一、粘虫NPV在同源胚胎细胞系内的形态发生及宿主细胞的病理变化（论文文献综述）
王晓庆[1]（2021）在《茶毛虫的发生规律及其感染的病毒分析》文中进行了进一步梳理茶毛虫Euproctis pseudoconspersa是一种重要的茶树害虫,近年来由于茶园用药量逐步减少,其在局部茶园发生严重。茶毛虫的幼虫不仅取食为害茶树造成产量受损,而且极易引起人体红肿痛痒,给茶园生产管理带来诸多不便。区域性的环境差异导致茶毛虫不同种群的发生规律不尽相同,构建基于全国茶毛虫监测数据的预测预报方法可指导对其适时防控。茶毛虫核型多角体病毒是其重要的天敌病原物,茶毛虫种群密度过高极易引起病毒病的流行,病毒对其可起到很好的控制效果,但是病毒的调控作用在田间具有滞后现象,且病毒株系间存在毒力差异。因此,通过不断收集病毒资源,对有效控制不同区域的茶毛虫具有储备防控资源的意义。此外,随着高通量测序技术的发展,昆虫体内越来越多的RNA病毒得以挖掘。本学位论文针对茶园新的栽培制度和管理模式,以及茶毛虫发生规律不明和病毒挖掘深度不够的问题,紧密围绕茶毛虫在茶园的生态位、发生规律、预测预报以及DNA病毒和RNA病毒的挖掘展开展研究,以期为茶毛虫绿色防控技术的研发提供理论支撑。主要研究结果如下:1茶毛虫发生规律及种群遗传多样性研究基于田间调查和分析茶园（重庆永川）主要鳞翅目害虫的种间竞争关系发现,茶毛虫与茶细蛾（Caloptilia theivora）在茶树空间分布上以及与褐蓑蛾（Mahasena colona）在时间分布上重合度均较低,种间影响较小;但茶毛虫与淡黄刺蛾（Darna trima）和茶刺蛾（Iragoides fasciata）在树冠层次及发生期均有重合,其中与淡黄刺蛾在时间和空间生态位的竞争较大。对全国4个茶区（广东清远、江苏无锡、河南信阳和重庆永川）田间监测发现,茶毛虫在所监测区域一年发生3～4代,其中在广东清远的发生代数最多（4代）。基于上述4个茶区的监测数据,采用逐步判别法筛选出3月最高温度、2月上旬平均温度、1月降水量和3月下旬平均湿度等4个影响茶毛虫发生程度的关键气象因子,以及1月中旬和2月上旬的降水量等2个影响茶毛虫发生高峰期的关键气象因子,并构建出Fisher’s判别函数,判别准确率分别为33.3%和66.7%。通过测定全国7个市（区）茶毛虫样本的线粒体COI和ND5基因,解析茶毛虫不同地理种群遗传多样性及分化程度。研究结果显示,茶毛虫种群间遗传分化程度较高,基因交流较弱;而种群内部相对保守,突变位点少,遗传多样性较低,且种群间的遗传分化在茶毛虫的进化中起决定性的作用。2茶毛虫和淡黄刺蛾DNA病毒鉴定及毒力评价采集茶毛虫及与其生态位竞争剧烈的淡黄刺蛾感染病毒的样品,通过分子生物学和电子显微镜技术鉴定出3株茶毛虫核型多角体病毒（Ep NPV）和1株淡黄刺蛾颗粒体病毒（Datr GV）,其中Datr GV基因组信息尚未报道。通过测序及序列分析发现,Datr GV基因组全长为103,846 bp,拥有118个ORFs,占整个基因组90.5%。基于38个核心（保守）蛋白联配的昆虫杆状病毒构建的发育树和共线性分析发现,Datr GV和菜粉蝶颗粒体病毒（Pr GV）序列相似度最高。在Datr GV基因组中有10个特有的ORFs,存在18个直向重复同源区序列,且同一段序列有不同重复组合序列的现象。测定2株Ep NPV对茶毛虫不同种群的毒力发现,不同株系的病毒对茶毛虫不同种群的毒力存在差异,但无某一株系对茶毛虫所有种群的毒力明显高于另一株系的现象。Datr GV对淡黄刺蛾宿主本身的毒力较强,对扁刺蛾和茶刺蛾亦具有一定的毒力。值得注意的是,Datr GV可增强Ep NPV对茶毛虫的毒力。3茶毛虫RNA病毒鉴定及其感染频率和遗传分化基于高通量测序技术及生物信息学分析,鉴定获得1株茶毛虫负单链RNA病毒（布尼亚病毒,Ep BYV）。进一步分析发现Ep BYV衍生的小RNA信号较强,在20 nt处出现最高峰值,且在整个病毒基因组上呈现均匀对称分布,说明该病毒可在宿主体内复制并诱发宿主体内的RNAi抗病毒免疫反应。基于转录组测序数据和PCR检测病毒感染频率发现,Ep BYV在茶毛虫种群中的感染频率较高。基于Rd Rp序列的种群遗传分化分析发现,Ep BYV在茶毛虫6个种群中具有一定的遗传分化,且其分化主要源于种群之间,其次来自种群内部的变异。4茶毛虫响应Ep NPV及Ep BYV侵染的免疫通路基因鉴定及分析分别构建了茶毛虫、灰茶尺蠖（Ectropis grisescens）、油桐尺蠖（Buzura suppressaria）、茶细蛾、褐蓑蛾、茶刺蛾6种茶树鳞翅目害虫的转录组,鉴定和注释上述害虫的免疫通路关键基因。结果共鉴定获得244个免疫相关基因,其中RNAi通路18个,Imd通路74个,Jak-Stat通路30个以及Toll通路122个。仅Toll基因及SPZ基因出现部分扩张或收缩。构建Ep NPV接种处理及高、低Ep BYV含量的茶毛虫幼虫的转录组,分别获得168个和235个差异表达基因。进一步分析发现接种Ep NPV后茶毛虫幼虫的热激蛋白及部分表皮蛋白等免疫基因上调,而分析高、低Ep BYV含量的茶毛虫幼虫的差异免疫基因发现,E3泛素蛋白连接酶Ufd4、滞育素A4、羧酸酯酶6、黄蛋白、肌腱蛋白X和组织蛋白酶D-H基因的表达发生显着变化。综上所述,本学位论文主要以茶毛虫为研究对象,通过监测研究发现其在所监测范围的4个茶区一年发生3～4代,并构建了Fisher’s判别函数预测茶毛虫第一代幼虫发生程度和发生高峰期;同时发现茶毛虫与淡黄刺蛾在茶园的生态位竞争最强,收集鉴定这2种害虫的DNA病毒,且对其自身宿主的毒力均较强,同时淡黄刺蛾颗粒体病毒可增强茶毛虫核型多角体病毒对茶毛虫的毒力;基于转录组数据鉴定出1种茶毛虫布尼亚病毒,且其在茶毛虫田间种群感染频率较高并存在种群间遗传分化;解析了茶毛虫响应茶毛虫核型多角体病毒和布尼亚病毒的免疫差异基因。上述研究结果为茶毛虫绿色防控提供了新思路,对茶毛虫的高效防控以及减少化学农药的施用具有重要的指导价值。
贾文茜[2]（2021）在《黑尾叶蝉感染水稻矮缩病毒后唾液腺转录组变化分析及其两种RNA病毒基因组结构分析》文中研究指明病毒普遍存在于生物体中,极具生态和基因组多样性。昆虫作为地球上已知数量和种类最为丰富的生物类群,是多种病毒的寄主,也是虫媒病毒的重要介体。而相较于已知昆虫和潜在的病毒数量,目前对昆虫病毒的了解还远远不足。近些年来,测序技术的发展加速了昆虫病毒的发现与鉴定,使越来越多的病毒从无症状感染的昆虫宿主中被鉴定出来。黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps是亚洲地区常见的水稻害虫,可以传播多种水稻病毒,如水稻矮缩病毒（rice dwarf virus,RDV）。为探究黑尾叶蝉与RDV的关系,本研究在黑尾叶蝉RDV感毒与未感毒唾液腺转录组分析基础上,选择了差异表达的ML（MD-2-related lipid-recognition）基因,并在载量变化较大的病毒中各选取了一种正链和负链RNA病毒进行了系列研究。主要研究结果如下:1.黑尾叶蝉RDV感毒与未感染唾液腺转录组比较分析通过对RDV感毒与未感毒的黑尾叶蝉唾液腺进行转录组比较分析,发现在感染RDV后共有622个差异表达的基因,其中342个基因表达上调,280个基因下调,对差异基因进行富集分析。选择82个差异基因进行验证,其中52个昆虫基因和10个病毒相关序列通过定量PCR得到确认。相关病毒序列c12476g1、c13775g1、c31720g1和c84382g1在感染RDV后表达水平上升,c31757g1、c44831g1、c53292g1、c57866g1、c57866g2和c18405g1表达下降。2.黑尾叶蝉ML基因鉴定及ML蛋白与RDV互作检验对黑尾叶蝉的ML基因进行鉴定,共发现6个ML基因。选择NcML1、NcML2和NcML6基因进行多序列比对和系统进化树分析,并对其编码的蛋白序列进行三级结构建模。使用q PCR对3个NcML基因在不同组织、不同时期的表达模式进行检测,发现在脑中NcML最为丰富,尤其是NcML6基因。使用酵母双杂交、Pull-Down分别验证NcML1、NcML2和NcML6蛋白是否与RDV病毒蛋白互作,结果显示NcML6蛋白与RDV的Pns6、P8和Pns12蛋白互作结果呈阳性。为了解NcML6基因潜在的功能,对黑尾叶蝉进行RNA干扰。NcML6基因干扰效果良好,但并未引发任何症状。3.一种新型黑尾叶蝉iflavirus病毒基因组结构与传播模式研究对Nephotettix cincticeps positive-stranded RNA virus-1（NcPSRV-1）病毒基因组序列做进一步确认和分析。该病毒基因组长10,524核苷酸（nucleotide,nt）,不计入poly（A）尾,包含一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,该ORF编码一个含3,192个氨基酸（amino acid,aa）的多聚蛋白（polyprotein）。在ORF两侧为5’和3’非编码区（untranslated regions,UTR）。病毒NcPSRV-1具有典型的iflavirus基因组结构,在进化树分析中与Iflaviridae病毒科成员聚类在一起。NcPSRV-1在黑尾叶蝉种群中可进行水平传播和垂直传播。在实验室种群中NcPSRV-1的感染率和病毒载量（viral load）随时间不断增加,维持在较高水平。NcPSRV-1可以侵染黑尾叶近缘种二条黑尾叶蝉N.apicalis,以及黑尾叶蝉的寄生蝇黄足头蝇Pipunculus multillatus,目前尚未有证据显示可以侵染电光叶蝉Recilia dorsalis和水稻Oryza sativa variety TN1。持续RDV感染可改变实验室种群NcPSRV-1的感染率和病毒载量,对NcPSRV-1的增殖抑或传播有一定的拮抗作用。而高NcPSRV-1带毒量的黑尾叶蝉其RDV感毒和传毒的能力逊于NcPSRV-1阴性叶蝉。4.一种新型黑尾叶蝉rhabdovirus病毒基因组结构与进化分析对病毒Nephotettix cincticeps negative-stranded RNA virus-1（NcNSRV-1）基因组序列做进一步确认,获得全长12,361 nt,两端为非编码的3’leader和5’trailer。病毒反义正链的基因组包含5个主要的结构蛋白基因,依次为N、P、M、G和L,是典型的Rhabdoviridae病毒科基因组结构。在G和L基因间,有一个additional gene,命名为P6,该基因具有独立的转录单元,编码一个功能未知的蛋白。系统进化上,NcNSRV-1与昆虫中发现的未分类rhabdovirus病毒聚集在一起,且与其他rhabdovirus病毒在蛋白序列一致性上并不高。转录调节序列一般较为保守,而NcNSRV-1病毒中发现的转录起始序列不同于已分类的rhabdovirus病毒。考虑到进化关系、序列一致性和基因组结构,NcNSRV-1较有可能是昆虫rhabdovirus病毒。目前NcNSRV-1病毒未能在实验室种群中长期维持,可能与宿主或传播途径的缺失有关。
