一、小鼠迟发型多器官功能障碍综合征模型复制及病理学观察（论文文献综述）
程振兴[1]（2020）在《循环组蛋白与急重症时多器官功能障碍综合征发病机制相关性的研究》文中提出背景:多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）是指机体受到休克、创伤、感染、烧伤等严重打击后,短时间内同时发生两个或两个以上器官或系统功能障碍或衰竭、不能维持自身的生理功能,从而影响机体内环境稳定的临床综合征。依受损器官数量差异,MODS患者病死率维持在30%-100%之间。MODS的特征是多个脏器同时、而非依次发生功能障碍,MODS的介质至今仍未明确。凝血激活、微循环衰竭、缺氧以及细菌毒素都被认为是MODS的潜在介质,但其真正作用尚未得以充分证明。正常情况下,位于细胞核内的组蛋白（histones）是DNA包装、基因调控过程所必需的结构性蛋白质;在多种原因导致的细胞损伤过程中,细胞核内的染色质分解后将组蛋白释放到细胞外形成胞外组蛋白（extracellular histones）。若机体在短时间内发生广泛性组织损伤或细胞死亡,随即产生的大量胞外组蛋白进入血液循环即为循环组蛋白（circulating histones）。目的:胞外组蛋白会损伤单器官。本研究将阐述循环组蛋白是否以第二次打击的方式介导创伤、急性胰腺炎、脓毒症等原发性急重症时MODS的发生与发展,与此同时我们还对急重症模型小鼠的高浓度循环组蛋白的来源进行初步探讨。方法:总体来说,我们主要通过将临床研究、体外实验以及建立创伤、急性胰腺炎和脓毒症等急重症动物模型相结合的方式阐明循环组蛋白在临床常见急重症时MODS发生与发展中的作用;通过体内、外实验对脓毒症模型小鼠高水平循环组蛋白的来源进行初步探讨。1.循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义采用蛋白质免疫印迹法（western blotting,WB）检测最终纳入的420名重症监护病房（intensive care unit,ICU）急重症患者入院时血浆组蛋白状况并通过一定方法换算出各自相应的血浆组蛋白浓度;检测纳入病人的肝、肾功能、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、氧合指数等多脏器功能指标,及时采集病人入院时的序贯器官衰竭评分（sequential organ failure assessment,SOFA）评分、入院后48h-72h的MODS发生情况以及住院后28天内的病死情况等临床数据,统计分析循环组蛋白浓度与急重症患者上述各项临床数据之间的关系。另外采集10名健康献血者的血液以分离血浆或血清用于相关的体外实验。2.胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用首先,分别使用添加不同剂量小牛胸腺组蛋白后的健康人血清、含不同浓度组蛋白的急重症患者血清处理人源性内皮细胞系EA.hy926,选择抗组蛋白单链抗体（anti-histone single chain variable fragment,ahsc Fv）、非抗凝肝素（non-anticoagulant heparin,Heparin）作为胞外组蛋白拮抗剂;然后,使用含高浓度循环组蛋白的急重症患者血清处理以下不同器官来源细胞以进一步观察循环组蛋白对组织细胞的非特异性毒性作用:小鼠心肌细胞（HL-1）、原代人肺支气管-肺泡上皮细胞（HSAEp C）、人永生化肝细胞（THLE-3）及原代人肾皮质上皮细胞（HRCE）。采用流式细胞术检测上述处理后各种细胞的PI阳性率（细胞死亡率）,以判断胞外组蛋白的细胞毒性作用。3.循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用选择野生型C57BL/6j以建立各类急重症的小鼠模型。