰酶 |
| 5 本课题的前期研究发现 |
| 6 本研究的研究目的与意义 |
| 7 参考文献 |
| 第二章 PGCs形成过程中H3K4me2对Wnt5A/β-Catenin/ TCF7L2信号链的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 细胞分离培养 |
| 1.5 ChIP-Seq和RNA-seq联合分析PGCs形成过程中关键信号通路 |
| 1.6 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号参与鸡PGCs形成的研究 |
| 1.6.1 细胞分组与处理 |
| 1.6.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.6.3 qRT-PCR检测Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号分子的表达变化 |
| 1.6.4 COIP检测β-Catenin和TCF7L2的结合 |
| 1.7 ESCs、PGCs中Wnt关键信号分子启动子区的H3K4me2富集检测 |
| 1.7.1 细胞分组与处理 |
| 1.7.2 ChIP-qPCR检测H3K4me2在Wnt关键信号分子启动子区的富集情况 |
| 1.8 PGCs形成过程中H3K4me2对Wnt信号分子的表达影响检测 |
| 1.8.1 细胞分组与处理 |
| 1.8.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.8.3 qRT-PCR检测Wnt5A/β-Catenin信号通路信号分子的表达变化 |
| 1.8.4 Westen blot检测Wnt通路关键信号分子的表达变化 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 实验结果及分析 |
| 2.1 PGCs形成关键信号通路的筛选 |
| 2.1.1 RNA-seq分析PGCs形成过程中关键信号通路 |
| 2.1.2 ChIP-Seq分析H3K4me2在PGCs形成过程中富集的关键信号通路 |
| 2.1.3 RNA-seq和ChIP-Seq联合分析筛选PGCs形成关键信号通路 |
| 2.2 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号链参与鸡PGCs形成过程 |
| 2.2.1 Wnt5A介导Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号 |
| 2.2.2 载体构建结果 |
| 2.2.3 β-Catenin与TCF7L2结合 |
| 2.3 ESCs、PGCs中Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区H3K4me2富集检测 |
| 2.3.1 ChIP的条件摸索 |
| 2.3.2 H3K4me2富集于Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区 |
| 2.3.3 H3K4me2在Wnt5A、β-Catenin、TCF7L2启动子区差异富集 |
| 2.4 H3K4me2激活Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号促进PGCs的形成 |
| 2.4.1 体外验证H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导 |
| 2.4.2 体内验证H3K4me2正向调节Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号传导 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进PGCs形成 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号靶基因预测 |
| 1.5 体内外验证Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号对Lin28A/B的表达影响 |
| 1.5.1 β-Catenin慢病毒干扰载体构建及活性验证 |
| 1.5.2 细胞分组与处理 |
| 1.5.3 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.5.4 qRT-PCR检测Wnt信号分子及Lin28A/B表达情况 |
| 1.6 Lin28A/B启动子区域的生物学信息学分析 |
| 1.7 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 1.7.1 pLin28A-EGFP、pLin28B-EGFP的构建 |
| 1.7.2 DF1细胞培养与转染 |
| 1.7.3 启动子活性定性分析 |
| 1.8 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 1.8.1 Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建 |
| 1.8.2 PGL3-basic重组载体鉴定与命名 |
| 1.8.3 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 1.9 TCF7L2结合位点缺失对Lin28A/B的启动活性的影响 |
| 1.9.1 TCF7L2结合位点缺失的启动子报告基因载体的构建 |
| 1.9.2 双荧光素报告基因检测Lin28A/B转录因子结合位点缺失的启动活性 |
| 1.10 验证Lin28A/B是Wnt5 A/β-Catenin下游靶基因 |