刘太行[3]（2017）在《家蚕基质金属蛋白酶家族MMPs及组织金属蛋白酶抑制剂TIMP在家蚕中的功能研究》文中指出昆虫在长期的进化过程中对多变的环境具备了高度的适应能力,这与其神奇的变态发育过程和高效的先天性免疫体系密不可分。加强昆虫变态发育及免疫机制的研究,对拓展昆虫资源的利用和害虫的绿色防控等有重要的现实意义。同时,可为研究人类干细胞分化、组织器官的形成及免疫机制提供重要线索。基质金属蛋白酶家族（Matrix metalloproteinase family,MMPs）是参与昆虫变态发育调节和先天性免疫应答的一类重要的锌依赖性内肽酶。该家族成员几乎能够降解所有种类的细胞外基质,在生物体多种生理和病理过程中起重要作用,如组织重塑、器官发育、炎症调节、免疫应答、细胞凋亡、创伤修复及肿瘤的侵袭和转移等。组织金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs）是MMPs内源性的蛋白抑制因子,能够结合MMPs并抑制其降解活性,在维持细胞外基质稳态中起重要作用。然而,对果蝇以外其它昆虫的MMPs和TIMPs功能研究较少。同时,在不同昆虫中MMPs和TIMPs的数目和功能也存在极大差异。因此,全面、深入解析这两个家族在昆虫中的作用具有重要意义。鉴于此,本研究以家蚕（Bombyx mori）为模式,研究了家蚕BmMMPs家族和BmTIMP表达特征;在体内和体外利用基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除技术,探究了BmMMPs家族和BmTIMP在家蚕抵抗家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus,BmNPV）和家蚕变态发育中的作用;通过对BmMMPs家族的转录调控研究及互作蛋白的鉴定,阐明BmMMPs家族作用的分子机制。通过该研究,可为揭示BmMMPs和BmTIMP在家蚕变态发育及先天性免疫中的作用提供实验依据和理论支撑。论文的主要实验结果和结论如下:1.BmMMPs和Bm TIMP基因的鉴定及表达特征分析本研究在家蚕基因组中鉴定出3个mmps家族基因,其中一个基因包含两种剪切体,分别命名为bmmmp1a、bmmmp1b、bmmmp2和bmmmp3。同时鉴定到1个timp基因,命名为bmtimp。通过序列分析发现,家蚕mmp家族基因均包含mmp家族典型的结构特征,前肽区（pro-peptide）、催化结构域（catalyticdomain）、铰链区（hingeregion）及血红素蛋白类似区域（hemopexin-likec-terminaldomain）。系统发生分析发现家蚕mmp家族聚类于昆虫mmps家族一支。bmtimp包含timp家族典型的ntr结构域,且系统发生分析显示其同样与昆虫timp家族聚为一支。家蚕各发育时期的表达特征分析发现,bmmmps和bmtimp在化蛹第一天有高量表达;在五龄三天,bmmmp1、bmmmp3和bmtimp在中肠和脂肪体中高量表达,bmmmp2在血液有高量表达。通过免疫荧光和蛋白截短实验对家蚕mmps家族和timp的亚细胞定位模式进行分析发现,bmmmp1a&b和bmmmp2的全蛋白及预测跨膜区域的截短蛋白均定位于细胞质中;bmmmp3的全蛋白定位于细胞质中,预测的核定位信号区域定位于细胞核中,bmmmp3催化结构域的n端影响了其核定位信号正常行使功能;bmtimp具有信号肽区域,其蛋白部分定位于细胞质中,部分分泌到细胞外。探究了家蚕mmps家族基因和timp在不同抗原刺激下的表达模式,结果显示,在bmnpv病毒感染家蚕体外细胞系和体内中肠、血液、脂肪体的过程中,bmmmps和bmtimp在bmnpv病毒感染前期均出现显着上调表达,随后表达量下调,在感染后期出现极高量表达;在利用lps和大肠杆菌刺激家蚕体外细胞系或体内中肠、血液、脂肪体的过程中,bmmmps和bmtimp均有显着诱导上调表达趋势。上述结果表明,bmmmps和bmtimp在表达模式上具有一定的协同性;bmmmps和bmtimp可能参与调控家蚕的变态发育及先天性免疫。2.bmmmps和bmtimp的相互作用鉴定本部分通过双荧光共定位、荧光双分子互补实验（bifc）及免疫共沉淀实验（co-ip）,分析了bmmmp1a、bmmmp2和bmmmp3三个蛋白与bmtimp蛋白之间的相互作用关系。双荧光共定位结果显示,bmmmps均能分别与bmtimp共定位于细胞质中;bifc结果显示,bmmmps都能与bmtimp发生相互作用,并且都聚集于细胞质中;co-ip实验结果显示,bmmmp1s分别与bmtimp之间同样存在特异性的相互作用。上述结果表明,家蚕mmps家族三个蛋白与timp都具有相互作用,推测bmtimp可能通过直接结合bmmmps抑制其活性。3.bmmmps和bmtimp对bmnpv侵染的影响本部分通过在体外家蚕细胞系bmns-swu1中分别创制bmmmps和bmtimp基因的过表达及crispr/cas9基因敲除模型,在体外水平探索bmmmps和bmtimp对bmnpv侵染的影响。结果显示,bmmmps基因过表达和bmtimp基因敲除可以显着增强bmnpv的增殖复制;bmmmps基因敲除和bmtimp基因过表达可以显着抑制bmnpv的增殖复制。同时,利用iv型胶原（collagen-iv）降解实验、mmps的广谱性抑制剂bb-94、gm6001和bmmmps蛋白活性区域截短实验,进一步探究了家蚕mmps活性对bmnpv病毒侵染的影响。结果显示,过表达bmmmp1a、bmmmp2和bmmmp3的截短活性区域均能够增强家蚕细胞对collagen-iv的降解;bb-94和gm6001能够显着抑制bmnpv的增殖复制;相对于bmmmps全蛋白,其截短活性区域能显着增强bmnpv的在家蚕细胞中的增殖复制。上述结果表明,bmmmps可能以活性形式参与调控bmnpv病毒的增殖复制。4.转基因过表达bmmmp3和bmtimp对bmnpv增殖及家蚕变态发育的影响利用显微注射技术创制了bmmmp3和bmtimp过表达家蚕品系,在体内水平探究bmmmp3和bmtimp对bmnpv增殖及家蚕变态发育的影响。通过对转基因品系的表型统计和bmnpv感染后的致死率和病毒关键基因分析,发现bmmmp3过表达品系相对于正常品系表现为体型增大、体重增加,且bmnpv在bmmmp3-oe品系中的感染能力被显着增强;bmtimp过表达品系具有发育迟缓、幼虫期全部致死及不能正常上簇等表型。这些结果表明,bmmmp3和bmtimp能够参与调控家蚕的生长发育;在体内过表达bmmmp3能够显着增强bmnpv的增殖复制。5.转基因敲除bmmmps家族基因对bmnpv增殖及家蚕变态发育的影响利用crispr/cas9的基因编辑技术和转基因技术相结合的方法,创制了单独过表达cas9蛋白的转基因家蚕品系cas9-oe,以及单独过表达sgrna靶标序列的转基因家蚕品系bmmmp1-sgrna、bmmmp2-sgrna和bmmmp3-sgrna共4种转基因品系。随后,利用cas9-oe与bmmmps-sgrna杂交敲除目的基因的方法,获得mmps基因特异性敲除的三个杂交敲除品系bmmmp1-ko、bmmmp2-ko和bmmm3-ko。通过对bmmmps-ko品系生长发育过程的表型统计分析,结果发现,bmmmp1-ko出现发育迟缓、幼虫和蛹期致死,影响气管的延伸和分枝。bmmmp2-ko具有发育迟缓、蛾期生存活力不高、不能正常交配,雌蛾下颚和侧胞保持凸出、被毛易脱落、腹部积水、卵发育异常及马氏管发育异常等多种表型,雄蛾除不具有侧胞保持凸出和卵发育异常外,其它与雌蛾表型一致。bmmmp3-ko品系具有发育迟缓、幼虫期致死、蛾期活力不高、雌蛾不能产卵等表型。同时,将bmnpv病毒利用口服和注射的方法感染家蚕bmmmps-ko杂交敲除品系和正常品系,结果发现,bmmmps-ko杂交敲除品系能够显着抑制vp39基因的转录。上述结果进一步表明,BmMMPs在家蚕的变态发育和调控BmNPV侵染中起重要作用。6.BmMMPs和BmTIMP作用机制的探究及相互作用蛋白的鉴定通过在家蚕细胞中单独过表达BmNPV增殖关键基因IE1、FGF、GP64和VP39,检测对BmMMPs和BmTIMP的转录水平的影响。结果发现,除VP39未检测到显着诱导外,IE1、FGF、GP64都对BmMMPs和BmTIMP具有一定的诱导活性。基于BmMMPs和BmTIMP在表达模式上具有很高的一致性,通过在家蚕细胞中单独过表达BmMMPs和BmTIMP各个基因,探究其是否存在相互调控关系,结果发现,BmMMPs和BmTIMP之间均具有相互诱导活性。同时发现在家蚕细胞中过表达BmMMPs可以显着诱导Caspase3、7和9的活性,敲除BmMMPs可以抑制Caspase3、7和9的活性。上述结果进一步暗示了,BmMMPs和BmTIMP参与家蚕抵御BmNPV侵染的调控;BmMMPs和Bm TIMP之间可能存在相互调控关系。通过免疫共沉淀的方法,并借助质谱分析技术,分别以BmMMP1a和BmMMP3为诱饵蛋白,从家蚕BmN-SWU1细胞中筛选并鉴定到6个与BmMMP1a互作的蛋白,6个与BmMMP3互作的蛋白。经初步验证发现,ATP synthase与BmMMP1a存在相互作用;PP6与BmMMP3存在相互作用。这些结果暗示了,BmMMPs可能与能量代谢息息相关,BmMMP3可能与PP6互作共同参与调控细胞生理活动。综上所述,BmMMPs和BmTIMP同时在家蚕抵御BmNPV病毒侵染的先天性免疫中和家蚕的变态发育过程中起着重要的作用,此研究不仅为全面解析家蚕BmMMPs和BmTIMP基因功能奠定了坚实的基础,同时也为家蚕先天性免疫及变态发育研究提供了新的线索。
李喜升[4]（2016）在《核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析》文中认为柞蚕（Antheraea pernyi Guerin-Meneville,1855）属大蚕蛾科柞蚕属的泌丝昆虫,是一种重要的经济昆虫,同时也是重要的模式昆虫。柞蚕幼虫全龄在野外柞园中饲养,其幼虫生长发育极易受到野外环境条件包括柞树叶质、气候环境因素以及多种病原微生物等影响,导致柞蚕病害的发生。研究表明,因柞蚕因病害造成的减产在20%-30%,柞蚕病害已成为制约柞蚕产业发展的主要影响因素之一。其中,柞蚕脓病是柞蚕生产上的主要病害,其病原为柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi nucleopolyhedro-virus, ApNPV）,该病在世界养蚕业国家常有爆发,传染性极强,不易控制,在生产上危害最为严重,常造成巨大的经济损失。ApNPV感染既取决于自身的表型差异,又与宿主本身生理状况有关,是病原与宿主相互作用的过程。ApNPV入侵宿主体内后,利用宿主体内内环境中的营养物质完成自身的复制、增殖并释放。而柞蚕体内存在的免疫屏障面对病毒的入侵,会开启防御机制,通过细胞内的特异性变化来抵御病毒的增殖,这种变化首先体现在基因水平上,因此研究ApNPV感染后宿主基因的表达差异,可以从分子水平了解ApNPV侵染后宿主生理反应的分子生物学机制,对于阐明柞蚕被ApNPV感染后体内免疫相关基因的表达及调控模式具有重要意义,为进一步利用柞蚕免疫相关基因资源及利用分子生物学方法辅助抗病育种等奠定了基础。研究结果如下：1.柞蚕感染ApNPV后中肠转录组分析结果采用4.05×106多角体/mL的ApNPV对柞蚕3龄幼虫经口添食,提取经显微镜下确认ApNPV感染柞蚕幼虫中肠组织进行转录组分析,建立了ApNPV感染柞蚕的转录组数据库,为分析ApNPV感染后柞蚕基因表达规律提供了基础数据库。总共在ApNPV感染的柞蚕中肠中得到5,172个差异表达基因,包括2,183个上调基因和2,989个下调基因。生物信息学分析表明,筛选到参与柞蚕免疫反应的差异基因主要分为以下几类：与细胞凋亡相关的基因、热激蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶和细胞色素P450。对这些基因的分析为进一步探究宿主应对病毒感染的免疫分子机制提供了理论基础。2.