一、IL-1β对体外培养NIT-1β细胞胰岛素分泌的影响（论文文献综述）
袁燕婷[1]（2021）在《胡椒碱调控免疫炎症保护糖尿病前期小鼠胰岛功能受损的作用研究》文中认为目的肥胖使机体处于一种慢性低度炎症状态,引发巨噬细胞的聚集和M1样极化。这种现象不仅发生在内脏脂肪诱发严重胰岛素抵抗,也发生在胰岛内部。聚集的M1型巨噬细胞释放的前炎症因子会导致胰岛β细胞的去分化,功能性β细胞的数量减少,从而加剧2型糖尿病（T2D）的发生。前期研究发现胡椒碱对成年MSG糖尿病小鼠严重的代谢性炎症、糖脂代谢紊乱以及胰岛素抵抗具有良好的调控作用。因此本课题旨在研究胡椒碱是否通过抑制饮食诱导的C57肥胖小鼠内脏脂肪及胰岛内巨噬细胞的聚集和M1样极化,保护胰岛β细胞功能,从而延缓肥胖致T2D的发生。方法1.动物实验。50只7周龄雄性C57BL/6C小鼠,体重20～22 g,适应性喂养1周后,按照体重和空腹血糖（FBG）水平进行分组:正常饮食组、高脂饮食（HFD）组、罗格列酮组（4 mg/kg/day）、胡椒碱低剂量组（15 mg/kg/day）和胡椒碱高剂量组（30 mg/kg/day）,灌胃给药,每天一次,连续8周。期间密切观察动物一般情况,每周检测小鼠的体重和摄食量。通过FBG、口服糖耐量（OGTT）、血清胰岛素水平和胰岛素耐量（ITT）评价胡椒碱对HFD肥胖小鼠糖代谢紊乱的改善作用。8周时进行高葡萄糖钳夹实验,测定稳态葡萄糖输注速率（GIR）以及稳态时血清胰岛素水平,整体水平评价胡椒碱对HFD肥胖小鼠胰岛功能的保护作用。实验结束时收集血清,附睾脂肪和胰腺等组织。测定血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平。采用Elisa方法检测血清相关致炎因子IL-1β、Gal-3和LPS水平以评价胡椒碱对HFD肥胖小鼠代谢性炎症的改善作用。qPCR实验进一步检测附睾脂肪组织中IL-1β、Gal-3的mRNA水平。附睾脂肪和胰岛分别进行HE和Gomori染色进行病理学分析,并用免疫组化方法检测组织内CD11c阳性M1样巨噬细胞极化标志物和前炎症因子的表达。为了评价胡椒碱对HFD小鼠胰岛β细胞功能和去分化的影响,采用免疫荧光检测胰岛内胰岛素和胰高血糖素的表达及定位,检测β细胞功能成熟标志物Pdx1和前体标志物ALDH1A3的表达。最后采用免疫组化检测胰岛内mTOR、4E-BP1和PS6的表达探究胡椒碱保护β细胞功能的作用机制。2.细胞实验。为了证实胡椒碱通过抑制巨噬细胞M1样极化以延缓Min6细胞去分化、提高其合成胰岛素的能力。首先,胡椒碱（20、40、80μM）预处理RAW264.7巨噬细胞细胞12 h,然后加入LPS（1μg/m L）孵育24 h,刺激RAW264.7细胞发生M1样极化,采用qPCR实验检测细胞中CD11c的mRNA水平,Elisa方法测定上清液中炎症因子Gal-3和IL-1β的含量以明确胡椒碱对RAW264.7细胞M1样极化的影响。利用上述细胞上清液制备条件培养基用于处理Min6细胞（24 h）,采用免疫荧光标记检测Min6细胞中胰岛素、Pdx1和ALDH1A3的表达。然后通过WB实验分析mTOR、4E-BP1和PS6的蛋白表达水平。结果1.动物实验。胡椒碱在不影响小鼠摄食量的情况下有效防止HFD肥胖小鼠体重的快速增加。胡椒碱显着降低血清FBG、TC、TG和LDL水平,明显改善HFD肥胖小鼠糖脂代谢紊乱。OGTT和ITT结果显示胡椒碱能够改善HFD小鼠口服葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗,增强外周组织对胰岛素的敏感性,使HFD肥胖小鼠的高胰岛素血症得到显着减轻。胡椒碱能够降低血清中LPS、IL-1β和Gal-3等致炎因子的水平。qPCR结果显示,胡椒碱减少附睾脂肪内多个炎症因子的mRNA水平,尤其抑制M1样巨噬细胞标志物CD11c的表达,证实胡椒碱强大的免疫炎症调控作用。免疫组化结果进一步证实胡椒碱还抑制了胰岛内M1样巨噬细胞炎症因子的高表达。胰岛功能评价的金标准“高葡萄糖钳夹实验”结果提示胡椒碱提高了HFD肥胖小鼠稳态时的葡萄糖输注速率,并降低稳态时血清胰岛素含量,胰岛功能得到很好的保护。随后的免疫荧光实验结果显示胡椒碱提高胰岛内由β细胞分泌的胰岛素含量,降低了α细胞分泌的胰高血糖素含量。同时还促进β细胞功能成熟标志物Pdx1的高表达,降低去分化前体细胞标志物ALDH1A3的表达。免疫组化结果显示胡椒碱延缓β细胞去分化的作用与mTOR/4E-BP1/PS6的活性成正相关。2.细胞实验。qPCR结果显示,胡椒碱明显降低LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞CD11c的mRNA水平,胡椒碱对LPS诱导的巨噬细胞M1样极化具有一定抑制作用。Elisa结果表明,胡椒碱显着降低RAW264.7细胞上清液中前炎症因子（IL-1β、Gal-3）的含量,并与胡椒碱浓度呈正相关。免疫荧光实验显示,胡椒碱条件培养基明显增强Min6细胞中成熟分化标志物Pdx1表达,并降低前体标志物ALDH1A3的表达。最后,WB结果进一步证实了胡椒碱对Min6细胞功能的保护作用与mTOR/4E-BP1/PS6的表达有关。结论胡椒碱能够有效抑制HFD肥胖小鼠脂肪和胰岛内巨噬细胞的聚集和M1样极化,减轻全身代谢性炎症和胰岛内巨噬细胞的炎性浸润,有效防止HFD肥胖小鼠胰岛功能的下降及胰岛β细胞的去分化,而且此过程与mTOR/4E-BP1/PS6通路的活化密不可分。
杨召铭[2]（2021）在《人羊膜提取物对小鼠胰岛血清剥夺应激影响及其分子机制的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:随着埃德蒙顿抗免疫排斥方案的建立及完善,胰岛移植有望成为临床治疗1型糖尿病最有效的方法之一。胰岛移植具有操作安全、手术创伤小以及操作简单等优点,但目前临床上供胰短缺、需要终生使用免疫抑制药物及胰岛移植物长期存活率低等问题限制了胰岛移植的进一步发展和广泛应用。在临床胰岛移植中,为了保证供体胰岛的质控、移植受体的免疫诱导、胰岛的跨区域转运以及进一步降低胰岛移植后白细胞介导的反应等,胰岛在移植给受体前通常需要在体外培养24-72小时,目前大多数临床胰岛移植中心采用移植前体外培养48小时为胰岛移植的标准方案。临床上移植前胰岛的培养基添加物是人血清白蛋白（human serum albumin）,虽为胰岛提供了必要的渗透压条件,但缺乏血清中大量的有益于胰岛存活的因子和营养物质,使移植前培养的胰岛处于血清剥夺的应激状态中。研究表明,有多达20%的胰岛在移植前体外培养阶段丢失,造成了胰岛移植中移植物数量不足并进一步加剧了供胰短缺等问题,影响胰岛移植治疗糖尿病的效果。因此,预防和减少血清剥夺应激引起的胰岛凋亡,保护胰岛活性和功能,可以提高胰岛移植的效率。人羊膜提取物（human amniotic membrane extract）是一种安全可靠且来源丰富的生物材料,目前临床上已被应用于角膜等疾病的治疗。研究表明,人羊膜提取物具有促进组织修复愈合、抵抗乏氧应激损伤,保护细胞活性和功能等生物特性,同时由于人羊膜提取物含有丰富的细胞生长因子,有利于细胞的增殖。因此,本研究拟构建小鼠原代胰岛移植前体外培养胰岛血清剥夺应激模型,通过系列实验验证人羊膜提取物对血清剥夺应激下小鼠原代胰岛的保护作用,探索人羊膜提取物对胰岛保护作用可能的分子机制,为临床胰岛移植及移植前胰岛保存领域提供一种新思路。研究方法:1.收集健康剖宫产孕妇人羊膜并制备人羊膜提取物;利用Bradford试剂盒检测人羊膜提取物总蛋白含量。2.利用AO/EB试剂盒,检测人羊膜提取物在不同浓度（0-1.5 mg/m L）下对体外培养48小时后血清剥夺应激胰岛活性的影响。3.利用TUNEL试剂盒,检测人羊膜提取物在不同浓度（0-1.5 mg/m L）下对体外培养48小时后血清剥夺应激胰岛凋亡的影响。4.利用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒,检测人羊膜提取物在不同浓度（0-1.5 mg/m L）下对体外培养48小时后血清剥夺应激胰岛细胞胰岛素分泌功能的影响。5.利用Western Blot检测添加人羊膜提取物培养后胰岛细胞中Akt、ERK1/2蛋白及其磷酸化表达水平。6.利用Western Blot检测添加人羊膜提取物培养后胰岛细胞中Bcl2、BAX、Cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白表达水平。7.利用链脲佐菌素（STZ）构建雄性C57BL/6小鼠糖尿病同系移植受体模型。8.利用肾被膜下注射进行胰岛肾被膜下移植。9.利用非禁食血糖、体重监测及腹腔注射葡萄糖糖耐量实验（IPGTT）评价胰岛移植的效果。10.利用HE染色、免疫组化染色及免疫荧光染色观察胰岛移植物组织形态学特征。11.利用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒,检测胰岛移植物胰岛素含量。12.利用蛋白LC-MS/MS鉴定分析,检测人羊膜提取物中蛋白质丰度及蛋白质成分。13.利用ELISA试剂盒,检测人羊膜提取物中TIMP-1、EGF、HGF、IL-1RA细胞生长因子浓度。结果:1.成功制备人羊膜提取物,其总蛋白含量为2.65±0.41 mg/m L,将制备好的人羊膜提取物置于-80℃保存备用。2.体外培养48小时后,血清剥夺对照组胰岛活性明显低于正常血清组胰岛（P<0.0001）,添加人羊膜提取物显着提高血清剥夺应激胰岛的活性,在人羊膜提取物浓度为0.5 mg/m L时达到峰值（P<0.001）。3.体外培养48小时后,血清剥夺对照组胰岛凋亡明显高于正常血清组胰岛（P<0.0001）,添加人羊膜提取物显着减少血清剥夺应激胰岛的凋亡,在人羊膜提取物浓度为0.5、1.0 mg/m L时达到峰值（P<0.0001）。4.体外培养48小时后,血清剥夺对照组胰岛细胞在高糖（16.8 m M）刺激下胰岛素分泌功能较正常血清培养组胰岛明显下降（P<0.0001）,但两组在低糖（2.8 m M）下的胰岛素分泌量无明显差别;添加人羊膜提取物不影响胰岛细胞在低糖（2.8 m M）下胰岛素分泌量,但在添加浓度为0.5、1.0 mg/m L人羊膜提取物时能显着增加高糖（16.8 m M）刺激下胰岛细胞的胰岛素分泌量,且在人羊膜提取物浓度为0.5 mg/m L时达到峰值（P<0.0001）。5.体外培养48小时后,人羊膜提取物（0.5 mg/m L）显着提高血清剥夺应激胰岛细胞中Akt（P<0.01）、ERK1/2（P<0.001）的蛋白磷酸化水平。