采用重物自由落体撞击并控制撞击次数法建立轻、中、重三种不同损伤程度的小鼠肢体闭合性创伤模型;通过腹腔注射4次、12次雨蛙素以及胆总管逆行注射胆酸盐法（taurocholate,TCL）诱导轻、中、重三种不同胰腺损伤程度的小鼠急性胰腺炎模型;选择在结扎75%长度的盲肠后制造两个或四个肠内容物溢出穿刺孔的方式建立小鼠次重度、重度盲肠结扎后穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）模型;以静脉注射ahsc Fv或肌肉注射Heparin干预以上各模型小鼠,评价抗组蛋白治疗能否减轻这些小鼠的多脏器功能损伤。以WB法检测急重症模型小鼠的血浆组蛋白浓度,通过检测血浆ALT、BUN、cTnT来反映各模型小鼠肝、肾功能及心肌损伤情况,通过显微镜下肺组织（H&E染色）损伤评分法评估各模型小鼠肺损伤情况;经H&E染色、抗激活型Caspase-3免疫组化的方法观察各模型小鼠心、肝、肺、肾、肠、胸腺、脾脏等多脏器组织病理学特点;统计分析上述急重症模型小鼠循环组蛋白水平与多器官损伤之间的相关性,评价抗组蛋白治疗对重度CLP模型小鼠建模后72h生存率的影响。4.急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨为判断胸腺、脾脏对小鼠脓毒症时循环组蛋白来源的贡献,除常规使用WT C57BL/6j小鼠建模外,我们还要用到WT BALB/c小鼠及缺乏胸腺的BALB/c nude小鼠,同时需在以上小鼠完成脾脏切除术后再进行诱发脓毒症的相应处理。由于在脾脏切除术后继续对实验小鼠进行CLP操作会造成额外的损伤,进而可能影响脓毒症的自然发病过程;革兰氏阴性杆菌感染依然在细菌性脓毒症的病因中占有重要地位,而定量细菌腹腔注射法建立小动物脓毒症模型具有操作简便、效果明显且稳定的特点,我们故在此通过腹腔注射大肠杆菌K-12的方式对脾脏切除后的C57BL/6j小鼠诱发脓毒症。由于缺乏胸腺的BALB/c nude小鼠自身具有免疫缺陷性,这些小鼠的经细菌性腹膜炎（CLP术或腹腔注射大肠杆菌）导致脓毒症的病程可能不利于揭示循环组蛋白水平的变化特点,在此情况下使用造模成分明确且效果可靠、即腹腔注射LPS成为诱导BALB/c nude小鼠发生脓毒症的首选替代方法。将凋亡标记蛋白Annexin-V与荧光素m-Cherry联合形成Annexin-V/m-Cherry耦合物,因此在近红外激发光下m-Cherry的荧光强度标志着凋亡信号的强弱。通过近红外成像技术比较脓毒症模型小鼠在静脉注射m-Cherry/Annexin-V后多脏器的荧光强度;腹腔注射大肠杆菌K-12后的C57BL/6j小鼠在不同时间点接受皮下注射泛Caspases抑制剂Z-VAD-FMK;向健康的C57BL/6j小鼠尾静脉注射小牛胸腺组蛋白以探讨高浓度的循环组蛋白是否会引起脾细胞发生过度凋亡;经H&E染色、抗激活型Caspase-3免疫组化的方法观察各种方式处理后小鼠的多脏器组织病理学特点;比较野生型BALB/c、BALB/c nude及脾脏切除后的BALB/c nude小鼠在接受腹腔注射LPS后40h左右的生存率。目前人们普遍认为细胞坏死而并非细胞凋亡过程能够释放组蛋白到细胞外。糖皮质激素不仅是引发淋巴细胞凋亡的典型信号,也是临床通过诱发凋亡治疗骨髓瘤、白血病等恶性血液肿瘤的常用化疗药物。为明确细胞在发生凋亡过程中是否会直接释放组蛋白到细胞外,我们在体外实验中先采用水溶性糖皮质激素处理人B淋巴细胞系Daudi细胞、人T淋巴细胞系Jurkat细胞,然后经流式细胞术检测两种细胞的凋亡情况,通过WB法检测并比较细胞培养上清中组蛋白H3的含量变化情况。结果:1.循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义总体看来,所有纳入ICU的急重症病人入院时循环组蛋白浓度[24.7（8.0,46.7）μg/ml]明显高于健康献血者[1.3（0,2.1）μg/ml]。按病因对纳入病人分类后可见,重度创伤、重症胰腺炎、脓毒症患者入院时循环组蛋白水平较其他病种患者的显着升高,但这三种疾病患者之间循环组蛋白浓度差异无统计学意义。