柞蚕免疫相关基因—鸟苷三磷酸酶基因（ApGTPase）的克隆与表达在柞蚕感染ApNPV的转录组数据库中筛选到了表达量上调的柞蚕鸟苷三磷酸酶基因,利用生物信息学方法对该基因的氨基酸序列进行结构分析以及功能预测,半定量PCR技术检测了鸟苷三磷酸酶基因在柞蚕不同发育时期的表达谱,通过对柞蚕4龄幼虫分别经口添食柞蚕核型多角体病毒、柞蚕微孢子虫（Nosema pernyi）、柞蚕链球菌（Streptococcus pernyi）3种病原物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同外源物刺激作用下,鸟苷三磷酸酶基因在不同时间段的相对表达量变化趋势,结果表明：柞蚕鸟苷三磷酸酶基因（ApGTPase）开放阅读框ORF长度1194 bp,编码397个氨基酸,推测其蛋白的等电点（pI）6.64,蛋白分子量（Mw）为44.6 kDa。与家蚕（Bombyx mori）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的鸟苷三磷酸酶氨基酸序列相似度分别为95%,93%,93%,78%,表明该基因与同样来自鳞翅目昆虫的家蚕、棉铃虫和柑橘凤蝶的同源相似度较高,而与双翅目的黑腹果蝇相似度较低。在不同病原物诱导后的柞蚕中肠组织中鸟苷三磷酸酶基因的相对表达量有不同程度的升高,并普遍高于对照组（无菌水处理组）的相对表达水平,表明鸟苷三磷酸酶可能参与了柞蚕的免疫防御反应,可以作为柞蚕免疫基因资源利用。3.柞蚕免疫相关基因—脂肪酶基因（Aplipase）的克隆与表达分析根据柞蚕感染核型多角体病毒的转录组数据库,设计特异引物,克隆得到柞蚕脂肪酶基因（Aplipase）,对该基因的氨基酸序列进行结构分析以及功能预测,半定量PCR技术构建了脂肪酶基因在柞蚕不同发育时期的表达谱；通过对柞蚕4龄幼虫分别经口添食柞蚕核型多角体病毒、柞蚕微孢子虫、柞蚕链球菌3种病原物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同外源物刺激作用下,柞蚕脂肪酶基因在不同时间段的相对表达量变化趋势。结果表明克隆得到柞蚕脂肪酶基因（Aplipase）的cDNA序列,已知其开放阅读框ORF长度为1527bp,编码508个氨基酸。BLASTp比对可知,柞蚕脂肪酶基因与鳞翅目昆虫家蚕、大红斑蝶（Danaus plexippus）、柑橘凤蝶的脂肪酶基因同源序列相似度为79%左右。半定量PCR结果显示,脂肪酶基因在柞蚕5龄幼虫的脂肪体组织的表达水平较高；不同病原物经口添食柞蚕4龄幼虫,实时荧光定量PCR技术检测添毒后72 h内脂肪体中脂肪酶转录水平变化,柞蚕脂肪酶基因在柞蚕核型多角体病毒和白僵菌诱导条件下,转录水平变化趋势最显着,说明柞蚕脂肪酶基因在外源病原物的诱导下高表达,推测该基因产物与柞蚕的免疫防御有光,可以利用该基因或基因产物进行柞蚕免疫方面的研究。以上研究结果为深入理解ApNPV感染柞蚕后分子水平所发生的变化,揭示柞蚕-ApNPV之间的互作机制奠定了理论基础；对于更进一步研究柞蚕对不同病原物的免疫机制具有重要意义,参考免疫相关基因的表达水平可为抗性品种的选育提供理论指导。
郑桂玲[5]（2010）在《鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立和高蛋白表达细胞克隆株的研究》文中提出自1962年成功建立传代昆虫细胞系以来,昆虫细胞系已广泛地应用于生物学、农业和医学等领域,其中鳞翅目昆虫细胞系应用最为广泛,特别是随着杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression victor system,BEVS）的发明,使昆虫细胞在重组蛋白生产、工程疫苗和蛋白组学等领域得到了越来越多的应用,被认为是有巨大开发潜力的新型生物反应器。因此,建立新型昆虫细胞系、筛选用于病毒和重组蛋白生产等方面更加理想的细胞系,将具有重要的理论意义和实践价值。本文以重要农业害虫-棉铃虫（Helicoverpa armigera）和粘虫（Mythimna separata）为材料建立新细胞系,并对其生物学特性进行研究,丰富了有限的昆虫细胞系资源,为离体条件下进行昆虫生理生化、杆状病毒感染和细胞凋亡机制的研究提供实验材料;同时对本实验室建立的高产悬浮性粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎细胞系QB-Tn9-4s进行克隆,从中筛选高蛋白表达的克隆株,进行无血清培养驯化,并阐明其生物学特性,为昆虫细胞这一新型生物反应器的深入研究和开发奠定基础。1.由棉铃虫胚胎组织建立了两株细胞系,分别命名为QB-Ha-E-1和QB-Ha-E-5,在含10%胎牛血清的TNM-FH培养基中已传代60余代。两株细胞系均以圆形和短梭形细胞为主;DAF和RAPD鉴定结果表明两株细胞系均来源于棉铃虫胚胎;染色体均为典型的鳞翅目昆虫细胞染色体特征;QB-Ha-E-1和QB-Ha-E-5的第30代细胞群体倍增时间分别为63.7 h和66.9 h。两株细胞系均能被棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）感染,4 d的感染率分别为86.6%和56.5%;对甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae）核型多角体病毒（MbNPV）7 d的感染率均为15%左右;但对苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）核型多角体病毒（AcMNPV）侵染的反应不同,DAPI染色和基因组DNA电泳结果表明,AcMNPV可诱导QB-Ha-E-5细胞发生凋亡,极少数细胞内可形成病毒多角体,但不能诱导QB-Ha-E-1细胞发生凋亡,其感染率为55.3%,两株细胞系均可被1.25μg/mL的放线菌素D诱导发生凋亡。2.由粘虫胚胎组织建立了四株细胞系,分别命名为QB-Ms-E-1、QB-Ms-E-2、QB-Ms-E-3和QB-Ms-E-4,在含10%胎牛血清的TNM-FH培养基中已传代50余代。四株细胞系均以圆形和短梭形细胞为主;DAF和RAPD鉴定结果表明四株细胞系均来源于粘虫胚胎;染色体均呈典型的鳞翅目昆虫细胞染色体特征;QB-Ms-E-1、QB-Ms-E-2、QB-Ms-E-3和QB-Ms-E-4的群体倍增时间分别为44.9 h、46.6 h、46.5 h和47.1 h。四株细胞系均能被同源的粘虫核型多角体病毒（MsNPV）感染,7 d的感染率分别为56.6%、53.6%、49.3%和62.5%;对MbNPV 10 d的感染率均在5%以下;但对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）都很敏感,4 d的感染率均在90%以上。3.对粉纹夜蛾胚胎细胞系QB-Tn9-4s进行克隆获得了9个克隆株,分别命名为克隆株QB-Tn-Ⅰ、QB-Tn-Ⅱ、QB-Tn-Ⅲ、QB-Tn-Ⅳ、QB-Tn-Ⅴ、QB-Tn-Ⅵ、QB-Tn-Ⅶ、QB-Tn-Ⅷ和QB-Tn-Ⅸ。对各克隆株基因组DNA进行RAPD鉴定,结果表明各克隆株与原始细胞系QB-Tn9-4s具有相同的DNA扩增谱带。病毒侵染试验表明,各克隆株对AcMNPV均很敏感,感染率都在87%以上,平均每个细胞病毒多角体产量在70～87个之间,其中克隆株QB-Tn-Ⅰ的多角体产量最高（86.7±1.5 OBs/cell）,高于对照BTI-Tn5B1-4和原始细胞QB-Tn9-4s的多角体产量,是Sf-9多角体产量的2.8倍。比较各细胞第6 d重组蛋白β-半乳糖苷酶（β-gal）的表达量,克隆株QB-Tn-Ⅴ的表达量最高（3.06×104 IU/mL）,其次为克隆株QB-Tn-Ⅰ（2.70×104 IU/mL）,均高于原始细胞QB-Tn9-4s和对照细胞BTI-Tn5B1-4及Sf-9的表达量。比较各细胞克隆株第7 d分泌型碱性磷酸酶（SEAP）的表达量,克隆株QB-Tn-Ⅴ的表达量最高（2.96 IU/mL）,其次为QB-Tn-Ⅰ（2.41 IU/mL）,均显着高于原始细胞QB-Tn9-4s和对照细胞BTI-Tn5B1-4及Sf-9的表达量。4.将原始细胞系QB-Tn9-4s及其克隆株QB-Tn-Ⅰ和QB-Tn-Ⅴ分别在无血清培养基Sf-900Ⅲ及EX-CELL 420中进行驯化培养,在Sf-900Ⅲ中驯化均获得成功,而在EX-CELL 420中只有克隆株QB-Tn-Ⅴ最终驯化成功。无血清驯化后各细胞形态和大小都发生了一定的改变。生长曲线测定结果表明,各细胞在Sf-900Ⅲ中的生长速度变快,群体倍增时间缩短,细胞最大密度均有提高,但是克隆株QB-Tn-Ⅴ在EX-CELL 420中生长速度变慢,倍增时间延长,细胞最大密度有所下降。QB-Tn9-4s及克隆株QB-Tn-Ⅰ和克隆株QB-Tn-Ⅴ在有血清培养基TNM-FH中的群体倍增时间分别为27.4 h、28.0 h和27.0 h,在Sf-900Ⅲ中的倍增时间分别为24.1 h、26.1 h和25.4 h,克隆株QB-Tn-Ⅴ在EX-CELL 420中的群体倍增时间为28.8 h。QB-Tn9-4s及其克隆株QB-Tn-Ⅰ和QB-Tn-Ⅴ在Sf-900Ⅲ中细胞最大密度分别是TNM-FH中的1.8、1.7和1.7倍,而在EX-CELL 420中的细胞最大密度是TNM-FH中的0.9倍。AcMNPV感染各细胞的结果表明,克隆株QB-Tn-Ⅰ在Sf-900Ⅲ中的病毒感染率为80.3%,平均每个细胞病毒多角体（OBs）产量为33.9个,其他细胞的感染率均在90%以上,平均每个细胞多角体产量在81～87个之间,与对照细胞BTI-Tn5B1-4的产量差异不显着。测定了各细胞在有血清培养基和无血清培养基中的重组蛋白表达水平,结果表明,克隆株QB-Tn-Ⅴ在Sf-900Ⅲ中第6 dβ-半乳糖苷酶的表达量最高（3.27×104 IU/mL）;对比各细胞有血清和无血清培养下第6 dβ-半乳糖苷酶的表达量可以看出,各细胞在无血清培养基Sf-900Ⅲ中的表达量均高于在有血清培养基TNM-FH中的表达量,但克隆株QB-Tn-Ⅴ在无血清培养基EX-CELL 420中的表达量低于其在Sf-900Ⅲ中和在有血清培养基TNM-FH中的表达量。BTI-Tn5B1-4在Sf-900Ⅲ中第7 d分泌型碱性磷酸酶的表达量（4.43 IU/mL）最高,其次为QB-Tn-Ⅴ（4.30 IU/mL）在Sf-900Ⅲ中的表达量。对比各细胞在有血清和无血清培养下第7 d的分泌型碱性磷酸酶表达量可以看出,各细胞在无血清培养基Sf-900Ⅲ中的表达量均显着高于有血清培养基TNM-FH中的表达量,但克隆株QB-Tn-Ⅴ在无血清培养基EX-CELL 420中的表达量低于其在Sf-900Ⅲ中和有血清培养基TNM-FH中的表达量。