6.体外培养48小时后,人羊膜提取物（0.5 mg/m L）显着提高血清剥夺应激胰岛细胞中Bcl2、BAX比值（P<0.01）,且人羊膜提取物显着降低血清剥夺应激胰岛细胞中Cleaved Caspase 3的表达（P<0.01）。7.成功构建同系小鼠肾被膜下胰岛移植模型;体外培养48小时后,添加人羊膜提取物培养的胰岛相对于血清剥夺对照组胰岛具有更好的血糖控制能力（P<0.0001）;相对于血清剥夺对照组,人羊膜提取物组糖尿病受体小鼠体重明显增高（P<0.0001）;添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后,糖尿病受体小鼠恢复至正常血糖水平的比例更高（P<0.01）。8.相对于血清剥夺对照组,添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后具有更强的血糖清除能力（P<0.0001）。9.组织病理结果显示,添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后能在局部定植并存活,且移植物中明显可见胰岛素和胰高血糖素阳性细胞。10.相对于血清剥夺对照组,添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后移植物胰岛素含量明显更高（P<0.0001）。11.蛋白质谱结果表明,人羊膜提取物成分稳定,含有调节内皮细胞的增殖、血管生成、细胞凋亡、免疫调节关键蛋白质。12.人羊膜提取物中含有促进胰岛存活的关键生长因子,且-80℃超低温保存稳定（P>0.05）。结论:在48小时体外培养过程中,人羊膜提取物能明显提高血清剥夺应激胰岛的活性、降低血清剥夺应激胰岛细胞的凋亡、改善血清剥夺应激胰岛的胰岛素分泌功能,且人羊膜提取物最佳作用浓度为0.5 mg/m L;人羊膜提取物能显着提高血清剥夺应激胰岛细胞内Akt、ERK1/2蛋白的磷酸化水平;人羊膜提取物能显着提高血清剥夺应激胰岛细胞内Bcl2、BAX蛋白表达的比例,降低Cleaved Caspase 3的表达;添加人羊膜提取物培养的胰岛移植后能更有效地治疗小鼠糖尿病;人羊膜提取物成分稳定,含有调节细胞凋亡等关键蛋白,且含有促进胰岛细胞存活的生长因子。
李伟[3]（2020）在《SREBP-1c对胰岛星状细胞活化及其介导胰岛功能改变的影响》文中认为目的:本课题组既往采用组织块外生法分别从大小鼠及人胰岛提取出胰岛星状细胞（Islet Stellate Cell,ISC）,并观察了其在2型糖尿病胰岛纤维化发生发展过程中的潜在作用。但既往研究并未明确ISC在胰岛内的含量与定位,且外生法分离的ISC由于分离技术的限制,其本身可能会受到胰岛分泌的各类激素等影响而造成ISC性状改变,同时不便于获取纯度较高的静息态ISC来实现与活化态ISC的比较。ISC在活化过程中的一个重要形态学改变是胞内脂滴的丢失,而参与脂滴形成的重要成员之一—胆固醇调节元件结合蛋白1c（Sterol Regulatory Element Binding Proteins-1c,SREBP-1c）作为脂肪酸合成的关键因子在ISC高度同源的肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell,HSC）活化过程中发挥着重要调控作用,SREBP-1c对于ISC生物学特性及ISC介导的胰岛功能改变的影响值得进一步探索。基于以上背景,本研究拟:（1）明确ISC在胰岛内的确切定位、含量及其与胰岛各类细胞之间的分布关系;（2）探索一种静息态ISC的分离方法,比较新方法与传统外生法分离获得的ISC在生物学性状上的差异;（3）阐明SREBP-1c对ISC生物学特性的影响;（4）探究SREBP-1c感染的ISC对胰岛功能的影响。方法:1、借助免疫荧光染色及电镜染色手段,观察ISC在大小鼠及人胰岛中的定位及其与胰岛血管内皮细胞（Islet Endothelial Cell,IEC）的关系;胰岛体外培养过程中胰岛内IEC,ISC及其分泌的细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）成分的改变。2、利用密度梯度离心法分离获取静息态ISC,同时以外生法获得的ISC作为对照,通过相差显微镜观察、油红O染色及紫外光激发下的自发荧光鉴定静息态ISC。通过免疫荧光及Western Blot对α平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）、Desmin、Vimentin、胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Portein,GFAP）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ,Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ,Col-Ⅲ）、纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）的观察鉴定活化态ISC并比较不同方法提取ISC活化程度及胞外基质产生的差异。油红O染色比较不同方法提取的ISC脂滴消失速率差异;划痕实验及Transwell小室实验比较不同方法分离ISC在迁移速率上的差异;CCK8实验检测不同方法分离ISC在增殖速率上的差异。3、分别取新分离的静息态ISC、体外培养3d及7d的ISC,提取总RNA并比较这三组间ISC活化、脂质合成、ECM分泌及炎症相关基因的差异,免疫荧光染色观察ISC活化过程中SREBP-1c与α-SMA之间的关系。采用慢病毒感染方式实现ISC内SREBP-1c的过表达（Lenti-SREBP-1c组）,同时设立过表达随机片段的对照组（Lenti-GFP组）。油红O染色观察SREBP-1c对ISC脂滴形成的影响;基因及蛋白层面观察SREBP-1c对ISC活化接ECM合成的影响;Ki-67染色及p-ERK的检测观察两组ISC增殖差异;划痕实验及p-AKT的检测观察ISC迁移差异。4、分别使用Lenti-SREBP-1c及Lenti-GFP组ISC包被胰岛,同时设立未包被的对照胰岛（此三组胰岛的命名分别为co-ISC-SRE,co-ISC-con与con组）。将这3组胰岛分别在含5.5mM葡萄糖及含20mM葡萄糖的培养基中培养24h。随后将各组胰岛在含2mM葡萄糖、20mM葡萄糖及30mM KCl的KRB缓冲液中孵育30min,收集上清通过ELISA检测胰岛素及胰高血糖素浓度观察不同状态ISC包被胰岛对胰岛功能的影响。结果:1、大小鼠及人胰腺石蜡切片中均可以观察到Desmin阳性的ISC存在于胰岛内,大小鼠胰岛的外周及中央均可见ISC分布,人胰岛中则仅在周边观察到ISC。共定位分析及电镜结果显示,ISC主要分布于胰岛血管内皮细胞周边（约50%的ISC与CD31阳性的IEC存在共定位）。胰岛在体外培养过程中随着时间延长,IEC数量逐渐减少,而ISC及其所分泌的ECM成分则呈现时间依赖的升高。高脂喂养10w的小鼠胰岛内ISC含量并未显着升高,却倾向于呈现为一种聚集状态。2、采用密度梯度离心法（DGC法）可以从胰岛中分离出胞内富含脂滴且在紫外光激发下自发荧光的ISC,它在体外培养后表达活化态标志α-SMA并能分泌ECM。DGC法分离的ISC在体外培养24h、48h及96h时后平均每个细胞内油红O染色阳性面积均高于同样时间点外生法分离的ISC,且在α-SMA表达、FN分泌、迁移及增殖速率上均弱于传统外生法分离的ISC。3、随着ISC在体外培养过程中逐渐活化,其活化标志物α-SMA、ECM成分（Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN）、炎症因子（IL-1α、CCL2及CCL7）等成分的mRNA显着上调,而参与脂质代谢相关的基因PPARγ（培养7d比培养0d低5.46倍,P<0.01）、SREBP-1c（培养7d比培养0d低28.8倍,P<0.01）则显着下调。免疫荧光实验进一步证实SREBP-1c与α-SMA在体外培养3d的ISC内呈现出一种反向趋势。过表达实验显示Lenti-SREBP-1c组ISC的α-SMA及ECM成分无论在mRNA水平还是蛋白水平均弱于Lenti-GFP组,且部分细胞开始重新出现脂滴,但两组间增殖和迁移无统计学差异。4、不同状态ISC包被的胰岛在正常葡萄糖浓度（5.5mM）培养后再进行高糖（20mM）、高钾（30mM）刺激时,co-ISC-con组胰岛素释放最低,co-ISC-SRE组次之,con组为最高,但仅在co-ISC-con组和con组之间可以观察到显着的统计学差异。同时co-ISC-con组高糖及高钾刺激下的胰高血糖素分泌减少最为明显。但各组胰岛在经过高糖（20mM）培养24h后再行高糖、高钾刺激时,co-ISC-con组的胰岛素释放指数反而最高,且该组胰高血糖素在刺激后的含量显着低于co-ISC-SRE组但与con组比较接近。结论:1、ISC存在于胰岛内并有将近一半分布于胰岛血管内皮细胞周边。高脂喂养的小鼠胰岛ISC分布倾向于呈现为一种聚集状态。2、密度梯度离心法可成功分离静息态ISC,该法分离的ISC与传统外生法分离的ISC相比活化、胶原合成、增殖及迁移能力均较弱。3、SREBP-1c过表达可以抑制ISC的活化及ECM成分的分泌,并可使活化态的ISC内重新出现脂滴,但SREBP-1c并不影响ISC的增殖和迁移。4、胰岛周围糖浓度正常时,即便是活化态的ISC对胰岛功能的影响也比较微弱;而在短期高糖刺激下,活化态ISC包被的胰岛会促使胰岛β细胞分泌更多的胰岛素,并使胰高血糖素的分泌减少,但静息态的ISC包被的胰岛则会抑制这种胰岛素过度分泌及胰高血糖素分泌降低的现象。