Spearman秩相关性检验表明,纳入病人入院时循环组蛋白水平与肝功能[ALT（rs=0.545;P<0.0001）]、肾功能[BUN（rs=0.496;P<0.0001）]、呼吸功能[Pa O2/Fi O2（rs=-0.360;P=0.015）]损伤以及心肌损伤标志物[c Tn T(rs=0.607;P<0.01]升高之间均存在正相关性;入院伴发MODS或住院28天内死亡病人的入院时循环组蛋白浓度明显偏高{[30.1（7.3,63.2）μg/ml vs.10.8（4.3,30.1）μg/ml;P<0.0001]、[32.7（14.4,66.9）μg/ml vs.20.1（6.7,40.5）μg/ml;P<0.0001]}。另外,纳入病人入院时循环组蛋白浓度不仅能预测入院后48h-72h之间MODS发生情况,还有助于推断病人住院后28天病死率。2.胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用健康人血清在加入外源性组蛋白后会对人内皮细胞系EA.Hy926产生剂量依赖性的毒性作用,当用组蛋白浓度≥30ug/ml的病人血清处理EA.hy926细胞后,其存活率也显着降低;与此相反,用胞外组蛋白拮抗剂ahsc Fv或Heparin处理均可显着降低胞外组蛋白对EA.Hy926内皮细胞的毒性作用。用含50μg/ml小牛胸腺组蛋白的健康人血清或组蛋白含量也超过50μg/ml的急重症病人血清处理不同器官来源的细胞（小鼠心肌细胞、人肝细胞、人肾皮质上皮细胞和人支气管-肺泡上皮细胞）后,这些细胞的存活率均明显下降。3.循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用循环组蛋白的浓度—时间曲线表明,中度创伤、次重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的循环组蛋白浓度峰值时间分别为建模后8h、16h、16h;各类疾病模型小鼠在各达峰时间的循环组蛋白浓度随病情加重而升高。经相关性分析后发现,各类疾病模型小鼠的循环组蛋白浓度与受损的肝功能（ALT）、肾功能（BUN）及升高的肌钙蛋白I（cTnT）、肺组织损伤评分得分（lung injury score,LIS）均呈正相关;ahsc Fv、Heparin抗组蛋白治疗能显着改善重度创伤、重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的ALT、BUN、cTnT、LIS等受损脏器功能指标;其中,无论在建模前还是建模后开始抗组蛋白治疗,重度CLP模型小鼠的72h存活率均得以显着改善。多脏器组织切片抗激活型Caspase-3免疫组化检测发现,重度创伤、重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的胸腺与脾脏存在细胞过度凋亡现象。4.急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨经腹腔注射适量大肠杆菌K-12能成功诱导野生型C57BL/6j小鼠发生脓毒症,同时细菌注射后10h循环组蛋白浓度达到较高水平（322.8±100.6μg/ml）,此后其值持续升高,峰值时间约在注射细菌后16h左右（478.2±166.4μg/ml）,且在24h仍处于高水平（424.8±154.1μg/ml）。多脏器近红外成像结果表明,从腹腔注射细菌后4h开始,C57BL/6j小鼠胸腺与脾脏的凋亡信号已明显升高,其中胸腺的凋亡信号一直持续升高到注射细菌后24h,脾脏凋亡信号高峰时间是细菌注射后8h;脏器组织切片H&E染色与抗激活型Caspase-3免疫组化染色结果显示,腹腔注射大肠杆菌后24h左右C57BL/6j小鼠的胸腺与脾脏淋巴细胞数大幅减少,两者均存在大面积细胞凋亡现象,而心、肝、肾等重要器官均未见明显的实质细胞凋亡;统计学分析发现,脓毒症模型小鼠的脾脏凋亡细胞数目与循环组蛋白浓度升高呈正相关（r=0.78;P<0.001）。将一定剂量的小牛胸腺组蛋白经尾静脉注射到C57BL/6j小鼠体内,循环组蛋白升高水平与小鼠发生严重脓毒症时相似,但免疫组化检查结果并未显示脾脏淋巴细胞凋亡增加,据此推断模型小鼠脾脏与胸腺细胞凋亡是循环组蛋白的来源,而不是循环组蛋白作用结果。皮下注射泛Caspases抑制剂Z-VAD-FMK能阻断细胞凋亡,循环组蛋白浓度也相应降低,提示细胞凋亡促进了循环组蛋白浓度的升高。