温发园[6]（2009）在《杨扇舟蛾等几种重要林业昆虫细胞系的建立及颗粒体病毒体外增殖研究》文中进行了进一步梳理迄今为止,国内外已经建立了来源于150多种昆虫的800株以上的昆虫细胞系,其中260株以上为鳞翅目昆虫的细胞系,但相对于已知的几十万种昆虫来说,这些细胞系还远远不够。在某些研究方面,仍然需要特定昆虫种类来源或者特定细胞类型的细胞系。在培养细胞中,各种病毒也具有不同的受纳细胞系统。一般说来,核型多角体病毒比较容易在昆虫细胞系中复制,但在颗粒体病毒中至今尚未建立一个比较满意的颗粒体病毒——细胞离体系统,因此,有必要建立更多新的昆虫细胞系,为害虫病毒的规模化扩增打下基础。本研究选取9种重要的林业害虫进行细胞系建立和杆状病毒增殖,并尝试对已建立的细胞系进行无血清培养,试图为林业昆虫病毒杀虫剂的规模化生产以及杆状病毒表达载体系统的构建和研究,提供有效的技术手段。本研究选取的9种重要的林业害虫为:杨扇舟蛾（Clostera anachoreta）、美国白蛾（Hyphantria cunea）、春尺蠖（Apocheima cinerarius）、枣尺蠖（Sucra jujuba）、茶尺蠖（Ecotropis Obliqua）、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）、桑天牛（Apriona germari）、鞭角华扁叶蜂（Chinolyda flagellicornis）、月季叶蜂（Arge pagana）。对这些害虫先进行解剖,取胚胎、卵巢、精巢、血细胞和脂肪体,然后建立原代培养,选用TNM-FH, IPL-41, Excell-405, Excell-420, TC-100昆虫培养液进行培养。结果表明,产下约4天的鳞翅目昆虫受精卵比较容易游离出细胞并建立成细胞系。经过培养,成功建立了两株来源于杨扇舟蛾胚胎的细胞系,分别命名为CAF-ClanⅠ和CAF-ClanⅡ,现已传代分别传到第78代和57代,其合适的培养液为TNM-FH+10%灭活的胎牛血清,最适宜的pH值是6.4。两株细胞系的特点为:CAF-ClanⅠ细胞大部分悬浮,有少量贴壁,细胞的形状有:圆形、梭形和似巨噬形3种;CAF-ClanⅡ的细胞大部分贴壁,主要由圆形和梭形细胞组成。在27℃培养条件下,CAF-Clan I第22代细胞和CAF-Clan II第24细胞的群体倍增时间分别为68.5h和38.2h;两株细胞系第15代的染色体数目范围大部分在62100之间,也有少数细胞超过260 （n=30）。随后,运用DAF-PCR方法鉴定了这两种细胞系表明其来源于杨扇舟蛾。并测定了两株细胞系对几种杆状病毒的敏感性。结果显示:CAF-ClanⅡ细胞系对杨扇舟蛾颗粒体病毒（ClanGV）、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）、茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）三种病毒敏感,所产生AcMNPV和EoNPV的包涵体产量分别为129±4OBs/细胞和124±15 OBs/细胞。出芽型ClanGV（ClanBV）接种CAF-Clan II的TCID50为6.5×105 TCID50/mL。与CAF-ClanⅡ相比,CAF-ClanⅠ细胞系对ClanGV和AcMNPV敏感性稍低,对EoNPV、美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）和春尺蠖核型多角体病毒（AciNPV）不敏感。两株细胞系长期冻存在-80℃和液氮中并多次成功复苏。CAF-Clan I的单细胞克隆正在进行放大培养。研究中,还进行了所培养的细胞系接种、复制杨扇舟蛾颗粒体病毒的试验。结果表明,两种细胞系接种杨扇舟蛾颗粒体病毒后,在15℃和27℃的温度条件下,受侵染的细胞系细胞切片在电子显微镜下观察,可见病毒发生基质、核衣壳、病毒粒子和包涵体等不同阶段的形态结构发生,但未观察到包涵体中的单粒包埋病毒粒子,包涵体大小与接种的杨扇舟蛾颗粒体病毒大小一致,表明ClanGV可以侵染CAF-ClanI和CAF-ClanII细胞,但复制是否完整需要进一步试验验证。针对两株细胞系在几种培养液中的生长状况,尝试配制了一种无血清培养基。目前,CAF-Clan I和CAF-Clan II已在这种培养基中生长了5代。这种改进的无血清培养基的成本是商品化培养基的31.8～47%。论文还对其他8种重要林木害虫的细胞系培养进行了研究。其中,取自美国白蛾胚胎的一瓶原代培养细胞已经成功传了第4代,有望建成1株新的细胞系。春尺蠖和光肩星天牛等其他林业昆虫的原代培养还在进行中。适合美国白蛾和春尺蠖细胞生长的的培养液是IPL-41+10%FBS。本研究建立了2株新的鳞翅目昆虫细胞系,丰富了昆虫细胞系资源;进行了两种细胞系复制杨扇舟蛾颗粒体病毒的试验,表明其对病毒敏感,具有良好的体外复制该颗粒体病毒的前景;再者,本研究中研制的无血清培养液具有良好的应用价值,为进一步研究昆虫病毒、构建杆状病毒表达载体系统以及规模化生产昆虫病毒杀虫剂提供了有效的支撑;还进行了美国白蛾及其他8种重要的林业害虫细胞的原代及传代培养,为它们的成功建系奠定了基础。本研究还发现,在进行昆虫细胞系建立时,选取产下约4天的受精卵,将解剖出的胚胎组织切成微小的组织块可以促使其游离出较多的细胞,便于建立成昆虫细胞系。本结论为今后建立新的昆虫细胞系提供了技术上借鉴。
杨章女[7]（2008）在《BmNPV ORF9和ORF56基因功能分析》文中指出杆状病毒已经在世界上广泛地应用于生物杀虫剂,并且作为载体在昆虫细胞以及虫体上表达了许多外源基因。最近,家蚕核型多角体病毒Bombyx morinucleopolyherovirus（BmNPV）已经成功地在表面展示系统上得到了应用。另外,杆状病毒也被认为在基因治疗上具有很大的潜在应用价值。这些应用使得杆状病毒感染的分子机理的研究方兴未艾。BmNPV的全基因组序列的测定,为单个基因功能研究的广泛开展提供了基础。BmNPV ORF9（Bm9）是鳞翅目杆状病毒特有的基因,但其功能还不清楚。本文中我们对Bm9基因产物的功能开展了系统研究。在含有BmNPV bacmid的大肠杆菌E.coli中,得到了Bm9敲除的BmNPV bacmid病毒。Bm9基因敲除的bacmid感染细胞后,与野生型bacmid相比,BV产量大幅下降,然而病毒DNA的复制并没有受到影响。接着,将Bm9基因异位补回到多角体区域来拯救bacmid,BV产量得到恢复。电镜分析显示,多角体的形成并没有因为基因敲除而受到影响。用BV注射来进行的生物测定发现,敲除的病毒与野生型病毒相比,杀死幼虫时间延迟14-22个小时,而且其LD50比野生型病毒高15倍,说明Bm9是一个和病毒感染力相关的因子。所有的结果揭示虽然Bm9并不是BmNPV增殖的必需基因,但Bm9与病毒在体内和体外的感染性和毒力直接相关。BmNPV ORF56（Bm56）是杆状病毒的核心基因之一,其同源基因存在于所有已测序的杆状病毒中。本研究中我们进一步确定了Bm56是ODV的核衣壳蛋白。而且,我们利用能够在大肠杆菌中复制的BmNPV bacmid构建了敲除Bm56的bacmid,并分析了敲除Bm56的bacmid在细胞里的复制情况。Bm56敲除的bacmid与BmNPV bacmid相比在BV产量上并没有统计学上的区别。另外,体内的生测分析显示这两种bacmid在半致死剂量(LD50)上也没有统计学上的区别。但是,Bm56敲除的bacmid比BmNPV bacmid杀死虫体要更长时间。这说明,Bm56作为ODV核衣壳的结构成分,有利于病毒在体内有效复制,但不影响在离体细胞中产生BV的。同时,我们制备了BmNPV基因芯片,分析了BmNPV全基因的转录图谱,并就Bm9基因敲除对BmNPV全基因组转录的影响进行了分析,发现Bm9基因敲除后,lef11,egt,ORF35,ubquitin,bro-b和dbp转录水平极显着下降,ORF45和ORF44转录显着下降,而p6.9,bro-d,ORF67,helicase,pe38,ie-2和ie-1 7个基因转录水平显着上升。dbp和lef11转录水平下降有可能是Bm9基因敲除导致BV产量下降的原因。结果为杆状病毒基因功能的进一步深入研究提供基础。
曾宪东[8]（2007）在《杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究》文中研究说明细胞凋亡是宿主细胞防御病毒入侵的重要策略，同时进化过程中病毒也获得了相应的调节细胞凋亡的机制。杆状病毒是最早发现参与调节宿主细胞凋亡的病毒之一，对于杆状病毒的凋亡调节基因的研究大大加深了对病毒与宿主细胞相互作用以及细胞凋亡的分子机制的认识。杆状病毒编码的凋亡抑制基因主要有三类，即p35、p49和iap（inhibitor of apoptosis）。P35蛋白作为多种caspase的底物自杀性抑制剂是一个广谱的强而有效的凋亡抑制因子，P49是P35的同源体，而分布广泛的iap基因家族已经成为了新的研究热点，但仅有少数几个杆状病毒iap基因的功能得到鉴定。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa california nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是杆状病毒的模式种，它编码一个p35基因以及两个功能尚未证实的iap基因。缺失p35 AcMNPV能诱导其AcMNPV敏感的草地贪夜蛾（Spodoperta frugiperda）Sf细胞凋亡，利用该系统鉴定了多个凋亡抑制基因，如Cp-iap和Op-iap。在本实验室的研究发现缺失p35的AcMNPV与野生型病毒一样能完全抑制棉铃虫核多角体病毒（Helicoverpa armigera NPV，HearNPV）诱导的Tn-Hi5细胞凋亡，推测iap1与iap2是功能性的凋亡抑制基因。瞬时表达分析研究证实了AcMNPV IAP1与IAP2均功具有抑制细胞凋亡的功能。由于AcMNPV与HearNPV共感染不仅抑制了HearNPV诱导的Tn-Hi5细胞的凋亡，而且能拯救HearNPV在Tn-Hi5中的复制，为此构建了分别表达AcMNPV p35、iap1与iap2的重组HearNPV，感染试验发现重组病毒诱导的凋亡显着下降且极晚期启动的egfp基因获得表达，而且用电镜观测到了重组病毒在Tn-Hi5细胞均产生的病毒粒子。为了进一步探讨AcMNPV IAPs在Tn-Hi5细胞中起作用的机制，我们表达了IAP2以及两个源自昆虫细胞的效应caspase，即Bm-caspase-1和Tn-caspase-1，体外活性分析表明了原核表达的Bm-caspase-1能够自我激活并可以激活酶原形式的Tn-caspase-1，而且IAP2可抑制Bm-caspase-1的蛋白酶活性。本研究首次证实了AcMNPV的IAP1／2作为功能性的凋亡抑制蛋白发挥作用，也进一步揭示了凋亡抑制子IAP家族蛋白功能和作用机制的细胞特异性。
蔡秀娟[9]（2007）在《家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的建立及其生物学特性的研究》文中研究指明昆虫细胞系已经成为生物学、生物技术、生物制药以及生物杀虫剂等研究中的重要工具。家蚕作为一种模式昆虫，对家蚕细胞进行体外培养，应用培养细胞进行理论研究和生产应用，长期以来倍受关注。虽然前人在这方面做了大量工作，但现有的家蚕细胞系数量仍然偏少，且应用于生产的家蚕细胞系更少。家蚕基因组框架图完成以后，家蚕功能基因组研究需要提供不同发育时期、不同分化程度、不同组织特异性的家蚕细胞系作为研究平台。为了满足家蚕细胞生物学、发育生物学和分子生物学，新的杆状病毒表达载体系统以及家蚕细胞工程等方面的研究需要，迫切需要建立和研究新的家蚕细胞系。本研究在前人的研究基础上，通过对家蚕品种21-872nlw的卵巢组织进行两年多的原代培养，得到高繁殖率的细胞群体，经过逐步分离纯化，建立了家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1。该细胞系的生物学特性如下：1．该细胞系是以多边形、圆形及短梭形细胞为主的贴壁上皮型细胞系，圆形细胞直径为9～31μm，短梭形细胞的大小为19～52μm×5～21μm。2．BmN-SWU1细胞生长速度快，繁殖力强；细胞接种后，从72h到192h是BmN-SWU1细胞的对数生长期，在192h时细胞浓度达到顶峰，最终细胞铺平率达80％以上；细胞群体倍增时间为57.74h。3．BmN-SWU1细胞系的染色体具有鳞翅目昆虫染色体的典型特征，中期染色体呈短杆状或颗粒状，具弥散型着丝粒。二倍体细胞（2n=56）比例高达80.5％，属二倍体细胞系，未见异常有丝分裂现象，较好地保持了家蚕卵巢细胞的有丝分裂和染色体特征。4．BmN-SWU1细胞在接种家蚕核型多角体病毒BmNPV 48h后就可见到少量细胞内产生了BmNPV病毒多角体，96h时可观察到有50.29％的细胞内有多角体产生；在120h时，感染率达83.01％；在144h时，有89.91％细胞产生多角体，并且大多数细胞已经破裂。测得其TCID50值为1.626×10-6。同样条件下，对照组细胞及对照细胞系BmN在接种BmNPV 192h后均未发现BmNPV多角体的产生。5．经考马斯亮蓝R-250染色法显示，在梭形BmN-SWU1细胞中的微丝束是与细胞长轴方向一致的纤维，有时在两端弯曲成弧形。纵向的微丝束长短不一，许多从细胞一端直达另一端，微丝束常出现分枝和合并，使得整个微丝系统连结成一个网格。圆形的BmN-SWU1细胞中的微丝束以细胞核为中心，向细胞膜方向呈辐射状排列，微丝束也常出现分枝和合并，结成一个网格。这些微丝束构成细胞形状的基本轮廓。综上所述，经两年多的家蚕卵巢组织的原代培养，从不同分化类型的繁殖群体中，筛选并建立了一个新的家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1。该细胞系以多边形、圆形及短梭形细胞为主，繁殖力强，二倍率高，对BmNPV病毒敏感。为细胞生物学、分子生物学、发育生物学和杆状病毒表达载体系统的应用研究等提供了一个较好的新细胞材料。更为家蚕功能基因组研究、外源基因的高效表达和推动家蚕作为模式昆虫的地位提供更好的细胞研究平台。