罗明昊[4]（2020）在《白细胞介素-1β在脓毒血症血管功能障碍中的作用及机制研究》文中提出目的:研究白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）在脓毒血症血管功能障碍中的作用及其可能的相关机制方法:1.动物实验:采用盲肠结扎与穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）模型诱导C57BL/6小鼠脓毒血症血管功能障碍。将小鼠随机分为假手术组（sham operation,SO）,CLP组,CLP+MCC950（IL-1β抑制剂）组,CLP+Diacerein（IL-1β抑制剂）组,CLP+MG132（蛋白酶体抑制剂）组,SO+BMY7378(α1D-肾上腺素受体抑制剂)组,CLP+BMY7378组,CLP+BMY7378+MCC950组,CLP+BMY7378+Diacerein组（n≥5）。观察术后一周生存率变化,术后24小时用尾套法测定平均动脉压（MAP）,用血管张力实验检测肠系膜上动脉血管舒张功能与收缩功能变化,用Western blot观察肠系膜动脉内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）与α1肾上腺素受体（α1-adrenergic receptor,α1-AR）蛋白表达量变化,用RT-qPCR检测肠系膜动脉α1-AR三种亚型(α1A-AR,α1B-AR,α1D-AR)mRNA水平变化。2.细胞实验:人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）进行原代培养。将HUVECs随机分为对照组（control）,IL-1β处理组（不同浓度处理组与处理不同时间组）,MG132+IL-1β处理组（n≥5）,用Western blot检测HUVECs eNOS蛋白表达量变化。结果:1.动物实验:MCC950和Diacerein预处理均显着改善小鼠CLP术后一周生存率的下降、术后24小时平均动脉压的下降、肠系膜上动脉血管舒张功能与收缩功能的受损、肠系膜动脉eNOS与α1-AR蛋白表达量的降低、α1-AR三种亚型(α1A-AR,α1B-AR,α1D-AR)mRNA水平的降低。MG132预处理的小鼠,CLP术后一周生存率、肠系膜上动脉血管舒张功能、肠系膜动脉eNOS蛋白表达量显着改善。MCC950和Diacerein对小鼠CLP术后一周生存率的改善均可被BMY7378显着抑制。2.细胞实验:与对照组相比,IL-1β显着下调HUVECs中eNOS蛋白表达,呈浓度依赖性以及时间依赖性。MG132预处理能显着阻断IL-1β下调HUVECs eNOS的作用。结论:白细胞介素-1β可通过下调eNOS与α1D-AR表达分别参与脓毒血症血管内皮功能障碍与收缩功能障碍,eNOS的下降可能通过泛素-蛋白酶体降解途径引起。
彭小波[5]（2020）在《血浆β-淀粉样肽40和42与糖调节受损和2型糖尿病的关联性及其机制研究》文中研究指明2 型糖尿病（type 2 diabetes,T2D）和阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是两种常见的年龄相关疾病。伴随着全球人口老龄化的加剧,它们的发病率和患病率都在不断攀升。目前,全球T2D患者人数高达4.63亿,同时痴呆人数超过5000万（AD患者占50-60%）。大量流行病学证据表明,T2D和AD之间存在双向关联。T2D患者的AD发病风险是非T2D人群的1.53倍。同时,AD患者也较认知正常人群呈现出更为严重的葡萄糖和胰岛素代谢受损。尽管已经发现T2D和AD之间存在许多共同的病理特征,包括胰岛素抵抗、蛋白错误折叠、炎症、氧化应激以及血管功能障碍,但是T2D和AD之间关联的分子机制仍不清楚。因此,积极探索T2D和AD的关联机制,可能为两者的共同防治提供新思路。β-淀粉样肽（β-amyloid,Aβ）是AD的特征性标志物之一,其主要存在形式是Aβ40和Aβ42。在AD患者脑中,Aβ大量生成并且聚集形成老年斑,因而脑脊液Aβ水平检测和脑组织Aβ沉积造影被作为重要的AD诊断方法。值得注意的是,超过40%的脑内的Aβ会通过多种途径转运至外周。同时,考虑到腰椎穿刺的创伤性以及Aβ沉积造影的昂贵花费,血浆Aβ作为可能的AD标志物而备受关注。一项基于队列研究的meta分析结果表明,AD患者的血浆Aβ40和Aβ42水平较认知正常人群显着升高。此外,动物实验表明血浆Aβ升高能够引起外周胰岛素抵抗。进一步研究发现,针对血浆Aβ的主动或被动免疫能够改善实验动物的胰岛素抵抗状态。截至目前,几项横断面研究比较了 T2D和非T2D人群血浆Aβ40和Aβ42水平的差异,但未得出一致结论,而且尚未见相关的前瞻性研究。外周胰岛素抵抗是T2D的主要发病机制之一。早期研究表明,Aβ能够通过多种机制诱导神经细胞的胰岛素抵抗的发生。同时,体外研究发现Aβ25-35能直接减弱胰岛素对肝细胞糖异生的抑制作用,而Aβ40和Aβ42是否具有相同作用尚不清楚。除了抑制糖异生,促进细胞对葡萄糖的摄取利用也是胰岛素调控血糖的重要途径,其中骨骼肌细胞是主要靶细胞之一。然而,尚无研究探讨Aβ40和Aβ42对骨骼肌细胞的胰岛素敏感性的影响。因此,本研究拟开展大样本量的病例对照研究,探讨血浆Aβ40和Aβ42水平与糖调节受损（impaired glucose regulation,IGR）和T2D患病风险的关联性;采用前瞻性巢式病例对照设计,进一步探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的关联性;通过体外研究,探讨Aβ40和Aβ42对人肝癌细胞株HepG2和小鼠成肌细胞系C2C12的胰岛素敏感性的影响,为流行病学研究提供机制依据。本研究的主要内容分为以下三个部分:第一部分血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病患病风险的关联性目的:探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险的关联性。方法:采用病例对照设计,以2012年至2015年期间在武汉市同济医院进行糖尿病筛查的人群为研究对象,纳入571例新诊断的IGR患者、1063例新诊断的T2D患者和1063例按照年龄（±3岁）、性别以及载脂蛋白E ε4等位基因（apolipoprotein E ε4,APOE ε4）携带状况进行匹配的对照。血浆Aβ40和Aβ42水平采用电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA）同时测定。采用多因素条件logistic回归模型分析血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险的关联性。校正因素包括年龄、性别、体质指数（body mass index,BMI）、APOEε4携带状况、吸烟状况、饮酒状况、运动状况、家族糖尿病史和高血压患病史。结果:IGR组、T2D组和对照组的血浆Aβ40水平分别为134.09（118.70-153.61）ng/L、134.45（117.99-154.58）ng/L 和 126.99（114.36-144.85）ng/L;血浆 Aβ42水平分别为 13.25（10.78-16.59）ng/L、13.25（11.04-16.14）ng/L 和 12.21（10.00-14.94）ng/L。与对照组相比,IGR组和T2D组的血浆Aβ40和Aβ42水平都显着较高（P<0.001）。血浆Aβ40水平的最高四分位组（Q4）与最低四分位组（Q1）相比,IGR和T2D的多因素校正风险比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（confidence interval,CI）分别为 2.06（1.38-3.06）和 1.96（1.45-2.65）。血浆 Aβ40水平每增加30 ng/L,IGR和T2D患病风险分别升高19%（4%-37%）和28%（14%-43%）。血浆Aβ42水平的Q4组与Q1组相比,IGR和T2D的多因素校正OR（95%CI）分别为 1.80（1.25-2.60）和 2.01（1.50-2.69）。血浆 Aβ42 水平每增加 5 ng/L,IGR和T2D患病风险分别升高39%（19%-62%）和37%（21%-55%）。在几乎全部亚组中,血浆Aβ40和Aβ42与IGR&T2D仍存在显着正关联。血浆Aβ40与IGR&T2D的关联在不运动的人群（P-交互=0.008）中更强。血浆Aβ42与IGR&T2D的关联在小于等于50岁的人群（P-交互<0.001）、男性（P-交互=0.016）或不运动的人群（P-交互=0.004）中更强。与血浆Aβ40和Aβ42水平都处于最低三分位的人群相比,血浆Aβ40和Aβ42水平都处于最高三分位的人群的IGR和T2D患病风险分别为3.38倍和2.96倍。结论:本研究表明,血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D患病风险存在显着正关联。然而,血浆Aβ40和Aβ42与T2D的关联性仍需在前瞻性研究中进一步验证。第二部分血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病发病风险的前瞻性关联目的:探究血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的前瞻性关联。方法:基于同济-鄂州队列开展巢式病例对照研究,纳入100例新发IGR患者、121例新发T2D患者和442例依据年龄（±3岁）、性别进行匹配的对照。基线血浆Aβ40和Aβ42水平采用ECLIA同时测定。采用多因素条件logistic回归模型分析血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险的关联性。校正因素包括年龄、性别、BMI、吸烟状况、饮酒状况、运动状况、家族糖尿病史和高血压患病史。结果:IGR组、T2D组和对照组的血浆Aβ40水平分别为143.98（123.73-175.24）ng/L、142.91（122.18-177.23）ng/L 和 128.82（112.33-152.32）ng/L;血浆 Aβ42水平分别为 13.96（11.03-17.50）ng/L、13.92（11.29-17.86）ng/L 和 12.21（10.31-15.10）ng/L。与对照组相比,IGR组和T2D组的血浆Aβ40和Aβ42水平都显着较高（P<0.001）。校正多个混杂因素后,与血浆Aβ40水平的Q1组相比,血浆Aβ40水平Q4 组的 IGR 和 T2D 的 OR（95%CI）分别为 3.33（1.56-7.13）和 3.79（1.81-7.94）。血浆Aβ40水平每增加30 ng/L,IGR和T2D的发病风险分别升高54%（23%-92%）和47%（15%-88%）。与血浆Aβ42水平的Q1组相比,血浆Aβ42水平Q4组的IGR和 T2D 的 OR（95%CI）分别为 2.85（1.27-6.39）和 2.88（1.44-5.75）。血浆 Aβ42水平每增加5 ng/L,IGR和T2D的发病风险分别升高64%（20%-124%）和53%（19%-96%）。