我们还发现,脾脏切除后的C57BL/6j小鼠再经腹腔注射大肠杆菌K-12诱发脓毒症时,其循环组蛋白水平较未切除脾脏组显着降低（137.4.57±31.2μg/ml vs.53.8±21.8μg/ml;P<0.001）;与WT BALB/c nude小鼠比较（84.57±13.51μg/ml）,胸腺缺失（BALB/c nude小鼠）（33.49±7.59μg/ml）或胸腺缺失联合脾脏切除（BALB/c nude小鼠+脾脏切除术）（13.47±3.27μg/ml）能有效降低经腹腔注射LPS诱发脓毒症时的循环组蛋白水平并显着改善建模后实验小鼠的40h存活率。体外培养的Daudi细胞（B淋巴细胞系）、Jurkat细胞（T淋巴细胞系）均随氢化可的松剂量依赖的、不同程度的细胞凋亡（Annexin V+）,蛋白质免疫印迹法也证实未经糖皮质激素处理的淋巴细胞上清未见明显的组蛋白H3条带,而糖皮质激素处理的两种淋巴细胞上清液存在氢化可的松剂量依赖的、浓度高低不等的组蛋白H3。结论:1.重度创伤、重症胰腺炎及脓毒症等急重症患者入院时的高水平循环组蛋白与MODS进展及不良预后密切相关。2.添加外源性组蛋白后的健康人血清或含高水平循环组蛋白的急重症患者血清均对多器官来源的细胞产生由组蛋白介导的、非细胞特异性的毒性作用;抗组蛋白处理能有效抑制这种细胞毒性效应。3.在实验小鼠发生重度创伤、TCL胰腺炎（重症胰腺炎）、重度CLP（重度脓毒症）等多种原发性急重症后,循环组蛋白通过直接作用、以第二次打击的方式同时损伤多个脏器从而参与介导了MODS的发生与发展;抗组蛋白治疗有效改善以上急重症模型小鼠的MODS,显着提高重度脓毒症模型小鼠的存活率。4.胸腺与脾脏是脓毒症模型小鼠高水平循环组蛋白的重要来源,具体机制主要涉及脓毒症时胸腺与脾脏细胞的过度凋亡。
闵潇[2]（2020）在《益精方调控慢性缺氧诱导的睾丸Leydig细胞凋亡治疗LOH的机制研究》文中指出研究目的:1.研究症状性迟发性性腺功能减退症（symptomatic late onset hypogonadism,sLOH）患者的中医体质证候。2.研究人体慢性间歇性缺氧与sLOH之间的相关性。3.构建及评判慢性间歇性缺氧诱发迟发性性腺功能减退症（late onsethypogonadism,LOH）动物模型。4.传承名老中医经验,研究以补肾活血为主要治则的“益精方”对慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠治疗效果;从睾丸间质细胞（Leydig）凋亡、睾丸病理组织学改变及Leydig细胞超微结构改变探讨其作用机制。研究方法:第一部分:采用横断面研究的方法,以自填问卷的形式,收集在中国中医科学院广安门医院男科就诊的伴有鼾眠表现的sLOH患者的病例资料。采用Epworth嗜睡量表、STOP-bang问卷测评嗜睡状态,采用精简版AMS（cAMS）筛查量表测评LOH症状,中医体质分类与判定表测评中医体质,测定静脉血男性激素和乳酸。运用Pearson相关性分析,对血乳酸、性激素与sLOH症状、嗜睡状态进行相关性分析。第二部分:运用Attendor动物气体控制系统（Pro版）,模拟慢性间歇性低氧模式,对50只40周龄的退役SD种鼠进行每日4小时,连续30天的低氧干预,设为模型组;设10只40周龄的退役SD种鼠为对照组;设10只8周龄的SD大鼠为正常组。在造模第15天、30天时,随机选取模型组中的10只大鼠,与对照组、正常组大鼠,采血,进行血清总睾酮（TT）、游离睾酮（FT）和乳酸检测。在造模第30天时,随机选取模型组中10只大鼠与对照组、正常组大鼠,进行大鼠悬尾实验和大鼠强迫游泳实验;结合血清TT、FT和乳酸水平评估造模效果。第三部分:选取造模成功的32只LOH模型大鼠,随机分成4组:模型组,益精方高、中、低剂量组,每组8只大鼠。继续运用Attendor动物气体控制系统（Pro版）对大鼠进行慢性间歇性低氧的干预,为期4周,同时灌胃4周。模型组大鼠按体重灌胃蒸馏水。低剂量组予以0.324g/mL的益精方水煎剂;中剂量组予以0.75g/mL的益精方水煎剂;高剂量组予以1.5g/mL的益精方水煎剂。