温荣辉[10]（2007）在《菜粉蝶颗粒体病毒的分子生物学研究》文中研究说明菜粉蝶颗粒体病毒（Pieris rapae granulovirus，PiraGV）属于杆状病毒科（Baculoviridae）颗粒体病毒属（granulovirus genus）的一个成员。PiraGV在自然状况下仅感染菜粉蝶（Pieris rapae），是控制菜粉蝶种群数量和维持生态平衡的重要生物因素之一。虽然PiraGV作为一种病毒性杀虫剂用于菜粉蝶的防治已有多年历史，但关于PiraGV的研究主要集中在生物学方面，有关PiraGV的分子生物学研究非常有限。本论文对PiraGV进行了分子生物学方面的研究，包括以下几个方面：1．PiraGV的形态学、致病力和克隆纯化：从采自田间的具有颗粒体病毒感染症状的自然罹病死亡的菜粉蝶幼虫体内分离到病毒包含体样颗粒，在透射电镜下观察到典型的颗粒体病毒形态结构特征；接种实验显示分离到的病毒具有很强的感染性，被感染的菜粉蝶幼虫呈现典型的颗粒体病毒感染症状。经三次连续的菜粉蝶幼虫体内克隆，获得了限制性内切酶片段同质的病毒基因型PiraGV-E3。2．PiraGV-E3基因组物理图谱构建：经限制性内切酶EcoRⅠ，SaiⅠ，HindⅢ和KpnⅠ酶切分别产生了17、23、14、14个酶切片段，各酶切片段被回收并克隆，构建了包含4种酶切片段的PiraGV-E3基因组质粒文库。文库中的质粒经单酶切或双酶切以及质粒两端的测序，各酶切片段在基因组中的相对位置被确定，最后构建了包含4种限制性内切酶位点的PiraGV-E3基因组的物理图谱。该物理图谱与已报道的其他的PiraGV分离株的基因组物理图谱比较，观察到少量酶切位点的差异。PiraGV-E3基因组中17个EcoRⅠ位点中的14个与PiraGV英国分离株ArGV1基因组中19个EcoRⅠ位点中的14个位点位置相一致，但PiraGV-E3基因组中缺失了ArGV1另外的5个EcoRⅠ位点，同时在基因组其他位置增加了3个EcoRⅠ位点。3．PiraGV DNA polymerase（dnapol）基因的研究：PiraGV dnapol编码框包含3135个核苷酸，编码一个1045个氨基酸组成的预计分子量为122.16kDa的蛋白质。PiraGV dnapol基因与其他的杆状病毒的dnapol基因有28-70％的氨基酸同源性。与其他的杆状病毒dnapol基因一样，PiraGV dnapol基因包含有保守的3’-5’外切核酸酶的基序（motif）以及DNA结合功能域（domain）。Northern杂交显示，在PiraGV感染的菜粉蝶幼虫体内，dnapol基因的转录产物主要为3.7kb的mRNA。5’和3’cDNA末端快速扩增（RACE）显示PiraGV dnapol基因的转录产物起使于翻译起使密码子ATG上游-378的T，终止于一个poly（A）信号序列AATAAA。基于dnapol基因的系统进化分析显示PiraGV与苹果小卷叶蛾颗粒体病毒（Cydia pomonellaGV，CpGV），云杉卷叶蛾颗粒体病毒（Choristoneura occidentalis GV，ChocGV）和苹果异形小卷蛾颗粒体病毒（Cryptophlebia leucotreta GV，CrleGV）在进化关系上最为密切。4．PiraGV的全基因组测序：PiraGV基因组全长108476bp，碱基组成中A+T含量为66.8％，预测PiraGV基因组含有125个orf（≥150nt），其中29个orf是在目前所有已经测序的杆状病毒基因组中都具有的，30个orf是颗粒体病毒所特有的，6个orf是PiraGV所特有的。在基因组中的非编码区，鉴定了4个同源重复区域（homologous regions，hrs），这些hrs中缺乏核型多角体病毒基因组中典型的hrs中所存在的回文序列，PiraGV hrs之间具有同源性，与其他GVs的hrs无明显的同源性。在PiraGV orf23和orf24之间的785bp区域，富含AT，并且存在着大量的重复序列、反向重复序列和回文序列，这一区域类似于CrleGV和ChocGV基因组中的DNA复制起始原点所在的非同源重复区域（non-homologous region，non-hr）。就同源蛋白的平均相似性而言，PiraGV与ChocGV的同源性最高（57.4％），其次是CpGV（54.4％）和CrleGV（54.4％）。GeneParityPlot分析显示：PiraGV基因组的基因内容和排列与感染卷叶蛾科的CpGV，ChocGV和CrleGV基因组呈现了高度的共线性关系。
二、粘虫NPV在同源胚胎细胞系内的形态发生及宿主细胞的病理变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、粘虫NPV在同源胚胎细胞系内的形态发生及宿主细胞的病理变化（论文提纲范文）
（1）茶毛虫的发生规律及其感染的病毒分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 茶树鳞翅目害虫研究进展 |
| 1.1 茶树鳞翅目害虫的发生与分布 |
| 1.2 茶树鳞翅目害虫防控现状 |
| 2 茶毛虫研究进展 |
| 2.1 茶毛虫的为害与分布 |
| 2.2 茶毛虫的防控技术现状 |
| 3 昆虫病毒 |
| 3.1 昆虫病毒分类 |
| 3.2 昆虫病毒的鉴定 |
| 3.3 昆虫病毒在害虫防治上的应用 |
| 4 昆虫与病毒的互作 |
| 4.1 昆虫病毒的侵染 |
| 4.2 昆虫与病毒共生 |
| 4.3 昆虫对病毒的免疫应答 |
| 5 学位论文研究的目的和意义 |
| 6 研究内容与技术路线 |
| 第二章 茶毛虫发生规律及遗传多样性研究 |
| 第一节 茶树主要鳞翅目害虫种类调查及其生态位分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 茶毛虫种群的发生规律研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 基于逐步判别分析法的茶毛虫预测模型的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第四节 茶毛虫种群遗传多样性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第三章 茶毛虫与淡黄刺蛾DNA病毒鉴定及毒力评价 |
| 第一节 茶毛虫与淡黄刺蛾DNA病毒鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 茶毛虫与淡黄刺蛾DNA病毒的毒力及协同作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第四章 茶毛虫RNA病毒鉴定及其感染频率和遗传分化 |
| 第一节 茶毛虫RNA病毒的挖掘及其小RNA分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 EpB YV在茶毛虫不同种群间的感染频率及遗传分化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第五章 茶毛虫对EpNPV及EpBYV的分子免疫机制 |
| 第一节 茶毛虫先天免疫通路基因注释 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 茶毛虫对EpNPV侵染的免疫应答 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 茶毛虫对Ep BYV侵染的免疫应答 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 1 主要结果和结论 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及参研课题情况 |
| 致谢 |
（2）黑尾叶蝉感染水稻矮缩病毒后唾液腺转录组变化分析及其两种RNA病毒基因组结构分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病毒组研究现状 |
| 1.1 病毒组发展简介 |
| 1.2 病毒组研究内容简介 |
| 1.3 病毒基础分类 |
| 2 Iflaviridae病毒科研究现状 |
| 2.1 Iflaviridae病毒科简介与分类 |
| 2.2 Iflaviridae病毒科病毒基因组结构 |
| 2.3 Iflaviridae病毒科病毒粒子结构 |
| 2.4 Iflaviridae病毒科病毒感染症状 |
| 2.5 Iflaviridae病毒科病毒传播途径 |
| 2.6 Iflaviridae病毒科病毒宿主范围 |
| 2.7 Iflaviridae病毒科病毒与其他微生物的共感染与互作 |
| 2.8 Iflaviridae病毒科病毒与寄生节肢动物 |
| 3 Rhabdoviridae病毒科研究现状 |
| 3.1 Rhabdoviridae病毒科病毒简介与分类 |
| 3.2 Rhabdoviridae病毒科病毒基因组结构 |
| 3.3 Rhabdoviridae病毒科病毒的转录与表达 |
| 3.4 Rhabdoviridae病毒科病毒基因组的扩张与收缩 |
| 4 水稻矮缩病毒研究概述 |
| 4.1 水稻矮缩病毒简介 |
| 4.2 水稻矮缩病毒的传播 |
| 5 本论文研究目的与路线 |
| 第二章 黑尾叶蝉RDV感染与未感染唾液腺转录组比较分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉唾液腺解剖 |
| 1.3 黑尾叶蝉唾液腺总RNA提取 |
| 1.4 黑尾叶蝉唾液腺c DNA合成 |
| 1.5 荧光定量PCR检测 |
| 1.6 黑尾叶蝉唾液腺中RDV病毒增殖情况检测 |
| 1.7 黑尾叶蝉唾液腺中RDV病毒透射电镜观察 |
| 1.8 黑尾叶蝉唾液腺转录组样品制备 |
| 1.9 黑尾叶蝉唾液腺cDNA文库制备与库检 |
| 1.10 文库测序、拼接注释与CDS预测 |
| 1.11 黑尾叶蝉唾液腺转录组差异表达基因分析与筛选 |
| 1.12 差异基因富集分析 |
| 1.13 差异基因验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉唾液腺RDV病毒检测 |
| 2.2 黑尾叶蝉唾液腺转录组数据概况 |
| 2.3 基因GO、KOG和 KEGG功能分析 |
| 2.4 差异基因的筛选与统计 |
| 2.5 差异基因的GO富集分析 |
| 2.6 差异基因的KEGG富集分析 |
| 2.7 昆虫相关差异基因验证 |
| 2.8 病毒相关差异基因及验证 |
| 3 讨论 |