除了按年龄和吸烟状况分层的亚组外,所有亚组中血浆Aβ40和Aβ42与IGR&T2D仍存在显着正关联。结论:本研究表明,血浆Aβ40和Aβ42水平与IGR和T2D发病风险存在显着正关联。然而,血浆Aβ40和Aβ42增加T2D发病风险的机制仍需进一步研究探讨。第三部分β-淀粉样肽40和42对HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性的影响目的:探究Aβ40和Aβ42对HepG2细胞和C2C12细胞胰岛素敏感性的影响。方法:HepG2细胞和C2C12细胞复苏后接种于培养皿中,每日观察细胞状态及密度,当细胞铺满80%时进行传代。按实验所需将细胞接种于96孔或12孔板中,HepG2细胞完全贴壁即可用于实验,而C2C12细胞分化形成肌管才可用于实验。采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,确定Aβ处理时间为48 h,确定实验分组如下:（1）空白对照组:等量培养液;（2）胰岛素组（insulin）:100 nM insulin;（3）Aβ40 低剂量组（Aβ40-L）:2 μMAβ40+100 nM insulin;（4）Aβ40 中剂量组（Aβ40-M）:10 μM Aβ40+100 nM insulin;（5）Aβ40 高剂量组（Aβ40-H）:20 μM Aβ40+100 nM insulin;（6）Aβ40-1 组（Aβ40 反氨基酸序列对照物）:20 μM Aβ40-1+100 nM insulin;（7）Aβ42 低剂量组（Aβ42-L）:2μM Aβ42+100 nM insulin;（8）Aβ42 中剂量组（Aβ42-M）:10 μM Aβ42+100 nM insulin;（9）Aβ42 高剂量组（Aβ42-H）:20μMAβ42+100 nM insulin;（10）Aβ42-1 组（Aβ42 反氨基酸序列对照物）:20 μM Aβ42-1+100 nM insulin。将12孔板按以上分组进行Aβ处理,采用葡萄糖合成实验评估Aβ对HepG2细胞胰岛素敏感性的影响;采用葡萄糖摄取实验评估Aβ对C2C12细胞胰岛素敏感性的影响。结果:（1）与空白对照组相比,胰岛素组HepG2细胞的葡萄糖合成降低了 27%（P<0.05）。Aβ40和Aβ42能够剂量依赖性地减弱胰岛素的作用,Aβ40高剂量组的葡萄糖合成与空白对照组无显着差异。与胰岛素组（73%±6%）相比,Aβ40中剂量组（84%±1%）和Aβ40高剂量组（95%±11%）的葡萄糖合成显着升高（P<0.05）。同样,Aβ42中剂量组（84%±1%）和Aβ42高剂量组（88%±4%）的葡萄糖合成也显着高于胰岛素组（P<0.05）。与之相反,Aβ40-1和Aβ42-1组的葡萄糖合成与胰岛素组相比无显着差异。（2）与空白对照组相比,胰岛素组C2C12细胞的葡萄糖摄取增加了 153%（P<0.05）。Aβ40和Aβ42能够剂量依赖性地减弱胰岛素的作用,但与空白对照组相比,Aβ40高剂量组和Aβ42高剂量组的葡萄糖摄取仍分别增加了100%和60%（P<0.05）。与胰岛素组（253%±25%）相比,Aβ40高剂量组（202%±15%）的葡萄糖摄取显着降低（P<0.05）,同时Aβ42中剂量组（199%±9%）和Aβ42高剂量组（160%±6%）的葡萄糖摄取也显着降低（P<0.05）。然而,Aβ40-1和Aβ42-1组的葡萄糖摄取与胰岛素组相比无显着差异。结论:Aβ40和Aβ42能够降低HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性,且随着浓度增加,其作用强度增强。Aβ40-1和Aβ42-1对HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性无显着作用,提示氨基酸序列可能是Aβ40和Aβ42诱导外周胰岛素抵抗的重要基础。然而,Aβ40和Aβ42诱导肝细胞和骨骼肌细胞的胰岛素抵抗的具体分子机制需要进一步研究探讨。
刘新[6]（2020）在《Kdm2a对小鼠胰岛β细胞的影响及其机制研究》文中研究说明目的:研究Kdm2a对小鼠胰岛β细胞生理功能的影响及其可能的机制。方法:1.复苏小鼠胰岛β细胞系（NIT-1细胞）,细胞培养后分成3组,分别加入STZ（Streptozotocin,链脲佐菌素）、细胞因子（TNF-α/IL-1β/IFN-γ）及PA（Palmitate,棕榈酸）后刺激相应时间,用免疫蛋白印迹的方法检测NIT-1细胞内Kdm2a在刺激前后的变化。2.建立诱导型胰腺β细胞特异性敲除Kdm2a的小鼠模型:我们设计并繁殖出FLP转基因小鼠即Kdm2af/f小鼠,将Kdm2af/f小鼠和Ins1-Cre ERT2小鼠进行回交,将后代中基因型为Ins1-Cre ERT2-Kdm2af/f的雄性小鼠作为诱导敲除组（KO组）,将基因型为Kdm2af/f的小鼠作为对照组（CON组）。连续5天,给予两组小鼠腹腔注射雌激素类似物他莫昔芬（Tamoxifen）,诱导KO组小鼠β细胞内Kdm2a敲除。取两组小鼠的胰岛组织、肝脏组织、下丘脑组织以及肌肉组织,通过Western Blotting验证Kdm2a仅在KO组小鼠的胰岛β细胞内敲除。3.第一批小鼠在他莫昔芬诱导敲除后不进行处理,继续饲养且持续监测其随机血糖。诱导敲除后第4周进行IGTT（Intraperitoneal glucose tolerance test,腹腔葡萄糖耐量实验）和ITT（Insulin tolerance test,胰岛素耐受实验）。诱导敲除后第7周,小鼠内眦静脉取血,用ELISA试剂盒检测血清胰岛素水平,同时提取小鼠胰岛,进行GSIS（Glucose stimulated insulin secretion,葡萄糖刺激胰岛素分泌）检测。实验结束后处死小鼠,取胰腺组织制作石蜡切片,通过HE染色（Hematoxylin-eosin staining,苏木素伊红染色）和免疫荧光染色分别检测胰岛细胞团面积与胰岛内胰岛素含量。4.第二批小鼠在他莫昔芬诱导敲除后第7天开始糖尿病造模,对两组小鼠进行连续5天的腹腔注射小剂量STZ,并从开始打药时（第0天）持续监测随机血糖,当小鼠血糖值连续两天超过13.9 mmol/L即被判定为糖尿病。STZ开始处理后第28天,统计小鼠的糖尿病发病率。实验结束后处死小鼠,用ELISA试剂盒检测血清胰岛素水平,同时取胰腺组织制作石蜡切片,HE和免疫荧光染色分别检测小鼠的胰岛细胞团面积及胰岛内胰岛素含量。5.用Lipofectamine 3000将Kdm2a siRNA转染进入NIT-1细胞内,对照组细胞用相同的方法转染Scramble siRNA,两组细胞均用细胞因子（TNF-α/IL-1β/IFN-γ）刺激24h。刺激结束后进行AnnexinⅤ和PI染色,流式细胞仪上机检测凋亡细胞比例。结果:1.STZ或细胞因子刺激NIT-1细胞后,细胞内Kdm2a表达水平明显升高。PA刺激NIT-1细胞后,细胞内Kdm2a表达水平明显降低。2.Western Blotting结果显示:他莫昔芬仅诱导KO组小鼠胰岛β细胞内Kdm2a的缺失,对胰岛外组织内Kdm2a的表达无任何影响。3.他莫昔芬诱导敲除后第3周,与CON组相比,KO组小鼠随机血糖值逐渐升高。到第4周时,KO组小鼠的葡萄糖耐量明显受损,但两组小鼠的胰岛素敏感性均正常。诱导敲除后第7周,在体外高糖刺激条件下,KO组小鼠胰岛的胰岛素分泌不足,同时KO组小鼠血清胰岛素水平降低,胰岛内胰岛素含量降低,但胰岛细胞团面积与CON组比较无明显差异。4.小鼠腹腔多次小剂量注射STZ后第5天,KO组和CON组小鼠随机血糖均逐渐升高,但KO组小鼠的升高幅度明显高于CON组。STZ开始处理后第28天,12只KO组小鼠中有11只发病,13只CON组小鼠有7只发病。分析结果显示,KO组小鼠糖尿病的发病率明显高于CON组,KO组小鼠血清胰岛素含量明显减少,且KO组小鼠胰岛内胰岛素含量和胰岛细胞团面积明显低于CON组。5.转染Kdm2a siRNA的NIT-1细胞,在细胞因子刺激后,其凋亡细胞的比例明显高于对照组。结论:小鼠胰岛β细胞特异性敲除Kdm2a后,β细胞胰岛素分泌功能受损,且小鼠对多次小剂量STZ诱导的糖尿病的耐受能力降低。
马姝月[7]（2019）在《甘露糖调节内质网应激减轻Ⅰ型糖尿病早期胰岛炎症研究》文中研究表明Ⅰ型糖尿病（Type 1 diabetes,T1D）是一种慢性器官特异性自身免疫疾病,通常认为T1D是由于胰岛β细胞被自身反应性T细胞破坏而致病,因此导致自身胰岛素分泌绝对缺乏,属于胰岛素依赖性糖尿病。其首选治疗方案为模拟胰岛素分泌治疗,但仍有血糖控制不良、急慢性并发症发病率高等问题。为了更加稳定地控制血糖、减少治疗的副作用,有必要研发新的、更安全有效的治疗策略,靶向免疫系统和β细胞内源性途径的多种药物联合治疗策略将可能是未来治疗T1D的发展方向。越来越多的证据表明,内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）与多种自身免疫性疾病密切相关。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）是具有多种功能的细胞器,负责蛋白折叠、钙的储存以及促凋亡和抗凋亡通路的信号传导,对于建立细胞稳态有着不可或缺的作用。慢性炎症和异常环境因素会造成ER稳态失衡发生ERS。当ER中错误折叠蛋白过度累积时,细胞通过激活非折叠蛋白反应（UPR）的三条典型信号通路进行应答,这三条信号通路与内质网膜上的3种跨膜蛋白有关,即:阻抗性激酶lα（inositol re-quiring protein l-alpha,IRE1）,双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶（PRK-like ER associated kinase,PERK）和活化的转录因子6（activating transcriptionfactor6,ATF6）。正常生理状态下,这些跨膜蛋白与内质网分子伴侣（Bip或GRP78）稳定结合,发生ERS时,BiP表达上调,激活UPR中上游调控组件IRE1α,ATF6和PERK,分别从转录、翻译层面减慢蛋白质合成速率,共同作用减少内质网错误折叠蛋白负荷。然而在病理条件下,UPR的慢性激活可导致细胞功能障碍和细胞死亡。同时,硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）作为一种硫氧还蛋白（TRX）结合蛋白,会使ERS情况恶化,参与内质网破坏性应激过程的起始、未折叠蛋白反应、炎症和细胞死亡等。