4周结束后,采血,ELISA法测血清TT、FT;比色分析法测血乳酸值;将大鼠断颈处死,计算大鼠睾丸指数;细胞流式术检测睾丸Leydig细胞凋亡率;Western印迹检测睾丸组织Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测睾丸组织Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平;分别以光学显微镜和透射电子显微镜观察睾丸病理组织学改变与超微结构的变化。研究结果:第一部分:sLOH患者排名前三的中医体质证候为气虚、痰湿、血瘀。41例sLOH患者完成了男性激素和乳酸检测,其中20例乳酸水平正常,21例乳酸水平高于正常,异常乳酸值范围为2.15-3.18（2.60±0.29）mmol/L,sLOH患者血乳酸异常比例约为51%。其中乳酸水平正常者气虚为主,乳酸水平增高者痰湿为主,但无论乳酸水平正常与否,血瘀均是sLOH患者比较突出的体质证候。Pearson相关性分析显示:Epworth评分与STOP-bang评分之间呈正向的强相关,r=0.681;cAMS评分与Epworth评分之间呈正向的弱相关,r=0.394;cAMS评分与STOP-bang评分之间呈正向的弱相关,r=0.311。Epworth评分与cAMS性功能症状分呈正向弱相关,r=0.317;Epworth评分与cAMS自主神经紊乱症状分呈正向中等强度相关,r=0.531;Epworth评分与cAMS心理和躯体症状分呈正向中等强度相关,r=0.460;STOP-bang评分与cAMS性功能症状分呈正向弱相关,r=0.357;STOP-bang评分与cAMS自主神经紊乱症状分呈正向弱相关,r=0.266;STOP-bang评分与cAMS心理和躯体症状分呈正向中等强度相关,r=0.434。乳酸正常sLOH组与乳酸升高sLOH组两组间,在年龄、Epworth嗜睡量表评分、STOP-bang问卷评分、cAMS评分、男性激素各项指标及TSI指数上的差异无统计学意义（P>0.05）;缺氧高中低风险3组,年龄在缺氧中风险组和缺氧低风险组之间存在统计学差异（P<0.05）,血雄烯二酮在缺氧高风险组和缺氧低风险组之间存在统计学差异（P<0.05）,其余指标在各组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。第二部分:与正常组和对照组相比,模型组大鼠造模第15天、第30天时2次检测的血清TT、FT水平均显着下降（P<0.05）,差异具有统计学意义。与正常组和对照组相比,模型组大鼠2次检测的血乳酸水平均显着增高（P<0.05）,差异具有统计学意义。造模第30天时悬尾实验:与正常组大鼠相比,对照组和模型组6min内不动时间均明显延长（P<0.05）,具有统计学意义;模型组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。游泳实验:与正常组和对照组相比,模型组大鼠游泳至力竭的时间均明显缩短（P<0.05）,差异具有统计学意义。依据LOH动物模型判定办法,以慢性间歇性缺氧为干预手段进行LOH动物模型构建,造模成功率为68%,造模途中死亡率为32%。第三部分:血TT、FT水平:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组大鼠血TT、FT水平均显着增高（P<0.05）,呈剂量依赖性。血乳酸水平:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组大鼠血乳酸水平均显着下降（P<0.05）,呈剂量依赖性。睾丸Leydig细胞凋亡率:与模型组相比,益精方中、高剂量组大鼠Leydig细胞凋亡率均显着下降（P<0.01）,具有显着统计学意义;益精方低剂量组与模型组相比,P>0.05,无明显统计学意义。Caspase-3蛋白表达水平方面:与模型组相比,低、中、高剂量组均显着下调（P<0.01）,低剂量组VS中剂量组,中剂量组VS高剂量组,P均>0.05;低剂量组VS高剂量组,P<0.01。Bcl-2蛋白表达水平方面:与模型组相比,益精方高剂量组Bcl-2蛋白表达水平显着上调（P<0.05）,差异具有统计学意义;低、中剂量组VS模型组,P均>0.05,低剂量组VS高剂量组,P<0.05。