| 第三章 黑尾叶蝉ML基因鉴定及ML蛋白与RDV互作研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉总RNA提取与c DNA合成 |
| 1.3 黑尾叶蝉NcML基因鉴定与生物学分析 |
| 1.4 黑尾叶蝉NcML基因序列扩增 |
| 1.5 黑尾叶蝉NcML基因表达分布检测 |
| 1.6 黑尾叶蝉NcML蛋白与RDV病毒蛋白酵母双杂交互作验证 |
| 1.7 蛋白SDS-PAGE和 Western blot检测 |
| 1.8 蛋白表达纯化与Pull-Down互作验证 |
| 1.9 黑尾叶蝉NcML基因ds RNA合成与RNA干扰 |
| 1.10 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉NcML基因鉴定与生物学分析 |
| 2.2 黑尾叶蝉NcML蛋白结构预测 |
| 2.3 黑尾叶蝉NcML基因组织和发育动态分布 |
| 2.4 黑尾叶蝉NcML与 RDV病毒蛋白互作 |
| 2.5 黑尾叶蝉NcML蛋白与Lipid A分子对接预测 |
| 2.6 黑尾叶蝉NcML基因RNAi |
| 3 讨论 |
| 第四章 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组结构与传播模式研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉总RNA提取与c DNA合成 |
| 1.3 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组序列克隆与测序 |
| 1.4 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1生物信息学与系统进化分析 |
| 1.5 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1检测与定量分析 |
| 1.6 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 1.7 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1实验室种群带毒率检测 |
| 1.8 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1水平传播检测 |
| 1.9 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1垂直传播检测 |
| 1.10 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1宿主范围检测 |
| 1.11 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV实验室种群共感染检测 |
| 1.12 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组序列分析 |
| 2.2 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组结构分析 |
| 2.3 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1系统进化分析 |
| 2.4 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1成虫带毒检测 |
| 2.5 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 2.6 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1实验室种群丰度变化 |
| 2.7 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1水平传播检测 |
| 2.8 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1垂直传播检测 |
| 2.9 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1宿主检测 |
| 2.10 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV的共感染 |
| 3 讨论 |
| 第五章 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组结构与进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉总RNA提取与cDNA合成 |
| 1.3 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组序列克隆与测序 |
| 1.4 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1生物信息学与系统进化分析 |
| 1.5 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1检测 |
| 1.6 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 1.7 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1实验室种群带毒率检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组序列分析 |
| 2.2 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1系统进化分析 |
| 2.3 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组结构横向比较分析 |
| 2.4 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因连接区序列分析 |
| 2.5 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 2.6 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1实验室种群带毒率检测 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 1 本论文的特色与创新点 |
| 2 本论文的不足之处 |
| 3 未来的研究方向 |
| 附录Ⅰ 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉唾液收集 |
| 1.3 黑尾叶蝉唾液蛋白样品处理及SDS-PAGE电泳 |
| 1.4 黑尾叶蝉唾液蛋白FASP酶解、ESI质谱鉴定与数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉唾液蛋白SDS-PAGE电泳与质谱鉴定 |
| 2.2 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组数据统计 |
| 2.3 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组成分析 |
| 2.4 黑尾叶蝉水状唾液蛋白差异表达基因 |
| 2.5 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组病毒相关序列 |
| 3 讨论 |
| 附录Ⅱ |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）家蚕基质金属蛋白酶家族MMPs及组织金属蛋白酶抑制剂TIMP在家蚕中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 MMPs基质金属蛋白酶家族 |
| 1.1.1 MMPs基质金属蛋白酶家族的进化 |
| 1.1.2 MMPs基质金属蛋白酶家族的分类 |
| 1.1.3 MMPs基质金属蛋白酶家族的结构特征 |
| 1.1.4 MMPs基质金属蛋白酶家族的活性调控 |
| 1.1.5 MMPs基质金属蛋白酶家族的功能 |
| 1.2 TIMPs组织金属蛋白酶抑制剂家族 |
| 1.2.1 TIMPs家族的发现及结构 |
| 1.2.2 TIMPs家族的功能 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景和目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 BmMMPs和BmTIMP基因的鉴定及表达特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒与细菌 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 家蚕MMPs家族基因和TIMP基因序列分析 |
| 3.2.2 MMPs家族和TIMP的组织和时期表达分析 |
| 3.2.3 MMPs和TIMP的亚细胞定位及与定位相关的结构域鉴定 |
| 3.2.4 不同免疫诱导刺激下MMPs和TIMP的表达模式 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 BmMMPs和BmTIMP的相互作用鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 荧光共定位分析MMPs与TIMP的相互作用 |
| 4.2.2 BiFC分析MMPs与TIMP的相互作用 |
| 4.2.3 Co-IP分析MMPs与TIMP的相互作用 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 BmMMPs和BmTIMP对BmNPV侵染的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞与病毒 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MMPs与TIMP基因的过表达效果检测 |
| 5.2.2 过表达MMPs与TIMP对BmNPV侵染的影响 |
| 5.2.3 MMPs与TIMP基因的CRISPR/Cas9敲除效果检测 |
| 5.2.4 CRISPR/Cas9敲除MMPs与TIMP对BmNPV侵染的影响 |
| 5.2.5 MMPs的蛋白酶活性对BmNPV侵染的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 转基因过表达BmMMP3和BmTIMP对BmNPV增殖及家蚕变态发育影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 家蚕、病毒与载体 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 MMP3-OE与TIMP-OE转基因品系的建立及鉴定 |
| 6.2.2 MMP3-OE转基因品系的表型分析及对BmNPV侵染的影响 |
| 6.2.3 TIMP-OE转基因品系的表型分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 转基因杂交敲除BmMMPs家族基因对BmNPV增殖及家蚕变态发育影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 家蚕、病毒与载体 |