近年来研究显示:ERS作为T1D早期重要的病理特征,参与T1D的启动和发展。胰岛β细胞作为专职分泌细胞,具有非常发达并受到精细调控的ER。遗传因素和包括病毒感染、化学物质暴露、活性氧增加、血糖异常、胰腺炎症等环境因素均参与诱导胰岛β细胞发生持续病理性ERS,促进β细胞功能受损及死亡。胰岛β细胞ERS相关基因位点差异与T1D易感性密切相关。在非肥胖型糖尿病（Nonobese diabetic,NOD）小鼠模型和T1D易感人群中,β细胞ER关键基因突变及功能缺失加速T1D发生及加重病情。在NOD小鼠模型、病毒感染诱导的T1D大鼠模型以及临床T1D病人的研究中,均发现β细胞ERS标志分子表达的显着增加出现在T1D发生之前。另外,最新研究显示病理性ERS可通过诱导胰岛β细胞内异常的蛋白质翻译后修饰,产生“Neo-antigenic peptides”,进而活化潜在的自身反应性T细胞,以启动或加剧T1D进展。有文献报道在糖尿病前期使用ERS化学缓解剂牛磺熊脱氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid,TUDCA）可显着降低T1D小鼠模型的糖尿病发生率;以ABL-IRE1α信号为靶点,可以削弱胰岛β细胞ERS逆转自身免疫性糖尿病。因此ER可能成为治疗T1D的新关键靶标。甘露糖天然存在于许多植物中,特别是蔓越莓。在生理条件下,机体内甘露糖的血液浓度低于葡萄糖的五十分之一,主要参与某些蛋白质的糖基化。临床上甘露糖可用于治疗先天性Ib型糖基化紊乱及细菌性尿路感染。有研究显示:甘露糖能抑制伤口愈合时的炎症反应,可直接清除体内过剩自由基和脂质过氧化物,有效防止或减轻氧自由基导致的组织氧化损伤。最近研究发现甘露糖可以促进具有免疫抑制功能的调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）的分化可改善自身免疫性及过敏性炎症。口服甘露糖还可改变肠道微生物,改善宿主代谢预防高脂饮食诱导的肥胖;还能通过抑制IL-6分泌增强牙周韧带干细胞的免疫调节作用。另外有研究发现,甘露糖能通过干扰葡萄糖代谢抑制肿瘤生长,并且联合化疗可以促进肿瘤细胞凋亡。这些研究使甘露糖的功能及作用备受瞩目。鉴于胰岛β细胞受到遗传及环境因素的影响而发生持续性病理性ERS,是T1D重要的致病因素,而甘露糖具有抗氧化、抗炎等广泛的生物学活性,本研究拟探讨甘露糖能否改善胰岛β细胞病理性ERS,从而保护胰岛β细胞功能并促进其存活,进而改善胰岛炎症,为甘露糖将来应用于临床防治T1D提供理论基础及实验数据。具体而言我们做了以下工作。在第一部分的研究中,分离各时间点的正常饮水（对照）组或饮甘露糖溶液（实验）组NOD小鼠胰腺组织,进行H&E染色,做胰岛病理评分。结果显示:与对照组相比,实验组NOD小鼠胰腺组织在处理1、2、3、7周时,均显示出明显减少的胰岛淋巴细胞浸润以及明显减轻的胰岛炎症。为检测口服甘露糖对NOD小鼠外周淋巴细胞的影响,分离各组NOD小鼠的脾脏及肠系膜淋巴细胞,利用流式细胞技术检测淋巴细胞表面抗原CD3、CD4、CD8、CD25,胞内细胞因子IFN-γ分泌及转录因子Foxp3表达。结果显示:与对照组相比,实验组NOD小鼠外周CD3+CD4+T细胞频率在1、2、7周均持续显着下调,CD8+T细胞频率在喂养1周时出现一过性上调,喂养7周时下调显着,但CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌促炎因子的能力均无明显差异。而在给予甘露糖1-3周时,NOD小鼠外周Treg细胞均无明显变化,但在连续饮甘露糖溶液7周后出现明显上调。鉴于ERS是T1D早期重要的病理特征,且参与T1D启动和发展。第二部为观察饮甘露糖溶液是否可以调节NOD小鼠胰腺组织的ERS水平,我们检测了饮甘露糖溶液不同时间点NOD小鼠腺胰组织ERS标志物的变化。实时荧光定量PCR结果显示:BIP、CHOP mRNA水平在持续饮用甘露糖溶液组1、2、3、7周时均呈现降低趋势,表明胰腺组织ERS标志物转录水平均在甘露糖处理后被抑制。Western Bloting结果表明:与对照组相比,连续饮用甘露糖溶液2、3、7周时,NOD小鼠胰腺组织病理性ERS标志物TXNIP均明显降低,减慢T1D启动及发展;Eif2α磷酸化蛋白水平在给予甘露糖2-3周时出现一定程度的适应性上调,减少蛋白质合成,减轻ER中未折叠蛋白质的负荷;Ire1在2周蛋白磷酸化表达量降低,有利于减少β细胞早期ERS反应性凋亡,保护β细胞存活,以维持胰岛细胞功能稳态。但随着疾病进程,甘露糖则能抑制持续性ERS,防止其向病理性ERS过度。第三部分我们进一步在体外培养体系观察甘露糖处理是否可以抑制ERS诱导剂诱导的胰岛β细胞系NIT-1过度ERS及死亡,并促进其存活。结果表明单独给予NIT-1细胞衣霉素（Tunicamycin,TM）处理后,BIP、ATF4、CHOP mRNA表达水平急剧上调,Eif2α、Ire1及其磷酸化蛋白含量均显着上调;但同时给予甘露糖处理后,这些ERS标志物在mRNA水平及磷酸化蛋白的上调水平均被明显抑制,且其抑制效果可以与ERS经典抑制剂TUDCA媲美。利用CCK-8法检测单独给予ERS诱导剂胡萝卜毒素（Thapsigargin,TG）/TM处理,或同时给予不同浓度甘露糖处理后的NIT-1细胞活性;并用台盼蓝法鉴定细胞生死状态。结果表明给予甘露糖可以明显改善由ERS诱导剂所致的NIT-1活力下降及细胞死亡。综上所述,我们的研究表明:与正常饮水组相比,持续饮用甘露糖溶液短期内,即可明显改善NOD小鼠胰岛炎症,外周T淋巴细胞频率总体上也有一定程度减弱,但对于外周Treg产生的影响在持续处理较长时间后才出现。因此,我们推测NOD小鼠饮用甘露糖短期内产生的胰岛保护效应并非依赖Treg上调,而存在其他作用机制。进一步研究发现,持续饮甘露糖溶液2、3、7周可明显抑制NOD小鼠胰腺组织病理性ERS标志物TXNIP产生以及ERS标志物转录水平。同时短期内2-3周通过增加Eif2α蛋白磷酸化水平,以及在2周降低Ire1蛋白磷酸化表达量,可以减轻ER中未折叠蛋白质的负荷,减少早胰腺ERS反应性死亡,适度改善生理性ERS,以恢复细胞内稳态;但随着时间延长,甘露糖可以显着抑制胰腺组织持续性ERS引起的Eif2α、Ire1蛋白磷酸化水平增加,以防止向病理性ERS转变。最后在体外培养体系中,进一步证明甘露糖可以有效抑制TM诱导的胰岛β细胞系过度ERS,恢复胰岛β细胞活力,减少β细胞死亡。本研究首次发现甘露糖可以通过调节ERS,改善胰岛炎症,从而为甘露糖保护T1D提供了新的作用机制和实验数据,为将来甘露糖临床应用奠定理论基础。
季娟[8]（2017）在《大黄素甲醚调节实验性Ⅰ型糖尿病小鼠血糖和胰岛素水平及机制探讨》文中研究表明目的:复制STZ诱导I型糖尿病模型,探究大黄素甲醚对实验性I型糖尿病小鼠的保护作用,复制细胞因子诱导RINm5F细胞凋亡模型,研究其抗胰岛β细胞凋亡的作用。方法:1.动物实验:将雄性SPF级健康昆明小鼠40只随机分为:正常对照组、I型糖尿病模型组、大黄素甲醚大剂量组（40mg/kg/d）、小剂量组（20mg/kg/d）。除正常对照组外,其余各组小鼠连续5天腹腔注射STZ溶液,1周后,给药组连续腹腔注射大黄素甲醚28d。称量给药前后各组动物体重,血糖仪测其每周空腹血糖。ELISA法检测小鼠血清中NO、i NOS、胰岛素水平,石蜡包埋切片,TUNEL凋亡检测法测其胰岛β细胞凋亡。2.细胞实验:复制细胞因子IFN-γ（100U/ml）和IL-1β（1U/ml）诱导RINm5F细胞凋亡病理模型。各给药组预孵育4h后给予细胞因子刺激,共同孵育24h,以分子生物学技术检测细胞存活率、caspase-3活化、PARP活化、NO、i NOS水平以及NF-κB的活化。Prism软件分析数据。结果:动物实验:模型组小鼠的体重随时间增加较同期正常组明显降低（P<0.05）,给药组大剂量组较模型组,能明显增加同时间点的体重（P<0.05）。模型组小鼠第一周空腹血糖值较正常组升高,并持续稳定升高至第四周,胰岛素水平明显下降,i NOS活性和NO含量显着升高,大剂量给药组能持续减缓血糖的升高,对抗胰岛素水平降低和i NOS、NO的增加（P<0.05）。TUNEL染色镜下可见模型组凋亡细胞数目显着增加且大黄素甲醚大剂量组（40mg/kg/d）可以显着抑制细胞凋亡。细胞实验结果显示:模型组较之正常组,随细胞存活率的降低,caspase-3的活化水平,NO及i NOS均显着升高,p65向核内转移。而大黄素甲醚能有效拮抗细胞因子诱导的β细胞凋亡（P<0.05）。结论:大黄素甲醚（40mg/kg/d）对I型糖尿病小鼠胰脏β细胞具有保护作用。大黄素甲醚（5μM和10μM）能对抗IL-1β和IFN-γ诱导的胰岛β细胞凋亡,其机制与抑制NF-κB活化和i NOS表达有关。
朱琴玲[9]（2016）在《卵巢局部皮质醇及白介素1β在多囊卵巢综合征颗粒细胞胰岛素抵抗中的作用》文中研究说明研究目的胰岛素抵抗是多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）重要特征。外周组织中过多的皮质醇及IL-1β会导致胰岛素靶向器官的胰岛素抵抗,但目前并未有研究探索卵巢局部的皮质醇以及IL-1β在PCOS卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗中的作用。因此本研究探索了卵巢局部皮质醇及炎症因子IL-1β对卵巢颗粒细胞的胰岛素抵抗以及卵巢颗粒细胞功能的调控作用及其两者的关系。研究方法1.根据鹿特丹诊断标准将患者分为PCOS组和非PCOS组【单纯管性因素不孕,正常BMI未合并胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）】,其中PCOS组根据空腹胰岛素水平以及HOMA-IR分为PCOS合并IR组和PCOS未合并IR组（其中空腹胰岛素≥15 uIU/ml和或HOMA-IR≥2.0者为PCOS合并IR组,不满足以上条件者为PCOS未合并IR组）,收集各组患者取卵后的卵泡液和颗粒细胞;2.采用免疫检测试剂盒检测卵泡液和培养液中的皮质醇、可的松、IL-1β、乳酸、E2、P4水平;3.采用免疫荧光、PCR、Western blot以及酶亲和力实验技术明确11β-HSD1、11β-HSD2在卵巢颗粒细胞的定位、表达以及活性;4.采用实时定量PCR方法检测三组未培养的卵巢颗粒细胞中11β-HSD1、11β-HSD2、GR-α、IL-1β、PTEN和GLUT4 mRNA的表达;5.