| 1.10.1 双荧光素报告基因检测Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 1.10.2 Chip-qPCR验证β-Catenin富集Lin28A/B核心启动子区 |
| 1.11 H3K4me2水平变化对Lin28A/B的表达影响的研究 |
| 1.11.1 细胞分组与处理 |
| 1.11.2 鸡胚注射孵化分组 |
| 1.11.3 qRT-PCR检测Lin28A和Lin28AB的表达变化 |
| 1.12 Lin28A/B干扰载体构建及干扰效率验证 |
| 1.13 Lin28A/B过表达载体构建 |
| 1.14 Lin28A/B在PGCs形成过程中的功能研究 |
| 1.14.1 细胞分组与处理 |
| 1.14.2 鸡胚孵化分组与处理 |
| 1.14.3 荧光定量PCR检测PGCs形成相关基因表达 |
| 1.14.4 PAS染色法检测各组生殖嵴发育 |
| 1.14.5 流式细胞分析检测PGCs形成效率 |
| 1.15 数据分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号靶基因预测 |
| 2.1.1 不同物种TCF7L2靶基因预测 |
| 2.1.2 GO注释筛选与生殖分化相关的靶基因 |
| 2.2 Wnt5A/β-Catenin/TCF7L2信号正向促进Lin28A/B表达 |
| 2.2.1 β-Catenin干扰载体构建及活性验证 |
| 2.2.2 体内验证Wnt5A/β-Catenin信号正向调控Lin28A/B表达 |
| 2.2.3 体外验证Wnt5A/β-Catenin信号正向调控Lin28A/B表达 |
| 2.3 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 2.3.1 真核表达载体pEGFP-Lin28A、pEGFP-Lin28B的构建 |
| 2.3.2 Lin28A/B启动子活性分析 |
| 2.4 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 2.4.1 Lin28A/B启动子不同缺失片段PGL3-basic载体构建 |
| 2.4.2 Lin28A/B启动子核心区域筛选 |
| 2.5 TCF7L2结合位点突变对Lin28A/B的启动活性的影响 |
| 2.5.1 转录因子TCF7L2结合位点突变的启动子报告基因载体的构建 |
| 2.5.2 双荧光素报告基因检测Lin28A/B转录因子结合位点缺失的启动活性 |
| 2.6 Lin28A/B是Wnt5 A/β-Catenin/TCF7L2信号链直接靶基因 |
| 2.6.1 双荧光素报告基因检测Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 2.6.2 Chip-qPCR验证β-Catenin富集于Lin28A/B启动子区 |
| 2.7 H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.7.1 体外验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.7.2 体内验证H3K4me2正向调控Lin28A/B转录 |
| 2.8 Lin28A/B正向调控PGCs形成的功能研究 |
| 2.8.1 Lin28A/B干扰载体构建 |
| 2.8.2 Lin28A/B过表达载体构建 |
| 2.8.3 Lin28A/B正向调控PGCs的形成 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28转录 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 H3K4me2在Lin28A/B启动子区的富集检测 |
| 1.4.1 细胞分组与处理 |
| 1.4.2 ChIP-qPCR检测H3K4me2在Lin28/B启动子区的富集情况 |
| 1.5 荧光素酶报告基因检测H3K4me2对Lin28A/B响应Wnt信号能力的影响 |
| 1.6 H3K4me2去甲基化酶LSD1对β-catenin与TCF7L2的结合能力的影响 |
| 1.6.1 LSD1与β-catenin和TCF7L2的结合能力检测 |
| 1.6.2 LSD1对β-catenin与TCF7L2的结合能力的影响 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 H3K4me2富集于Lin28A/B的启动子区并差异性调节Lin28A/B转录 |
| 2.2 H3K4me2甲基化/去甲基化影响Lin28A/B对Wnt信号的响应 |
| 2.3 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2促进Lin28A/B的转录 |
| 2.3.1 LSD1融合表达载体构建 |
| 2.3.2 LSDl 与 TCF7L2 互作而不是(3-Catenin |
| 2.3.3 β-catenin与LSD1竞争结合TCF7L2 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 Lin28通过抑制gga-let-7a-2-3p促进PGCs形成标记基因Blimp1的转录 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 Lin28A/B靶向的gga-let7s筛选 |
| 1.4.1 鸡micRNA-let7s筛选 |
| 1.4.2 细胞分组与处理 |
| 1.4.3 qRT-PCR检测Lin28A/B靶向的gga-let7s筛选 |
| 1.5 gga-let-7a-2-3p靶基因筛选 |
| 1.6 检测gga-let-7a-2-3p对靶基因的靶向作用 |
| 1.6.1 gga-let-7a-2-3p模拟物、抑制物合成及效率验证 |