| 7.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 Cas9-OE与MMPs-sgRNA转基因品系的建立及鉴定 |
| 7.2.2 MMP1-KO转基因杂交敲除品系的鉴定及表型分析 |
| 7.2.3 MMP2-KO转基因杂交敲除品系的鉴定及表型分析 |
| 7.2.4 MMP3-KO转基因杂交敲除品系的鉴定及表型分析 |
| 7.2.5 MMPs-KO品系对BmNPV侵染活力的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 BmMMPs和BmTIMP作用机制的探究及相互作用蛋白的鉴定 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 家蚕、病毒与载体 |
| 8.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 BmNPV的关键基因对MMPs家族基因的诱导调控 |
| 8.2.2 MMPs与TIMP之间的的诱导调控 |
| 8.2.3 MMPs调控Caspase的活性 |
| 8.2.4 MMP1a和MMP3互作蛋白的钓取 |
| 8.2.5 MMP1a和MMP3互作蛋白的克隆及初步鉴定 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 全文总结与展望 |
| 9.1 全文总结 |
| 9.2 展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表学术论文及参研课题情况 |
| 致谢 |
（4）核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫病毒的研究现状 |
| 1.1.1 昆虫病毒分类研究 |
| 1.1.2 昆虫核型多角体病毒的主要特征 |
| 1.1.3 柞蚕核型多角体病毒 |
| 1.2 昆虫抗病毒机制研究 |
| 1.2.1 昆虫抗NPV的免疫途径研究 |
| 1.2.2 昆虫免疫信号转导研究 |
| 1.2.3 昆虫免疫效应因子研究进展 |
| 1.2.4 其他途径和效应分子 |
| 1.3 柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)的感染及危害 |
| 1.4 基因转录组学的研究进展 |
| 1.4.1 转录组研究技术 |
| 1.4.2 转录组测序技术的应用 |
| 1.4.3 转录组测序技术在鳞翅目昆虫上的应用 |
| 1.5 脂肪酶研究进展 |
| 1.6 小G蛋白家族的概述 |
| 1.6.1 小G蛋白的结构 |
| 1.6.2 小G蛋白的分类 |
| 1.6.3 小G蛋白的生物学功能 |
| 1.7 本项目的研究意义 |
| 第二章 柞蚕感染核型多角体病毒后转录组测序 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA-Seq数据整体质量评估 |
| 2.2.2 Unigene注释分析 |
| 2.2.3 CDS预测 |
| 2.2.4 微卫星标记(SSR)分析 |
| 2.2.5 基因表达水平分析 |
| 2.2.6 RNA-seq整体质量评估 |
| 2.2.7 差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 鸟苷三磷酸酶基因克隆及功能研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 柞蚕总RNA的提取及mRNA的纯化 |
| 3.2.2 柞蚕cDNA第一条链的合成 |
| 3.2.3 目的基因PCR扩增 |
| 3.2.4 PCR产物目的条带的回收与纯化 |
| 3.2.5 感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 PCR产物的连接转化 |
| 3.2.7 序列分析 |
| 3.2.8 系统进化的分析 |
| 3.2.9 ApGTPase重组蛋白的表达 |
| 3.2.10 柞蚕不同发育时期和组织cDNA的制备 |
| 3.2.11 外源病原物对4龄柞蚕幼虫的诱导 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 柞蚕总RNA质量的电泳检测 |
| 3.3.2 目的基因的检测 |
| 3.3.3 柞蚕鸟苷三磷酸酶的序列分析 |
| 3.3.4 柞蚕ApGTPase基因同源比对及系统进化分析 |
| 3.3.5 ApGTPase基因原核表达及检测 |
| 3.3.6 柞蚕鸟苷三磷酸酶基因ApGTPase组织表达谱分析 |
| 3.3.7 Real-time PCR引物特异性分析 |
| 3.3.8 外源病原物诱导后柞蚕中肠鸟苷三磷酸酶基因的Real-time PCR检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 柞蚕鸟甘三磷酸酶基因的克隆及功能分析 |
| 3.4.2 柞蚕鸟苷三磷酸酶基因对外源病原物入侵响应 |
| 第四章 柞蚕脂肪酶基因受病原物侵染后表达谱分析 |
| 4.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 柞蚕脂肪酶基因的克隆 |
| 4.2.2 Aplipase基因的序列分析 |
| 4.2.3 柞蚕脂肪酶基因的原核表达 |
| 4.2.4 柞蚕4个发育阶段与5龄幼虫各组织Aplipase基因的半定量检测 |
| 4.2.5 外源病原物诱导后柞蚕中肠Aplipase基因的实时定量PCR检测分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 柞蚕脂肪酶基因克隆 |
| 4.3.2 Aplipase的序列分析 |
| 4.3.3 柞蚕脂肪酶基因的进化分析 |
| 4.3.4 脂肪酶基因的原核表达及检测 |
| 4.3.5 Aplipase基因的半定量检测 |
| 4.3.6 外源病原物诱导下Aplipase基因的实时定量PCR检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表文章 |
（5）鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立和高蛋白表达细胞克隆株的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫细胞系的建立 |
| 1.1 昆虫细胞系建立的历史 |
| 1.2 昆虫细胞系建立的方法 |
| 2 昆虫细胞培养基 |
| 2.1 昆虫细胞培养基的发展 |
| 2.2 昆虫细胞无血清培养基 |
| 3 昆虫细胞系的应用 |
| 3.1 昆虫细胞在杀虫剂研究上的应用 |
| 3.1.1 离体细胞用于生物测定 |
| 3.1.2 昆虫细胞生产生物农药 |
| 3.2 昆虫细胞—杆状病毒表达系统生产重组蛋白 |
| 3.3 其他方面的应用 |
| 4 细胞凋亡 |
| 4.1 细胞凋亡概述 |
| 4.2 细胞凋亡的特征 |
| 4.3 细胞凋亡的诱因 |
| 4.4 细胞凋亡的检测方法 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 第二章 两种鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试细胞系 |
| 2.1.3 供试病毒 |
| 2.1.4 培养基和血清 |
| 2.1.5 生化试剂 |
| 2.1.6 培养板和培养瓶 |
| 2.1.7 常用仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 TNM-FH 培养基的配制 |
| 2.2.2 胚胎细胞的原代培养 |
| 2.2.3 胚胎细胞的传代培养 |
| 2.2.4 细胞系鉴定 |
| 2.2.5 染色体分析 |
| 2.2.6 细胞冻存与复苏 |
| 2.2.7 细胞生长曲线和群体倍增时间的测定 |
| 2.2.8 细胞对病毒的敏感性测定 |
| 2.2.9 棉铃虫细胞对放线菌素 D 反应的测定 |
| 2.2.10 棉铃虫细胞凋亡的DAPI 荧光染色检测 |
| 2.2.11 棉铃虫细胞凋亡基因组 DNA 的提取与电泳分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 棉铃虫胚胎细胞系的建立及生物学特性 |
| 3.1.1 两株棉铃虫胚胎细胞系的原代培养 |
| 3.1.2 细胞系 DNA 鉴定 |
| 3.1.3 染色体分析 |
| 3.1.4 细胞冻存与复苏 |
| 3.1.5 细胞生长曲线和群体倍增时间 |
| 3.1.6 细胞系对病毒的敏感性 |
| 3.1.7 细胞系对放线菌素 D 的反应 |
| 3.2 粘虫胚胎细胞系的建立及生物学特性 |
| 3.2.1 四株粘虫胚胎细胞系的原代培养 |
| 3.2.2 细胞系 DNA 鉴定 |
| 3.2.3 染色体分析 |
| 3.2.4 细胞冻存与复苏 |
| 3.2.5 细胞生长曲线和群体倍增时间 |
| 3.2.6 细胞对病毒敏感性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 昆虫细胞系的建立 |
| 4.1.1 原代细胞培养 |
| 4.1.2 细胞保存 |
| 4.1.3 染色体分析 |
| 4.2 细胞凋亡 |
| 4.3 细胞对病毒的敏感性 |
| 第三章 粉纹夜蛾胚胎细胞系 QB-Tn9-4s 高蛋白表达克隆株的筛选及无血清驯化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试细胞系 |
| 2.1.2 供试病毒 |
| 2.1.3 培养基和血清 |
| 2.1.4 生化试剂 |
| 2.1.5 培养板和培养瓶 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 EX-CELL 420 培养基的配制 |
| 2.2.2 细胞培养方法 |
| 2.2.3 细胞克隆 |
| 2.2.4 细胞生物学特性测定 |
| 2.2.5 细胞的无血清培养和驯化 |
| 2.2.6 重组蛋白表达水平的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 QB-Tn9-4s 细胞克隆及生物学特性 |
| 3.1.1 细胞克隆及克隆株形态 |
| 3.1.2 克隆株基因组 DNA 的 RAPD 分析 |
| 3.1.3 细胞冻存与复苏 |
| 3.1.4 细胞对病毒敏感性及病毒多角体产量的测定 |
| 3.1.5 重组蛋白表达水平分析 |
| 3.2 粉纹夜蛾胚胎细胞系 QB-Tn9-4s 及其克隆株的无血清驯化 |
| 3.2.1 无血清驯化 |
| 3.2.2 细胞的形态比较 |
| 3.2.3 细胞冻存与复苏 |
| 3.2.4 细胞生长曲线和群体倍增时间 |
| 3.2.5 细胞对病毒敏感性及病毒多角体产量 |
| 3.2.6 出芽性病毒（BV）产量 |
| 3.2.7 重组蛋白表达水平分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 细胞克隆 |
| 4.2 细胞的无血清驯化 |
| 4.3 病毒产量 |
| 4.4 蛋白表达 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文情况 |