Bax蛋白表达水平方面:与模型组相比,益精方中、高剂量组Bax蛋白表达水平均显着下调（P<0.01）,差异具有显着统计学意义。低剂量组VS模型组,P>0.05;低剂量组VS高剂量组,P<0.05;中剂量组VS高剂量组,P>0.05。Caspase-3的mRNA表达水平方面:与模型组相比,低、中、高剂量组Caspase-3的mRNA表达水平均显着下调（P<0.05）,差异具有统计学意义;低剂量组VS高剂量组（P<0.01）,其余剂量组之间P均>0.05。Bcl-2的mRNA表达水平方面:与模型组相比,益精方高剂量组Bcl-2的mRNA表达水平显着上调（P<0.05）,差异具有统计学意义;中、低剂量组VS模型组（P>0.05）;低剂量组VS高剂量组（P<0.05）。Bax的mRNA表达水平方面:与模型组相比,益精方中、高剂量组Bax的mRNA表达水平均显着下调（P<0.01）,差异具有显着统计学意义;低剂量组VS高剂量组（P<0.05）,其余剂量组之间P均>0.05。光学显微镜下睾丸Leydig细胞数量:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组均有升高,但低、中、高剂量组组间差异不大。发生凋亡改变的Leydig细胞数量,益精方低、中、高剂量组均少于模型组。益精方低、中、高剂量组Leydig细胞形态优于模型组,其中高、中剂量组Leydig细胞形态趋近正常。透射电子显微镜下,4组大鼠的睾丸Leydig细胞超微结构在脂滴形成上有所差异。研究结论:1.在伴有鼾眠表现的sLOH患者中存在血乳酸异常升高;sLOH患者缺氧的风险越高,其LOH症状越重;缺氧对sLOH患者自主神经紊乱症状、心理和躯体症状的影响较明显,对男性激素的影响相对不明显。提示慢性间歇性缺氧可能是LOH的重要潜在危险因素。sLOH患者的中医体质证候以气虚、痰湿、血瘀为主,其中乳酸水平正常者倾向于气虚,乳酸水平增高者倾向于痰湿。提示肾气虚夹痰湿、血瘀可能是sLOH较为关键的中医病因病机。2.增龄与慢性间歇性缺氧,都是大鼠血TT、FT水平下降的危险因素;增龄加上缺氧,较单一的增龄因素,对大鼠血TT、FT水平的影响更为显着。以慢性间歇性缺氧为干预手段进行LOH动物模型构建,造模成功率较高,造模方法切实可行。3.益精方能明显提高慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠血TT、FT水平,降低血乳酸水平,降低睾丸Leydig细胞的凋亡率。其可能的作用机制在于:1)下调LOH模型大鼠睾丸组织中的Caspase-3、Bax的基因和蛋白表达,上调Bcl-2的基因和蛋白表达,调控了睾丸Leydig细胞的凋亡;2)改善LOH模型大鼠氧代谢,减轻乳酸蓄积,恢复雄激素合成睾丸内调节的正常环境,促进睾丸Leydig细胞分泌功能。
李国臣[3]（2020）在《半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的临床疗效评价及其调控PI3K/Akt/HO-1信号通路作用机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究依托山东省自然科学基金,旨在观察半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍临床疗效,从PI3K/Akt/HO-1信号通路探讨半夏泻心汤对脓毒症大鼠肠道损伤的保护作用及其作用机制。方法:（1）临床研究:收集2018年10月-2019年12月于山东中医药大学附属医院东院区重症医学科和急诊科住院治疗的脓毒症胃肠功能障碍患者,签署知情同意书,记录患者一般资料,随机分为治疗组和对照组,两组患者均予常规西医基础治疗,治疗组患者加服半夏泻心汤,日一剂,早晚分服,观察两组患者治疗前、治疗72h和治疗7天三个时间节点腹腔压、肠鸣音和血清二胺氧化酶、D-乳酸水平,并分析比较两组患者治疗前后APACHEⅡ评分、SOFA评分、胃肠功能障碍评分、中医证候积分以及ICU住院天数、28天病死率,评价半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的临床疗效。