| 1.6.2 Blimp1 3'UTR野生型和突变型载体构建 |
| 1.6.3 双荧光素报告基因检测gga-let-7a-2-3p对Blimp1的靶向作用 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Lin28A/B靶向的关键micRNA let7的筛选 |
| 2.2 gga-let-7a-2-3p靶基因预测 |
| 2.3 gga-let-7a-2-3p负向调控Blimp1的表达 |
| 2.4 Blimp1 3'UTR野生型和突变型载体构建 |
| 2.5 gga-let-7a-2-3p对Blimp1的靶向作用 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 5 参考文献 |
| 本文结论与创新 |
| 论文有待改进之处及下一步计划 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（4）低温胁迫下菊花叶转录组联合测序分析及DgMYB1基因的克隆与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物耐寒性的研究概况 |
| 1.1.1 低温胁迫与保护酶系统 |
| 1.1.2 低温胁迫与渗透调节物质 |
| 1.1.3 低温胁迫与膜系统 |
| 1.2 转录组测序技术的研究 |
| 1.2.1 第二代Illumina测序技术在植物转录组测序中的应用 |
| 1.2.2 第三代SMRT单分子测序技术在植物中的应用 |
| 1.2.3 联合测序技术的应用 |
| 1.3 植物MYB转录因子的研究 |
| 1.3.1 植物中的MYB转录因子 |
| 1.3.2 MYB转录因子在植物非生物胁迫中的作用 |
| 1.3.3 MYB转录因子在低温调控中的作用 |
| 1.3.4 MYB转录因子的研究现状以及发展趋势 |
| 1.4 研究意义及内容 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 菊花转录组测序 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料与低温处理 |
| 2.1.2 实验设备仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菊花总RNA的提取与检测 |
| 2.2.2 cDNA文库的制备与上机测序 |
| 2.2.3 生物信息分析流程 |
| 2.2.4 原始数据处理及全长转录本分析 |
| 2.2.5 转录本去冗余与基因功能注释 |
| 2.2.6 基因表达水平分析 |
| 2.2.7 差异表达分析 |
| 2.2.8 荧光定量验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 转录组序列组装及分析 |
| 2.3.2 转录本去冗余 |
| 2.3.3 转录本的功能注释 |
| 2.3.4 基因表达水平分析 |
| 2.3.5 差异表达基因分析 |
| 2.3.6 响应低温的菊花差异基因转录因子 |
| 2.3.7 与抗氧化系统相关的低温响应基因 |
| 2.3.8 与生物膜系统相关的低温响应基因 |
| 2.3.9 与冷应激反应相关的低温响应基因 |
| 2.3.10 qPCR验证结果分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 菊花差异基因转录因子对低温胁迫的响应 |
| 2.4.2 抗氧化相关的差异基因对菊花低温胁迫的响应 |
| 2.4.3 生物膜系统相关的差异基因对菊花低温胁迫的响应 |
| 2.4.4 冷应激反应相关的差异基因对菊花低温胁迫的响应 |
| 第三章 DgMYB1基因的克隆和对菊花的遗传转化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验设备仪器 |
| 3.1.3 实验主要试剂和菌株 |
| 3.1.4 引物序列 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菊花总RNA的提取与检测 |
| 3.2.2 cDNA的合成和gDNA去除 |
| 3.2.3 引物设计与PCR扩增 |
| 3.2.4 PCR产物的检测与胶回收 |
| 3.2.5 PCR回收产物的连接转化 |
| 3.2.6 基因序列分析 |
| 3.2.7 菊花DgMYB1基因表达载体的构建 |
| 3.2.8 重组质粒转化农杆菌感受态细胞 |
| 3.2.9 农杆菌介导法转化菊花 |
| 3.2.10 转基因阳性植株的鉴定 |
| 3.2.11 转基因植株的表达 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 DgMYB1全长的获得 |
| 3.3.2 DgMYB1基因的序列分析 |
| 3.3.3 蛋白的同源性分析及系统进化发育树分析 |
| 3.3.4 转基因植株的获得及表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 转DgMYB1基因菊花的耐寒性评价 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验设备仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 低温胁迫处理 |
| 4.2.2 过表达DgMYB1菊花幼苗的耐寒性初步鉴定 |
| 4.2.3 低温胁迫下转基因菊花的生理指标测定 |
| 4.2.4 DgMYB1相关耐寒调控基因在低温胁迫处理下的表达测定 |
| 4.2.5 数据处理与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 低温胁迫下菊花幼苗生理生化特性的变化 |