（6）杨扇舟蛾等几种重要林业昆虫细胞系的建立及颗粒体病毒体外增殖研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2.1 杆状病毒杀虫剂研究进展 |
| 1.2.2 昆虫细胞培养研究现状 |
| 1.2.3 昆虫细胞培养液研究进展 |
| 1.2.4 颗粒体病毒离体复制研究进展 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 杨扇舟蛾胚胎细胞系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 原代培养 |
| 2.2.2 传代及建立细胞系 |
| 2.2.3 细胞系的形态特征 |
| 2.2.4 细胞系的生长曲线 |
| 2.2.5 染色体分析 |
| 2.2.6 运用DAF-PCR 鉴定细胞系 |
| 2.2.7 细胞系对pH 值的选择 |
| 2.2.8 细胞的冻存和复苏 |
| 2.2.9 单细胞克隆 |
| 2.2.10 细胞系对ClanGV 等五种杆状病毒的感染敏感性测定 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 杨扇舟蛾颗粒体病毒在细胞系细胞中的形态发生 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 供试杨扇舟蛾颗粒体病毒形态 |
| 3.2.2 杨扇舟蛾颗粒体病毒在细胞内的形态发生 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 杨扇舟蛾细胞系无血清培养基的研制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细胞系对不同培养基的选择 |
| 4.2.2 无血清培养基的配方 |
| 4.2.3 细胞对无血清培养基的适应和生长特性 |
| 4.2.4 配制培养液与购买商品化培养液成本比较 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 其他几种重要林业害虫细胞的原代、传代培养研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 美国白蛾的原代培养及传代培养 |
| 5.2.2 春尺蠖的原代培养及传代培养 |
| 5.2.3 茶尺蠖及枣尺蠖的原代培养 |
| 5.2.4 鞭角华扁叶蜂及月季叶蜂的原代培养 |
| 5.2.5 光肩星天牛及桑天牛的原代培养及传代培养 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 讨论 |
| 6.2.1 胚胎时期的选择与细胞能否传代继而建系的关系 |
| 6.2.2 细胞系形态的变化 |
| 6.2.3 传代方法 |
| 6.2.4 两株细胞系对杆状病毒敏感性不同原因的分析 |
| 6.2.5 胚胎来源的细胞系与颗粒体病毒敏感性的关系 |
| 6.2.6 颗粒体病毒体外复制的稳定性 |
| 6.2.7 细胞低温培养与颗粒体离体复制的关系 |
| 6.2.8 关于研制的无血清培养液 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 试剂配制及供试培养液 |
| 附录B 实验仪器及耗材型号、厂家 |
| 附录C 专有名词表 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（7）BmNPV ORF9和ORF56基因功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 文献综述:杆状病毒对宿主感染研究进展 |
| 1.1 杆状病毒分类地位 |
| 1.2 杆状病毒基因组序列 |
| 1.3 杆状病毒生活周期及对宿主的感染 |
| 1.4 杆状病毒应用 |
| 第2章 BmNPV(家蚕核型多角体病毒)ORF9基因功能分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 BmNPV(家蚕核型多角体病毒)ORF56基因功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 BmNPV转录基因组和Bm9敲除对基因组转录的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.3 讨论 |
| 本研究创新点和进一步研究方向的思考 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的论文和参加的会议 |
（8）杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 细胞凋亡 |
| 2 细胞凋亡与杆状病毒 |
| 3 本研究的内容及意义 |
| 第二章 p35基因缺失型AcMNPV抑制HearNPV诱导Tn-Hi5细胞凋亡 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 AcMNPViap1和iap2基因功能的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Ac-IAP2与昆虫细胞caspase功能的体外分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 撰写发表文章 |
| 致谢 |
（9）家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的建立及其生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 动物细胞体外培养 |
| 1.1.1 细胞体外培养相关概念 |
| 1.1.2 动物细胞体外培养技术的发展 |
| 1.2 昆虫细胞体外培养的研究进展 |
| 1.2.1 昆虫细胞培养的发展 |
| 1.2.2 昆虫细胞培养基的发展 |
| 1.2.3 昆虫细胞的培养技术的发展 |
| 1.2.4 昆虫细胞系的建立 |
| 1.2.5 昆虫细胞的应用 |
| 1.2.6 家蚕细胞培养的研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究的目的与意义 |
| 2.2 研究的主要内容 |
| 2.3 实验技术路线 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要的仪器设备 |
| 3.1.2 家蚕品种 |
| 3.1.3 病毒 |
| 3.1.4 细胞系 |
| 3.1.5 主要实验试剂 |
| 3.1.6 主要溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 取材前的准备工作 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 细胞的形态观察 |
| 3.2.4 细胞的冷藏保存与复苏 |
| 3.2.5 细胞生长曲线与群体培增时间的测定 |
| 3.2.6 细胞染色体标本的制备及核型分析 |
| 3.2.7 细胞对BmNPV病毒的敏感性试验 |
| 3.2.8 细胞骨架的观察 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 家蚕卵巢细胞系的建立 |
| 4.1.1 家蚕卵巢组织的原代培养 |
| 4.1.2 家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的建立 |
| 4.1.3 BmN-SWU1细胞系的形态 |
| 4.1.4 BmN-SWU1细胞系的传代培养 |
| 4.2 细胞的冷藏保存与复苏 |
| 4.3 BmN-SWU1细胞系的生长曲线与群体培增时间 |
| 4.4 BmN-SWU1细胞系的核型分析 |
| 4.5 BmN-SWU1细胞系对BmNPV病毒的敏感性 |
| 4.6 BmN-SWU1细胞系的细胞骨架 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 材料处理方法的选择 |
| 5.2 BmN-SWU1的细胞系染色体核型 |
| 5.3 细胞系BmN-SWU1对BmNPV病毒的敏感性 |
| 5.4 细胞系BmN-SWU1在转基因工程细胞系上的应用 |
| 第6章 小结 |
| 参考文献 |
| 主要缩略语表 |
| 在校期间发表的论文及参研课题 |
| 致谢 |
（10）菜粉蝶颗粒体病毒的分子生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 杆状病毒的分类 |
| 2 杆状病毒的宿主范围 |
| 3 杆状病毒的感染途径 |
| 4 杆状病毒的复制周期 |
| 5 杆状病毒基因组学研究 |
| 6 杆状病毒的应用 |
| 7 颗粒体病毒 |
| 第二章 菜粉蝶颗粒体病毒的分离鉴定和生物毒力测定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 菜粉蝶颗粒体病毒的体内克隆纯化、基因组物理图谱构建及比较分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论与小结 |
| 第四章 菜粉蝶颗粒体病毒 DNA polymerase基因的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论与小结 |
| 第五章 菜粉蝶颗粒体病毒基因组全序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 3 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附章 广西斜纹夜蛾核型多角体病毒的分离鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、粘虫NPV在同源胚胎细胞系内的形态发生及宿主细胞的病理变化（论文参考文献）
- [1]茶毛虫的发生规律及其感染的病毒分析[D]. 王晓庆. 西南大学, 2021
- [2]黑尾叶蝉感染水稻矮缩病毒后唾液腺转录组变化分析及其两种RNA病毒基因组结构分析[D]. 贾文茜. 浙江大学, 2021(01)
- [3]家蚕基质金属蛋白酶家族MMPs及组织金属蛋白酶抑制剂TIMP在家蚕中的功能研究[D]. 刘太行. 西南大学, 2017(10)
- [4]核型多角体病毒侵染柞蚕中肠转录组及免疫相关基因分析[D]. 李喜升. 沈阳农业大学, 2016(04)
- [5]鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立和高蛋白表达细胞克隆株的研究[D]. 郑桂玲. 山东农业大学, 2010(05)
- [6]杨扇舟蛾等几种重要林业昆虫细胞系的建立及颗粒体病毒体外增殖研究[D]. 温发园. 中国林业科学研究院, 2009(01)
- [7]BmNPV ORF9和ORF56基因功能分析[D]. 杨章女. 浙江大学, 2008(08)
- [8]杆状病毒AcMNPViap基因功能及分子机理的研究[D]. 曾宪东. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(06)
- [9]家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的建立及其生物学特性的研究[D]. 蔡秀娟. 西南大学, 2007(06)
- [10]菜粉蝶颗粒体病毒的分子生物学研究[D]. 温荣辉. 广西大学, 2007(08)