来自于三组患者的颗粒细胞体外培养三天后,加入1μM皮质醇或者可的松作为底物,分别检测三组颗粒细胞11β-HSD的还原酶和氧化酶活性;6.原代颗粒细胞培养添加浓度梯度的皮质醇（0,0.1,1μM）、IL-1β（0,0.1,1,10 ng/ml）和皮质醇（1μM）联合IL-1β（0.1 ng/ml）处理细胞24小时,采用实时定量PCR、Western blot和ELISA方法探索其对卵巢颗粒细胞11β-HSD1和11β-HSD2的表达和活性、胰岛素抵抗相关基因改变（PTEN,Akt磷酸化,GLUT4转位等）、孕激素合成关键酶（StAR,CYP11A1,3β-HSD）表达及孕激素合成的影响。研究结果1.三组临床资料显示PCOS合并IR组BMI、空腹胰岛素水平、HOMA-IR水平以及高敏CRP显着高于PCOS未合并IR组和非PCOS组。PCOS合并IR组hCG日E2水平/获卵数、卵泡液中P4和乳酸水平显着低于其他两组,并且PCOS合并IR组的优胚率显着低于非PCOS组,提示PCOS合并IR患者卵巢局部存在的胰岛素抵抗可能会影响激素合成和胚胎质量。2.卵泡液中皮质醇的水平约为可的松的10倍。PCOS合并IR组卵泡液中皮质醇的水平显着高于PCOS未合并IR组和非PCOS组,而三组可的松的水平无显着差异。3.PCOS合并IR组卵泡液中的IL-1β水平显着高于非PCOS组。并且卵泡液中的IL-1β水平与血清CRP水平、空腹胰岛素水平和HOMA-IR水平成正相关,而与卵泡液中的乳酸水平成负相关,提示卵巢局部的IL-1β水平与全身炎症状态、全身胰岛素抵抗和卵巢局部胰岛素抵抗均密切相关4.免疫荧光技术、PCR以及Western免疫印迹技术显示11β-HSD1与11β-HSD2在黄素化卵巢颗粒细胞中均可表达。酶亲和力实验表明11β-HSD还原酶的Km平均值是242.3±69.6 nM,符合11β-HSD1的特征;11β-HSD氧化酶的Km平均值是540±42.4 nM,符合11β-HSD2的特征,提示我们获得的黄素化颗粒细胞既可表达11β-HSD1又可表达11β-HSD2。5.PCOS合并IR组11β-HSD1 mRNA表达显着高于PCOS未合并IR组和非PCOS组,而GR-α和11β-HSD2 mRNA的水平三组无显着差异。卵泡液中皮质醇的水平与卵巢颗粒细胞11β-HSD1 mRNA水平成正相关,而与11β-HSD2无相关性。PCOS合并IR组11β-HSD1还原酶的活性显着高于其他两组,而11β-HSD氧化酶的活性显着低于其他两组。6.体外添加皮质醇可以浓度依赖性的促进颗粒细胞（来自于非PCOS人群）11β-HSD1表达,同时也会促进可的松转换为皮质醇的比例（11β-HSD1还原酶的活性）。而相同浓度的皮质醇对卵巢颗粒细胞11β-HSD2 mRNA的表达无影响。同时皮质醇可以浓度依赖性的促进来自于PCOS人群体外培养的卵巢颗粒细胞11β-HSD1表达。7.PCOS合并IR组颗粒细胞PTEN mRNA表达是PCOS未合并IR组和非PCOS组的2倍,并且颗粒细胞PTEN mRNA的表达与卵泡液皮质醇和IL-1β的浓度以及颗粒细胞11β-HSD1mRNA表达成正相关。体外实验进一步证明皮质醇和IL-1β分别处理均可以促进颗粒细胞PTEN表达。皮质醇和IL-1β分别预处理24小时后均可降低颗粒细胞胰岛素激活的Akt磷酸化和GLUT4转位。8.皮质醇能够抑制颗粒细胞StAR表达和孕激素的合成,而IL-1β可促进颗粒细胞StAR表达和孕激素的合成。9.皮质醇（1μM）和IL-1β（0.1 ng/ml）共同处理并不会进一步促进或削弱单独皮质醇或IL-1β对颗粒细胞PTEN表达、Akt磷酸化以及GLUT4转位的作用。而对于StAR表达和孕酮合成,皮质醇完全抑制了IL-1β对颗粒细胞StAR表达和孕酮合成的促进作用。研究结论颗粒细胞11β-HSD1表达及还原酶的活性增加是PCOS合并胰岛素抵抗患者卵泡液中皮质醇增加的主要原因。卵巢局部过多的皮质醇和IL-1β可能会通过促进颗粒细胞PTEN表达而降低胰岛素激活的Akt磷酸化和GLUT4转位,最终导致PCOS患者颗粒细胞的胰岛素抵抗。但皮质醇和IL-1β共同作用并不会进一步促进或者削弱单独的皮质醇或者IL1-β的对颗粒细胞胰岛素抵抗的调控作用。PCOS合并胰岛素抵抗患者卵巢局部孕酮降低可能与局部过多的皮质醇抑制了颗粒细胞StAR的表达相关。
孙云[10]（2016）在《突变亨廷顿蛋白对胰岛β细胞的毒性研究》文中研究说明亨廷顿病（Huntington’s disease,HD）是一种常染色体显性遗传性的神经退行性疾病。临床表现为不自主舞蹈运动、精神和情感异常以及进行性认知障碍,大多在中老年发病,目前尚无有效治疗方法。遗传学特征是位于4号染色体上的亨廷顿蛋白（huntingtin,Htt）编码区上CAG重复序列异常增多（超过35个）,产生氨基末端多聚谷氨酰胺（polyglutamine,Poly-Q）异常扩增的突变亨廷顿蛋白（mutant huntingtin,m Htt）。m Htt,尤其是其氨基末端片段能在神经元细胞质或核内积聚而形成难溶性的聚集物,m Htt及其聚集物具有多种细胞毒性,如干扰细胞内基因表达、诱导氧化应激、引起能量代谢障碍和兴奋性毒性损伤等,这些细胞毒性在HD的发病过程中起着关键性的作用。m Htt氨基末端片段除了在神经元内形成聚集物外,也在内分泌细胞如胰岛和肾上腺髓质细胞中形成聚集物,导致细胞功能异常。研究显示,50%60%HD患者葡萄糖耐受实验异常,与正常人群相比,HD患者糖尿病发病率显着增加,是正常人群发病率的7倍之多。然而,HD患者继发糖尿病的机制仍不清楚。本研究中,我们利用NIT-1小鼠胰岛素瘤β细胞,通过基因转染技术将表达正常或突变Htt氨基末端片段的真核表达质粒转染NIT-1细胞,观察m Htt对NIT-1细胞活力以及功能的影响,为揭示HD患者继发糖尿病的发病机制提供线索。1.m Htt增加NIT-1细胞凋亡在瞬时转染的NIT-1细胞中,含20个谷氨酰胺重复序列的正常Htt（20Q Htt）氨基末端片段弥散分布在细胞质内;含160个谷氨酰胺重复序列的m Htt（160Q Htt）氨基末端片段也在细胞质内分布,但在多数细胞胞质内可见聚集物形成。为了检测m Htt对NIT-1细胞活力的影响,在转染48小时后,MTT法分析结果显示,与转染空质粒（对照组）和表达20Q Htt的NIT-1细胞组（20Q NIT-1细胞）比较,表达160Q Htt的NIT-1细胞（160Q NIT-1细胞）增殖能力无明显差异。结果提示m Htt对NIT-1细胞的增殖能力无明显影响。接着,我们进一步检测m Htt是否增加NIT-1细胞的凋亡。免疫印迹分析结果显示,160Q NIT-1细胞在凋亡诱导剂staurosporine刺激后,活性caspase-3表达显着高于20Q NIT-1细胞,而20Q NIT-1细胞与对照组间活性caspase-3表达无明显差异。结果提示m Htt使NIT-1细胞对凋亡剂的诱导更加敏感,更易发生凋亡。2.m Htt损伤NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌为了明确m Htt是否影响NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌,在细胞转染20Q或160Q Htt 48小时后,用不同浓度的葡萄糖（5.6mmol/L、11.1mmol/L和24.2mmol/L）刺激细胞半小时,应用小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒检测培养基中胰岛素含量。结果显示,在高浓度葡萄糖（24.2mmol/L）刺激时,20Q和对照组细胞培养基中胰岛素含量均显着增加,然而,160Q细胞培养基中胰岛素含量仅略有增加,升高幅度显着低于20Q和对照组细胞。结果提示m Htt抑制NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌。为了明确m Htt是否通过影响NIT-1细胞胰岛素的表达而抑制其分泌,在细胞转染48小时后,用以上3种浓度的葡萄糖刺激细胞半小时,分别应用RTPCR和免疫印迹检测细胞内胰岛素m RNA和蛋白质的表达。结果显示,三组细胞高糖刺激时胰岛素m RNA表达均较低糖刺激时明显升高,在同一糖浓度刺激时,160Q NIT-1细胞内胰岛素m RNA表达水平与20Q以及对照细胞无明显差异。然而,高糖刺激时160Q NIT-1细胞内胰岛素蛋白质水平显着低于高糖刺激的20Q NIT-1细胞组。与相同刺激条件的对照组细胞相比,20Q NIT-1细胞内胰岛素蛋白质以及m RNA表达水平均未见明显变化。这些结果提示m Htt对细胞内胰岛素的转录无显着影响,胰岛素分泌的减少与细胞内胰岛素含量降低有关。3.m Htt抑制葡萄糖刺激的胰岛素信号通路的激活胰岛素信号通路对β细胞的生长和胰岛素的合成与分泌发挥重要调节作用,胰岛素和葡萄糖均能通过激活该信号通路而调节β细胞的功能。为了明确m Htt是否通过影响胰岛素信号通路而损伤β细胞,在转染细胞48h后,经KRBH缓冲液孵育细胞抑制细胞自身胰岛素的分泌,再给予外源性胰岛素或葡萄糖刺激细胞后,检测细胞内胰岛素信号通路中重要信号分子的表达及活性。结果显示,160Q NIT-1细胞、20Q NIT-1细胞和对照组细胞经外源性胰岛素刺激后,PI3K活性、Akt磷酸化和FOXO-1磷酸化水平均较相应未刺激组有所增加,且三组细胞间无显着差异。用高糖刺激细胞后,20Q NIT-1细胞和对照组细胞胰岛素信号通路关键分子IRS-2水平、Akt磷酸化和FOXO-1磷酸化水平均显着增高;而160Q NIT-1细胞经高糖刺激后,IRS-2水平、Akt磷酸化和FOXO-1磷酸化水平仅少许升高,其水平显着低于高糖刺激的20Q NIT-1细胞中相应蛋白水平。这些结果提示,m Htt不影响NIT-1细胞胰岛素刺激的胰岛素信号通路的激活,仅损伤该信号通路对葡萄糖刺激的反应性,进而导致β细胞葡萄糖刺激后胰岛素分泌减少。结论:m Htt通过损伤β细胞葡萄糖刺激的胰岛素信号通路的激活而引起胰岛素分泌减少。同时,胰岛素信号通路调节紊乱也促使β细胞发生凋亡,使得β细胞数量减少,进一步使胰岛素分泌总量降低。因此,HD患者葡萄糖稳态失调,易发糖尿病可能与β细胞葡萄糖调节的胰岛素信号通路紊乱有关。
二、IL-1β对体外培养NIT-1β细胞胰岛素分泌的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IL-1β对体外培养NIT-1β细胞胰岛素分泌的影响（论文提纲范文）