（2）运用盲肠结扎法制备脓毒症大鼠模型,探究半夏泻心汤对脓毒症大鼠肠道损伤的保护作用:选取健康雄性SD大鼠90只,随机分为假手术组、CLP组、半夏泻心汤（低、中、高）治疗组,每组各18只。假手术组只进行开关腹处理,其余四组采用CLP法制备实验用脓毒症大鼠模型。半夏泻心汤低、中、高治疗组造模后按3.05g/kg·d-1、6.1g/kg·d-1、12.2g/kg·d-1药物剂量灌胃,正常组、CLP组以同等体积生理盐水灌胃。治疗24h后,每组各取8只大鼠,收集大鼠血清、小肠组织。观察各组大鼠一般状态、72h生存率;ELISA法检测血清二胺氧化酶、D-乳酸、内毒素和炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-ɑ）的水平;HE染色法观察各组脓毒症大鼠小肠组织病理结构;免疫组化法检测小肠组织炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-ɑ）表达。（3）通过信号通路抑制剂处理,从正反两个方面说明半夏泻心汤对脓毒症肠损伤的保护作用和调控PI3K/Akt/HO-1机制:选取健康雄性SD大鼠50只,随机分为假手术组（Sham组）、模型组（CLP）组、半夏泻心汤组（BXXX组）、LY294002组（LY组）、LY+半夏泻心汤组（LY+BXXX组）,每组各10只。假手术只行开关腹处理,其余四组复制实验一脓毒症大鼠模型,LY294002组和LY+半夏泻心汤组于造模前腹腔注射LY294002。造模后半夏泻心汤组和LY+半夏泻心汤组按12.2 g/kg药物剂量灌胃,正常组、CLP组和LY组均以等体积生理盐水灌胃。治疗24h后,收集大鼠血清、小肠组织。观察各组大鼠一般状态;ELISA检测血清DAO、D-乳酸、内毒素和炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平;HE染色后观察小肠组织病理结构改变;Western Blot和RT-PCR检测小肠组织炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）及PI3K、P-Akt、HO-1蛋白及m RNA表达。结果:（1）临床研究:（1）两组患者经规范化治疗后,腹内压和肠鸣音均有改善,血清二胺氧化酶和D-乳酸水平均下降,但半夏泻心汤治疗组明显优于对照组（P<0.01）;（2）两组患者中医证候积分、APACHEⅡ评分、SOFA评分和胃肠功能障碍评分均下降,但半夏泻心汤治疗组下降更明显（P<0.01）;（3）相较于西医单纯治疗,半夏泻心汤治疗能明显提高临床治疗总有效率（P<0.01）;（4）半夏泻心汤治疗并未明显降低患者28天死亡率和缩短ICU住院天数（P>0.05）,但半夏泻心汤治疗后,均呈一定下降趋势。（2）实验研究一:（1）盲肠结扎法造模后大鼠出现运动迟缓、蜷缩、颤抖、拒捕反应减弱,毛发粗糙、凌乱、变黄,眼球充血等一系列症状,半夏泻心汤各治疗组上述症状较CLP组均有所改善;（2）半夏泻心汤各治疗组大鼠生存率明显高于CLP组,且半夏泻心汤高剂量组生存率最高,大鼠存活时间较长,优于其它两组;（3）半夏泻心汤各治疗组大鼠小肠组织损伤明显减轻,病理评分低于CLP组,且半夏泻心汤高剂量组肠组织损伤最轻;（4）半夏泻心汤治疗可明显降低脓毒症大鼠血清二胺氧化酶、D-乳酸、内毒素水平,高剂量组优于其它两组;（5）半夏泻心汤治疗能降低血清和小肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平,且有剂量依赖性。实验研究二:与Sham组比较,CLP后各组大鼠血清和肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高,PI3K、P-Akt、HO-1表达增高,血清二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素水平升高,肠损伤严重。