| 4.3.2 DgMYB1相关耐寒调控基因在低温胁迫处理下的表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蜘蛛及其毒液 |
| 1.1 蜘蛛 |
| 1.2 蜘蛛毒液的主要组份 |
| 2 蜘蛛毒素的药理学研究 |
| 2.1 抑制谷氨酸转运蛋白对谷氨酸的摄取 |
| 2.2 细胞毒性 |
| 2.3 诱导神经递质发生胞吐作用 |
| 2.4 降解生物体组织 |
| 2.5 调节离子通道 |
| 3 蜘蛛毒素的获取 |
| 3.1 电刺激法获取毒液 |
| 3.2 蜘蛛毒素体外重组 |
| 3.3 重组蛋白的纯化方法 |
| 4 鱼尼丁受体 |
| 4.1 钙离子成像技术 |
| 4.2 昆虫鱼尼丁受体的研究 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 拟环纹豹蛛毒素鉴定与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.4 文库制备和转录组测序 |
| 1.5 转录组组装和功能注释 |
| 1.6 实时荧光定量PCR |
| 1.7 序列和数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序、组装和功能注释 |
| 2.2 毒液多肽毒素和其它毒液成分鉴定 |
| 2.3 拟环纹豹蛛神经毒素的家族分析 |
| 2.4 神经毒素基因结构分析 |
| 2.5 非神经毒性多肽类毒素 |
| 2.6 毒液蛋白酶类 |
| 2.7 毒液蛋白酶抑制剂类 |
| 2.8 Venom allergen 5 |
| 2.9 透明质酸酶 |
| 2.10 组织表达谱分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 富含二硫键多肽毒素体外表达和纯化系统的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 拟环纹豹蛛毒腺总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.4 体外表达载体构建 |
| 1.5 pFastBac~(TM)1重组质粒的构建 |
| 1.6 pPICZ A和pPICZα A重组质粒的构建 |
| 1.7 pET32a和pLicC-MBP重组质粒的构建 |
| 1.8 昆虫杆状病毒表达系统-蛋白表达 |
| 1.9 毕赤酵母表达系统-蛋白表达 |
| 1.10 大肠杆菌表达系统-蛋白表达 |
| 1.11 目的蛋白的检测 |
| 1.12 融合蛋白的诱导表达 |
| 1.13 融合蛋白的纯化 |
| 1.14 融合蛋白的酶切 |
| 1.15 重组毒素的回收 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 真核表达载体pFastBac~(TM)1表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.2 真核表达载体pPICZ A表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.3 真核表达载体pPICZα A表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.4 原核表达载体pET32a表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.5 原核表达载体pLicC-MBP表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.6 融合蛋白PPTX-04的纯化及酶切 |
| 2.7 超滤管回收重组毒素 |
| 2.8 分子筛回收重组毒素 |
| 2.9 HisTrap Excel回收重组毒素 |
| 2.10 MBPTrap HP回收重组毒素 |
| 2.11 柱子联用回收重组毒素 |
| 2.12 重组毒素PPTX-22的制备 |
| 3 讨论 |
| 第四章 神经毒素PPTX-22的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 重组毒素的浓度测定 |
| 1.4 重组毒素生物活性测定 |
| 1.5 神经细胞的分离 |
| 1.6 钙离子成像 |
| 1.7 序列和数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 神经毒素PPTX-22序列分析 |
| 2.2 生物活性测定 |
| 2.3 重组毒素PPTX-22对细胞膜钙离子通道的影响 |
| 2.4 重组毒素PPTX-22对细胞器膜钙离子通道的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ 攻读学位期间发表的论文及申请的专利 |
| 附录Ⅲ 攻读学位期间获得的奖励 |
| 致谢 |
（6）大青杨PuHSFA4a转录因子调控高锌胁迫应答的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物修复 |
| 1.2.1 植物修复技术概述 |
| 1.2.2 植物修复原理 |
| 1.2.3 植物修复重金属污染土壤的进展 |
| 1.2.4 杨树修复重金属污染的研究进展 |
| 1.3 锌污染及对植物的伤害 |
| 1.3.1 锌污染来源及危害 |
| 1.3.2 过量锌对植物生长发育的影响 |
| 1.3.3 过量锌对植物生理生化的影响 |
| 1.4 植物在高锌胁迫下的生理和分子的响应机制 |
| 1.4.1 根系分泌物机制 |
| 1.4.2 细胞壁结合机制 |
| 1.4.3 外排和区域化隔离过量的锌离子机制 |
| 1.4.4 络合及螯合机制 |
| 1.4.5 氧化胁迫防卫机制 |