（1）胡椒碱调控免疫炎症保护糖尿病前期小鼠胰岛功能受损的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 肥胖与巨噬细胞炎症 |
| 2 胰岛巨噬细胞炎症 |
| 3 胰岛β细胞功能和去分化 |
| 4 小鼠模型 |
| 5 胡椒碱与T2D |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物和细胞株 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物饲养及分组 |
| 2.2 给药方式 |
| 2.3 体重和空腹血糖 |
| 2.4 口服糖耐量实验 (OGTT)和胰岛素耐量实验 (ITT) |
| 2.5 动物处死及血样保存 |
| 2.6 酶联免疫吸附实验(Elisa) |
| 2.7 高葡萄糖钳夹实验 |
| 2.8 RNA提取 |
| 2.9 荧光定量PCR |
| 2.10 HE染色 |
| 2.11 免疫组化 |
| 2.12 细胞培养 |
| 2.13 MTT |
| 2.14 细胞蛋白提取 |
| 2.15 蛋白质免疫印迹(WB) |
| 2.16 细胞免疫荧光 |
| 2.17 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 胡椒碱抑制HFD肥胖小鼠巨噬细胞炎症保护β细胞功能 |
| 1.1 胡椒碱改善HFD肥胖小鼠体重与脂质代谢 |
| 1.2 胡椒碱改善HFD肥胖小鼠口服糖耐量 |
| 1.3 胡椒碱增强HFD肥胖小鼠胰岛素敏感性 |
| 1.4 胡椒碱提高HFD肥胖小鼠葡萄糖输注速率 |
| 1.5 胡椒碱保护HFD肥胖小鼠胰腺发育 |
| 1.6 胡椒碱对HFD肥胖小鼠肝肾功能的影响 |
| 1.7 胡椒碱降低HFD肥胖小鼠血清中炎症因子水平 |
| 1.8 胡椒碱抑制HFD小鼠脂肪组织炎症 |
| 1.9 胡椒碱降低HFD小鼠胰岛内炎症因子的表达 |
| 1.10 胡椒碱增加HFD小鼠胰岛β细胞胰岛素的表达 |
| 1.11 胡椒碱增加HFD小鼠胰岛β细胞Pdx1 表达 |
| 1.12 胡椒碱增强HFD小鼠胰岛mTOR通路的活性 |
| 1.13 小结 |
| 2 胡椒碱对抑制巨噬细胞炎症保护Min6 细胞功能的研究 |
| 2.1 胡椒碱对RAW264.7 细胞和Min6 细胞活力的影响 |
| 2.2 胡椒碱抑制LPS诱导RAW264.7 细胞M_1样极化 |
| 2.3 胡椒碱增强LPS刺激Min6 细胞胰岛素合成能力 |
| 2.4 胡椒碱增加LPS刺激Min6 细胞Pdx1 的表达 |
| 2.5 胡椒碱抑制LPS刺激Min6 细胞中ALDH1A3 的表达 |
| 2.6 胡椒碱上调LPS刺激Min6 细胞的mTOR通路的表达 |
| 2.7 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点和不足 |
| 参考文献 |
| 综述 巨噬细胞炎症导致β细胞功能障碍和去分化 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表(附录) |
| 致谢 |
（2）人羊膜提取物对小鼠胰岛血清剥夺应激影响及其分子机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:人羊膜提取物保护血清剥夺应激下胰岛活性及功能的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 标本 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂与耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人羊膜提取物的制备 |
| 2.2.2 小鼠原代胰岛的提取 |
| 2.2.3 胰岛体外培养及实验分组 |
| 2.2.4 AO/EB检测体外培养胰岛的活性 |
| 2.2.5 计数并计算体外培养后胰岛恢复百分比 |
| 2.2.6 TUNEL染色检测体外培养胰岛细胞的凋亡 |
| 2.2.7 流式细胞仪检测体外培养胰岛细胞的凋亡 |
| 2.2.8 葡萄糖刺激胰岛素分泌实验 |
| 2.2.9 ELISA检测胰岛分泌胰岛素 |
| 2.2.10 Western Blot检测胰岛细胞内Akt、ERK1/2 及其磷酸化蛋白的表达 |
| 2.2.11 Western Blot检测胰岛细胞内Bcl2、BAX、Cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 成功制备人羊膜提取物 |
| 3.2 小鼠原代胰岛的提取及鉴定结果 |
| 3.3 人羊膜提取物对血清剥夺应激胰岛活性及丢失量的影响 |
| 3.4 人羊膜提取物显着减少血清剥夺应激胰岛的凋亡 |
| 3.5 人羊膜提取物改善血清剥夺应激胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能 |
| 3.6 人羊膜提取物提高血清剥夺应激胰岛细胞内p-Akt及 p-ERK1/2 的表达 |
| 3.7 人羊膜提取物提高血清剥夺应激胰岛细胞内 Bcl2/BAX 比值,同时减少Cleaved Caspase-3 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:添加人羊膜提取物培养胰岛并移植治疗小鼠糖尿病的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 标本 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂与耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人羊膜提取物的制备 |
| 2.2.2 C57BL/6 小鼠糖尿病模型的构建 |
| 2.2.3 小鼠原代胰岛的提取 |
| 2.2.4 实验分组 |
| 2.2.5 胰岛肾被膜下移植 |
| 2.2.6 移植受体血糖及体重监测 |
| 2.2.7 腹腔注射葡萄糖耐量试验 |
| 2.2.8 胰岛移植物的获取及处理 |
| 2.2.9 移植物HE染色 |
| 2.2.10 移植物免疫组化染色 |
| 2.2.11 移植物免疫荧光染色 |
| 2.2.12 移植物胰岛素含量检测 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠非禁食血糖体重监测及糖尿病逆转率计算 |
| 3.2 腹腔注射葡萄糖耐量实验 |
| 3.3 胰岛移植物组织病理学形态观察 |
| 3.4 移植物胰岛素含量 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:人羊膜提取物蛋白成分及生物活性分子鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 标本 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人羊膜提取物的制备 |
| 2.2.2 蛋白质谱LC-MS/MS分析 |
| 2.2.3 ELISA检测人羊膜提取物中EGF含量 |
| 2.2.4 ELISA检测人羊膜提取物中HGF含量 |
| 2.2.5 ELISA检测人羊膜提取物中TIMP-1 含量 |
| 2.2.6 ELISA检测人羊膜提取物中IL-1RA含量 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 人羊膜提取物蛋白质谱结果分析 |
| 3.2 人羊膜提取物中生长因子含量 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 对本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 胰岛移植前细胞保存方案的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）SREBP-1c对胰岛星状细胞活化及其介导胰岛功能改变的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 综述 以胰腺/岛星状细胞为靶点的胰腺及胰岛纤维化改善策略 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 胰岛星状细胞的定位与提取 |
| 2 静息态ISC的提取鉴定及与外生法ISC的比较 |
| 3 SREBP-1c对ISC生物学特性的影响 |
| 4 ISC包被对胰岛功能的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（4）白细胞介素-1β在脓毒血症血管功能障碍中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:白细胞介素-1β与人类疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（5）血浆β-淀粉样肽40和42与糖调节受损和2型糖尿病的关联性及其机制研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病患病风险的关联性 |
| 1.1 研究对象与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二部分 血浆β-淀粉样肽40和42水平与糖调节受损和2型糖尿病发病风险的前瞻性关联 |
| 2.1 研究对象与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 β-淀粉样肽40和42对HepG2细胞和C2C12细胞的胰岛素敏感性的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 2型糖尿病与阿尔茨海默病 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）Kdm2a对小鼠胰岛β细胞的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组蛋白修饰在糖尿病发生发展中的作用 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对应表 |
| 致谢 |
（7）甘露糖调节内质网应激减轻Ⅰ型糖尿病早期胰岛炎症研究（论文提纲范文）
| 缩略英文缩写 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 口服甘露糖减轻T1D早期胰岛炎症 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 口服甘露糖调节NOD小鼠胰腺组织内质网应激 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 甘露糖抑制内质网应激促进胰岛β细胞存活 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胰岛内质网应激和蛋白降解产生自身抗原诱导Ⅰ型糖尿病 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）大黄素甲醚调节实验性Ⅰ型糖尿病小鼠血糖和胰岛素水平及机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 1.1 药物与试剂 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 实验方法 |
| 2.1 模型制备 |
| 2.2 分组及给药 |
| 2.3 血清NO、iNOS水平及胰岛素测定 |
| 2.4 小鼠胰腺组织切片凋亡染色 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 细胞传代 |
| 2.7 细胞冻存与复苏 |
| 2.8 CCK-8 法测定细胞存活率 |
| 2.9 免疫印迹法检测蛋白表达 |
| 2.9.1 细胞总蛋白质提取 |
| 2.9.2 细胞核蛋白质提取 |
| 2.9.3 蛋白质浓度的测定 |
| 2.9.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.9.5 转膜 |
| 2.9.6 抗原抗体反应 |
| 2.9.7 显影 |
| 2.10 NF-κB活性测试 |
| 2.11 Caspase-3 活性检测 |
| 2.12 定量PCR测试 |
| 2.12.1 利用Trizol Reagent提取总RNA |
| 2.12.2 RNA纯度及浓度检测 |
| 2.12.3 反转录 |
| 2.12.4 PCR扩增 |
| 2.13 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 3.1 大黄素甲醚（physcion）对小鼠体重的变化的影响 |
| 3.2 大黄素甲醚（physcion）对小鼠血糖的影响 |
| 3.3 大黄素甲醚（physcion）对小鼠血清中 NO 水平的影响 |
| 3.4 大黄素甲醚（physcion）对小鼠血清中 i NOS 水平的影响 |
| 3.5 大黄素甲醚（physcion）对小鼠血清中胰岛素水平的影响 |
| 3.6 大黄素甲醚（physcion）对小鼠胰岛β细胞凋亡的保护作用 |
| 3.7 大黄素甲醚（physcion）保护 IFN-γ和 IL-1β诱导的 RINm5F 细胞增殖抑制 |
| 3.8 大黄素甲醚（physcion）拮抗 IFN-γ和 IL-1β诱导的 RINm5F 细胞凋亡 |
| 3.9 大黄素甲醚（physcion）抑制 IFN-γ 和 IL-1β 诱导的 NO 产生 |
| 3.10 大黄素甲醚（physcion）抑制 IFN-γ 和 IL-1β 诱导的 i NOS 生成 |
| 3.11 大黄素甲醚（physcion）抑制 NF-κB 通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表（附录） |
| 致谢 |
（9）卵巢局部皮质醇及白介素1β在多囊卵巢综合征颗粒细胞胰岛素抵抗中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 卵巢局部皮质醇及其代谢酶11β-HSD1在PCOS卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗中的作用及其机制研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 主要试剂和溶液 |
| 1.2.3 研究对象 |
| 1.2.4 卵泡液和颗粒细胞的收集 |
| 1.2.5 颗粒细胞培养处理 |
| 1.2.6 总RNA提取和反转录 |
| 1.2.7 常规PCR反应 |
| 1.2.8 实时荧光定量PCR实验 |
| 1.2.9 Western blotting |
| 1.2.10 免疫荧光实验 |
| 1.2.11 GLUT4 膜蛋白和浆蛋白的抽提方法 |
| 1.2.12 Cortisol和 Cortisone ELISA检测实验 |
| 1.2.13 血清以及卵泡液类固醇激素以及糖和胰岛素的检测 |
| 1.2.14 卵泡液乳酸测定 |
| 1.2.15 胚胎级别评定 |
| 1.2.16 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 PCOS与 non-PCOS患者一般情况及临床结局 |
| 1.3.2 人黄素化卵巢颗粒细胞11β-HSD1和11β-HSD2 的表达和活性 |
| 1.3.3 PCOS和 non-PCOS患者卵泡液中的皮质醇和可的松浓度 |
| 1.3.4 PCOS和 non-PCOS患者卵巢颗粒细胞11β-HSD1、2和GR的表达 |
| 1.3.5 皮质醇对卵巢颗粒细胞11β-HSDs的表达和活性的影响 |
| 1.3.6 皮质醇对卵巢颗粒细胞PTEN以及p-Akt以及GLUT4 表达的影响 |
| 1.3.7 皮质醇对卵巢颗粒细胞孕激素合成关键酶表达和孕激素合成的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 卵巢局部IL-1β水平在PCOS卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗中的作用及其机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂和溶液 |
| 2.2.3 研究对象 |
| 2.2.4 卵泡液和卵巢颗粒细胞的收集 |
| 2.2.5 卵巢颗粒细胞的处理 |
| 2.2.6 总RNA提取和反转录以及real-time PCR的方法 |
| 2.2.7 提取总蛋白和Western blot的方法 |
| 2.2.8 卵泡液IL-1β水平检测 |
| 2.2.9 血清、卵泡液和细胞培养液上清激素以及糖和胰岛素测定 |
| 2.2.10 卵泡液乳酸测定 |
| 2.2.11 胚胎级别评定方法 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 纳入研究三组一般资料情况和临床结局 |
| 2.3.2 PCOS和 non-PCOS患者卵泡液中IL-1β水平和乳酸生成情况 |
| 2.3.3 PCOS和 non-PCOS患者颗粒细胞IL-1β、PTEN、GLUT4 表达差异 |
| 2.3.4 IL-1β对卵巢颗粒细胞PTEN以及p-Akt以及GLUT4 表达的影响 |
| 2.3.5 IL-1β对卵巢颗粒细胞对StAR表达和孕酮合成的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 卵巢局部皮质醇及IL-1β在 PCOS卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗中的相互作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试验仪器 |
| 3.2.2 主要试剂和溶液 |
| 3.2.3 人卵巢颗粒细胞的提取和培养 |
| 3.2.4 卵巢颗粒细胞的处理 |
| 3.2.5 总RNA提取和反转录以及real-time PCR方法 |
| 3.2.6 提取总蛋白和Western blot的方法 |
| 3.2.7 提取GLUT4 胞浆和胞膜蛋白方法 |
| 3.2.8 细胞培养液孕酮检测方法 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 皮质醇及IL-1β对卵巢颗粒细胞PTEN以及p-Akt表达的影响 |
| 3.3.2 皮质醇及IL-1β对卵巢颗粒细胞GLUT4表达的影响 |
| 3.3.3 皮质醇及IL-1β对卵巢颗粒细胞孕激素合成关键酶及孕酮合成的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（10）突变亨廷顿蛋白对胰岛β细胞的毒性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、IL-1β对体外培养NIT-1β细胞胰岛素分泌的影响（论文参考文献）
- [1]胡椒碱调控免疫炎症保护糖尿病前期小鼠胰岛功能受损的作用研究[D]. 袁燕婷. 青岛大学, 2021(02)
- [2]人羊膜提取物对小鼠胰岛血清剥夺应激影响及其分子机制的实验研究[D]. 杨召铭. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]SREBP-1c对胰岛星状细胞活化及其介导胰岛功能改变的影响[D]. 李伟. 东南大学, 2020(01)
- [4]白细胞介素-1β在脓毒血症血管功能障碍中的作用及机制研究[D]. 罗明昊. 重庆医科大学, 2020(12)
- [5]血浆β-淀粉样肽40和42与糖调节受损和2型糖尿病的关联性及其机制研究[D]. 彭小波. 华中科技大学, 2020(01)
- [6]Kdm2a对小鼠胰岛β细胞的影响及其机制研究[D]. 刘新. 华中科技大学, 2020(01)
- [7]甘露糖调节内质网应激减轻Ⅰ型糖尿病早期胰岛炎症研究[D]. 马姝月. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]大黄素甲醚调节实验性Ⅰ型糖尿病小鼠血糖和胰岛素水平及机制探讨[D]. 季娟. 青岛大学, 2017(06)
- [9]卵巢局部皮质醇及白介素1β在多囊卵巢综合征颗粒细胞胰岛素抵抗中的作用[D]. 朱琴玲. 上海交通大学, 2016
- [10]突变亨廷顿蛋白对胰岛β细胞的毒性研究[D]. 孙云. 华中科技大学, 2016(01)