| 1.5 热激转录因子(Heat shock transcription factor,HSF)功能研究进展 |
| 1.5.1 HSF介绍 |
| 1.5.2 HSFs的调控作用 |
| 1.5.3 HSF与植物的抗逆性有关 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 大青杨PuHSFA4a基因和启动子的表达研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 药品和培养基的配置 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大青杨中A类PuHSFs基因在高锌胁迫下的表达模式 |
| 2.2.2 大青杨PuHSFA4a基因在各种非生物胁迫下的表达模式 |
| 2.2.3 PuHSFA4a启动子克隆及pBI121-ProPuHSFA4a-GUS载体的构建 |
| 2.2.4 PuHSFA4a启动子转基因大青杨的获得及鉴定 |
| 2.2.5 高锌胁迫条件及GUS染色方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 大青杨A类PuHSFs基因在高锌胁迫下的表达模式 |
| 2.3.2 大青杨PuHSFA4a基因在非生物胁迫下的表达模式 |
| 2.3.3 PuHSFA4a启动子的克隆及转基因株系的鉴定 |
| 2.3.4 PuHSFA4a启动子的时空表达 |
| 2.4 本章小结与讨论 |
| 3 大青杨PuHSFA4a基因的抗高锌功能研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 药品的配置 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PuHSFA4a基因的克隆及转录自激活分析 |
| 3.2.2 PuHSFA4a转录因子转录激活结构域的研究 |
| 3.2.3 PuHSFA4a过表达载体和抑制表达载体的构建 |
| 3.2.4 PuHSFA4a过表达和抑制表达转基因的获得及其鉴定 |
| 3.2.5 高锌胁迫下PuHSFA4a转基因组培苗的抗逆分析及生理生化指标测定 |
| 3.2.6 高锌胁迫下PuHSFA4a转基因土培苗抗逆分析及生理生化指标测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PuHSFA4a基因的克隆及结构分析 |
| 3.3.2 PuHSFA4a转录因子转录激活结构域的研究 |
| 3.3.3 PuHSFA4a过表达和抑制表达载体构建及转基因检测 |
| 3.3.4 高锌胁迫下PuHSFA4a转基因组培苗的表型观察及生理指标测定 |
| 3.3.5 高锌胁迫下PuHSFA4a转基因土培苗抗逆分析及生理生化指标测定 |
| 3.4 本章小结和讨论 |
| 4 大青杨PuHSFA4a调控下游基因的表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 常用试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 RNA的提取、反转录和检测 |
| 4.2.2 转录组的构建和测序 |
| 4.2.3 转录组数据与参考基因组序列比对 |
| 4.2.4 转录组文库质量评估 |
| 4.2.5 差异基因分析 |
| 4.2.6 qRT-PCR方法验证表达谱测序结果 |
| 4.3 结果和分析 |
| 4.3.1 转录组结果评估 |
| 4.3.2 差异基因分析及GO分析 |
| 4.3.3 qRT-PCR验证转录组结果 |
| 4.4 本章小结和讨论 |
| 5 PuHSFA4a下游靶基因PuGSTU17和PuPLA_2的鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 常用试剂 |
| 5.1.3 溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PuHSFA4a下游基因启动子上HSE元件预测 |
| 5.2.2 ChIP验证PuHSFA4a的下游靶基因 |
| 5.2.3 大青杨中PuGSTU17(1654 bp)和PuPLA_2(1673 bp)启动子克隆 |
| 5.2.4 酵母单杂(Y1H)实验 |
| 5.2.5 双荧光素酶(LUC)实验 |
| 5.2.6 凝胶迁移实验(EMSA)实验 |
| 5.2.7 高锌胁迫下PuHSFA4a转基因大青杨中PuGSTU17基因的表达 |
| 5.3 结果和分析 |
| 5.3.1 PuHSFA4a下游基因启动子上的HSE元件预测 |
| 5.3.2 ChIP确定PuHSFA4a下游靶基因 |
| 5.3.3 Y1H验证PuHSFA4a下游靶基因PuGSTU17和PuPLA_2 |
| 5.3.4 LUC验证PuHSFA4a下游靶基因PuGSTU17和PuPLA_2 |
| 5.3.5 EMSA验证PuHSFA4a下游靶基因PuGSTU17和PuPLA_2 |
| 5.3.6 高锌胁迫下PuHSFA4a转基因株系中PuGSTU17基因的表达 |
| 5.4 本章小结和讨论 |
| 6 PuGSTU17和PuPLA_2基因功能验证 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体与菌株 |
| 6.1.3 溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 PuGSTU17和PuPLA_2基因的克隆 |
| 6.2.2 PuGSTU17和PuPLA_2表达载体的构建 |
| 6.2.3 PuGSTU17和PuPLA_2转基因大青杨的鉴定 |
| 6.2.4 高锌胁迫下PuGSTU17转基因抗逆分析及生理生化指标测定 |
| 6.2.5 高锌胁迫下PuPLA_2转基因抗逆表型分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PuGSTU17和PuPLA_2基因的克隆 |
| 6.3.2 PuGSTU17抑制表达载体的构建 |
| 6.3.3 PuGSTU17和PuPLA_2表达载体转基因大青杨的鉴定 |
| 6.3.4 高锌胁迫下PuGSTU17转基因株系的抗逆分析及生理生化指标测定 |
| 6.3.5 高锌胁迫下PuPLA_2转基因抗逆分析 |
| 6.4 本章小结和讨论 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）抗寒种质鉴定及其抗寒机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 低温对植物的危害 |
| 2 植物抗寒机理 |
| 2.1 植物形态结构对低温的响应 |
| 2.2 植物生理生化对低温的响应 |
| 2.3 植物冷诱导基因的响应 |
| 3. 果树抗寒性鉴定方法 |
| 3.1 电解质渗出率法 |
| 3.2 组织细胞结构观察法 |
| 3.3 生长恢复法 |
| 3.4 生理生化指标测定法 |
| 3.5 综合评价法 |
| 4. 转录组、蛋白质组学及其在植物抗寒中的应用 |
| 4.1 转录组测序 |
| 4.2 转录组学在植物抗寒中的应用 |
| 4.3 蛋白质组学 |
| 4.4 蛋白质组学在植物抗寒中的应用 |
| 5. 枇杷抗寒研究进展 |
| 5.1 冻害影响因素研究 |
| 5.2 抗寒的细胞超微结构研究 |
| 5.3 抗寒生理生化研究 |
| 5.4 抗寒的冰核细菌研究 |
| 5.5 抗寒基因工程研究 |
| 6. 本文的研究目的、意义与主要研究内容 |
| 6.1 目的意义 |
| 6.2 主要研究内容 |
| 第二章 白肉枇杷种质资源抗寒性鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 不同低温胁迫下‘白玉’枇杷叶片REC的动态变化 |
| 2.2 不同处理时间对‘白玉’枇杷叶片REC的影响 |
| 2.3 Logistic方程及LT_(50) |
| 2.4 25个白肉枇杷品种的抗寒性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 枇杷对低温胁迫的生理变化 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 叶片可溶性蛋白含量在低温胁迫下的变化 |
| 2.2 叶片可溶性糖含量在低温胁迫下的变化 |
| 2.3 叶片MDA含量对低温胁迫的变化 |
| 2.4 叶片Pro含量对低温胁迫的变化 |
| 2.5 叶片花青素含量对低温胁迫的变化 |
| 2.6 叶片PAL活性对低温胁迫的变化 |
| 3. 讨论 |
| 第四章 低温胁迫下枇杷叶片转录组分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 植物材料处理 |
| 1.3 样品的制备、文库构建 |
| 1.4 转录组测序数据的预处理、分析与de novo组装 |
| 1.5 基因功能注释和预测编码蛋白框 |
| 1.6 Unigene表达量及样品相关性分析 |
| 1.7 差异表达基因筛选 |
| 1.8 差异表达基因的GO功能显着性富集分析 |
| 1.9 差异表达基因的Pathway富集性分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 枇杷叶片cDNA分析与测序质量评估 |
| 2.2 De novo拼接 |
| 2.3 枇杷叶片基因序列功能注释与分类 |
| 2.4 预测编码蛋白框 |
| 2.5 样品相关性分析 |
| 2.6 低温胁迫下枇杷叶片的差异表达分析 |
| 2.7 差异表达基因功能分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 大量基因参与了枇杷叶片冷胁迫反应 |
| 3.2 质膜代谢及基因与冷胁迫 |
| 3.3 信号传导途径及基因与冷胁迫 |
| 3.4 植物昼夜节律途径及基因与冷胁迫 |
| 3.5 植物病原体交互作用途径及基因与冷胁迫 |
| 3.6 次生代谢及基因与冷胁迫 |
| 第五章 枇杷抗寒ITRAQ蛋白组及与转录组的联合分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 植物材料处理 |
| 1.3 蛋白提取 |
| 1.4 酶切和除盐 |
| 1.5 iTRAQ标记和分组 |
| 1.6 LC-MS/MS质谱分析 |
| 1.7 数据和聚类分析 |
| 1.8 蛋白质生物信息学和功能注释 |
| 1.9 蛋白质组学与转录组学的相关性 |
| 1.10 关键基因qRT-PCR的检验 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 蛋白质鉴定 |
| 2.2 蛋白质定量分析 |
| 2.3 鉴定蛋白质功能注释 |
| 2.4 差异蛋白的富集分析 |
| 2.5 转录组和蛋白组的对比分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 冷胁迫下枇杷显着差异基因、蛋白共享的基因 |
| 3.2 D-山梨醇-6-磷酸脱氢酶在枇杷抗寒性中的作用 |
| 3.3 冷胁迫下花青素合成酶和相关基因的表达 |
| 第六章 枇杷CBF基因的克隆和表达分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 主要生化试剂、载体和菌株 |
| 1.3 总RNA的提取 |
| 1.4 DNA的消化和cDNA第一链的合成 |
| 1.5 3'RACE扩增 |
| 1.6 5'RACE扩增 |
| 1.7 序列生物信息学分析 |
| 1.8 枇杷EjCBF实时荧光定量PCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA的提取 |
| 2.2 EjCBF基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.3 枇杷EjCBF基因4℃低温处理叶片中的时空表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 枇杷CBF基因的克隆和序列分析 |
| 3.2 枇杷CBF基因对低温处理的响应 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
（8）拟南芥磷脂酶D调控生长素信号转导和应答盐胁迫的分子机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 植物耐盐性研究进展 |
| 1 土壤盐渍化 |
| 2 植物耐盐机制 |
| 3 提高植物耐盐途径 |
| 第二节 磷脂酶D信号转导参与植物耐盐过程 |
| 1 生长素运输与盐胁迫 |
| 2 盐胁迫下PLD改变生长素运输与分布 |
| 3 PLD及PA参与响应盐胁迫的蛋白激酶信号转导途径 |
| 4 PLD调控盐胁迫中的微管形态 |
| 5 磷脂信号和活性氧爆发 |
| 6 研究展望 |
| 第二章 来自PLD的PA通过PID调节拟南芥对盐胁迫的响应 |
| 第一节 拟南芥PLDs参与调控盐胁迫下植物根的伸长 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 PA通过PID激酶调节对盐胁迫的响应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 PA和PID互作调控生长素对盐胁迫的响应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 拟南芥的生长条件与处理 |
| 1.3 PIN2基因组DNA的提取和PCR鉴定 |
| 1.4 His-PN2CL蛋白和PA结合实验 |
| 1.5 蛙卵细胞内测定生长素转运实验 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 PIN2CL和PA结合 |
| 2.2 pin2突变体耐盐性降低 |
| 2.3 PA提高PID介导的PIN2转运生长素活性 |
| 2.4 盐胁迫下PID和PA的互作调控生长素的运输 |
| 3 讨论 |
| 第四章 全文结论和创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 读博期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）拟穴青蟹神经肽及其受体的发掘及sNPF生殖调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 神经肽研究概况 |
| 1.1.1 神经肽的种类 |
| 1.1.2 神经肽的生殖调控功能 |
| 1.1.3 神经肽的生殖调控方式 |
| 1.2 G蛋白偶联受体(GPCR)研究概况 |
| 1.2.1 GPCR的信号转导通路 |
| 1.2.2 GPCR的分类 |
| 1.2.3 甲壳动物神经肽GPCR的研究 |
| 1.3 短神经肽F (sNPF)研究概况 |
| 1.3.1 sNPF的发现与命名 |
| 1.3.2 sNPF受体的发现 |
| 1.3.3 sNPF生殖调控研究 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 拟穴青蟹脑神经节神经肽的发掘 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 cDNA模板的合成 |
| 2.2.3 转录组测序 |
| 2.2.4 生物信息学分析 |
| 2.2.5 神经肽转录本的组织分布分析 |
| 2.2.6 神经肽转录本在不同卵黄发生期的表达分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 神经肽的发掘:生物信息学分析和多肽预测 |
| 2.3.2 RT-PCR验证神经肽:组织分布 |
| 2.3.3 qRT-PCR验证神经肽:卵黄发生期表达谱 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 拟穴青蟹神经肽G蛋白偶联受体的鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 实验试剂和耗材 |
| 3.1.3 载体 |
| 3.1.4 细胞株 |
| 3.1.5 溶液配制 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2 cDNA模板的合成 |
| 3.2.3 生物信息学分析 |
| 3.2.4 配体-受体结合实验 |
| 3.2.5 青蟹GPCR的组织分布分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 转录组发掘 |
| 3.3.2 聚类分析 |
| 3.3.3 进化树分析 |
| 3.3.4 配体-受体结合实验 |
| 3.3.5 组织分布 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 拟穴青蟹短神经肽F (sNPF)生殖调控作用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 实验试剂和耗材 |
| 4.1.3 载体 |
| 4.1.4 细胞株 |
| 4.1.5 溶液配制 |
| 4.1.6 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA提取 |
| 4.2.2 cDNA模板的合成 |
| 4.2.3 sNPFR序列比对 |
| 4.2.4 配体-受体结合实验 |
| 4.2.5 sNPF和sNPFR在卵巢中的RNA原位杂交定位 |
| 4.2.6 RT-PCR检测sNPF和sNPFR在卵巢中的定位 |
| 4.2.7 卵母细胞内Ca~(2+)流检测 |
| 4.2.8 sNPF对卵母细胞成熟的作用 |
| 4.2.9 sNPF对卵黄蛋白原及其受体基因的影响 |
| 4.2.10 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 sNPFR序列比对及其在HEK293T细胞中表达 |
| 4.3.2 sNPFR被sNPF合成肽激活 |
| 4.3.3 sNPF和sNPFR mRNA在卵巢中的定位 |
| 4.3.4 sNPF介导卵母细胞Ca~(2+)流 |
| 4.3.5 sNPF对卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.6 活体注射sNPF对Vg和VgR基因表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究成果 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 不足之处 |
| 5.4 研究展望 |
| 在学期间参与的科研项目以及科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）过氧化物酶体上茉莉酸外运蛋白调控茉莉酸异亮氨酸和茉莉酮的内稳态（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 茉莉酸类物质的生物合成,代谢及信号转导 |
| 1.2 过氧化物酶体中代谢物的转运及其转运蛋白 |
| 1.3 茉莉酸类物质的转运蛋白及其功能 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 AtJAT2介导过氧化物酶体中JA外运功能分析 |
| 3.1 酵母系统中JA转运蛋白基因筛选 |
| 3.1.1 酵母转化子底物敏感性实验 |
| 3.1.2 酵母转化子~3H-JA吸收实验 |
| 3.2 AtJAT2组织和亚细胞定位及遗传分析 |
| 3.2.1 AtJAT2启动子活性时空特异性 |
| 3.2.2 AtJAT2蛋白亚细胞定位研究 |
| 3.2.3 AtJAT2对拟南芥育性的影响 |
| 3.3 AtJAT2介导过氧化物酶体中JA的外运功能及特性分析 |
| 3.3.1 AtJAT2介导过氧化物酶体中JA的外运 |
| 3.3.2 AtJAT2转运活性分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 AtJAT2调控细胞中JA-Ile的合成 |
| 4.1 AtJAT2对拟南芥中JA和JA-Ile含量的影响 |
| 4.1.1 拟南芥过氧化物酶体中JA和OPDA含量测定 |
| 4.1.2 拟南芥细胞中JA、OPDA和JA-Ile含量测定 |
| 4.2 AtJAT2参与调控JAZ-GFP蛋白降解 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 AtJAT2参与调控JA信号转导 |
| 5.1 AtJAT2调节JA响应基因的表达 |
| 5.2 AtJAT2调节伤害部位JA响应基因表达 |
| 5.3 AtJAT2调节伤害部位细胞中JA和JA-Ile含量 |
| 5.4 AtJAT2影响拟南芥对病原菌的抗性 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 ATJAT2参与调控CJ的产生 |
| 6.1 AtJAT2调控细胞中CJ的合成 |
| 6.1.1 AtJAT2调控拟南芥细胞中CJ含量 |
| 6.1.2 opr3突变体中CJ含量分析 |
| 6.1.3 AtJAT2调控CJ响应基因的表达 |
| 6.1.4 AtJAT2调控桃蚜的趋避 |
| 6.2 CJ抑制ATJAT2启动子活性和表达 |
| 6.3 小结 |
| 第七章 讨论、结论和展望 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、胞液型磷脂酶A_2cDNA与载体PRCCMV连接及表达（论文参考文献）
- [1]紫花苜蓿响应石墨烯材料的表达谱分析及其分子机制[D]. 陈钊. 西北农林科技大学, 2021
- [2]鲤鱼Group Ⅲ分泌型磷脂酶A2的原核表达及磷脂酶活性测定[D]. 王钦. 南京农业大学, 2019(08)
- [3]H3K4me2协同Wnt信号调节Lin28促进鸡PGCs形成的机制研究[D]. 王曼. 扬州大学, 2019
- [4]低温胁迫下菊花叶转录组联合测序分析及DgMYB1基因的克隆与功能鉴定[D]. 何玲. 四川农业大学, 2019(01)
- [5]拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究[D]. 黄立鑫. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]大青杨PuHSFA4a转录因子调控高锌胁迫应答的机理研究[D]. 张海珍. 东北林业大学, 2019
- [7]枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）抗寒种质鉴定及其抗寒机制[D]. 娄晓鸣. 南京农业大学, 2018(02)
- [8]拟南芥磷脂酶D调控生长素信号转导和应答盐胁迫的分子机理[D]. 王培培. 南京农业大学, 2018(02)
- [9]拟穴青蟹神经肽及其受体的发掘及sNPF生殖调控作用研究[D]. 包臣昌. 厦门大学, 2018(08)
- [10]过氧化物酶体上茉莉酸外运蛋白调控茉莉酸异亮氨酸和茉莉酮的内稳态[D]. 王立建. 中国农业大学, 2017(05)