与CLP组比较,半夏泻心汤干预后大鼠血清和肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降,PI3K、P-Akt、HO-1表达增高,肠损伤减轻;LY294002处理后大鼠血清和肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高,PI3K、P-Akt、HO-1表达下降,血清二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素水平升高,肠组织损伤加重。与半夏泻心汤组比较,LY+半夏泻心汤组大鼠血清和肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高,PI3K、P-Akt、HO-1表达降低,血清二胺氧化酶、D-乳酸和内毒素水平升高,肠组织损伤加重。本研究说明,半夏泻心汤抑制脓毒症时小肠组织炎症反应,减轻肠道组织损伤,或许与其调控PI3K/Akt/HO-1信号通路有关。结论:（1）半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍疗效确切,能明显减轻患者腹胀腹痛、恶心呕吐、便秘或下利等临床症状,且能有效降低腹腔压和恢复肠鸣音,降低患者的病情危重程度,患者28天病死率和ICU住院天数虽无明显改变,但呈下降趋势。（2）动物实验研究发现,半夏泻心汤能抑制脓毒症时失控的炎症反应,减轻脓毒症大鼠的肠道损伤,并提高大鼠生存率,且具有剂量依赖性,并且这一保护作用可能是通过调控PI3K/Akt/HO-1信号通路实现的。
宁丽萍[4]（2020）在《丙酮酸钠改善严重烫伤MODS小鼠胰岛β细胞功能不全实验研究》文中研究说明背景与目的多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）是指两个或者两个以上的系统或器官功能不全或衰竭的全身性综合征,住院重症患者发生MODS后死亡率高。严重烫伤、烧烫伤MODS时,患者发生创伤后应激性高血糖现象以及不同程度的全身炎症反应,胰岛β细胞受到不同程度的功能损害,炎症细胞因子可以使胰岛β细胞凋亡,导致胰岛素分泌下降,血糖应激过度,也会进一步促进炎症反应的发展,稳定血糖浓度在适当范围对MODS的预后十分重要。丙酮酸是一种活性氧（ROS）清除剂也是体内糖酵解的中间产物,是三大营养物质代谢的核心纽带,丙酮酸钠是最常见的丙酮酸盐,在临床上的作用也越来越重要。丙酮酸钠可通过腹腔注射防治器官功能障碍和（或）衰竭,丙酮酸钠直接腹腔复苏（IR）可使受损胰腺组织血流量增加57%。氧化应激和炎症因子在诱导胰岛β细胞功能损害和发展中起到重要的作用,使用抗氧化剂可以显着改善症状。研究表明丙酮酸钠具有改善休克细胞糖代谢,增强机体抗氧化和碱化的特性,可在无氧或严重缺氧下保护组织和器官。与氯化钠相比,丙酮酸钠可以更好地作为复苏溶液,临床上在抗休克及大手术后最常使用的0.9%氯化钠在单一使用过量时易导致高氯性酸中毒,加剧酸碱平衡紊乱,新配制的丙酮酸钠水溶液具有接近生理水平的钠含量,并且渗透压也非常稳定。大量研究表明丙酮酸钠具有保护器官的功能,这些研究主要集中在丙酮酸钠对心肌细胞、神经细胞、红细胞等组织细胞功能的保护上,鲜有针对丙酮酸钠保护严重烫伤MODS小鼠胰岛β细胞功能的研究报道。本研究在成功建立严重烫伤MODS小鼠模型的基础上,实验组以丙酮酸钠作为干预措施,对照组使用生理盐水,在伤后不同时间点取血,分别检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肌酐（CREA）、肌酸激酶MB型同工酶（CK-MB）、白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）、血糖（GLU）和胰岛素（Insulin）指标,依据HOMA-β公式和病理形态学来评价小鼠的胰岛β细胞功能情况,探讨丙酮酸钠对胰腺胰岛β细胞的保护功能,为临床通过改善胰岛β细胞功能调控糖代谢防治MODS提供实验参考依据和新思路。研究方法1.取6-8周龄无特殊病原体昆明小鼠140只。取其中120只小鼠随机分组,制作30%总体表面积（TBSA）Ⅲ度严重烫伤MODS小鼠模型:固定小鼠四肢,腹腔注射3.3%水合氯醛（10mL/kg）麻醉后背部30%体表面积剪毛置于90℃电恒温水箱中烫10秒,2小时后腹腔注射内毒素（1.0mg/mL,5.0mL/kg）,生理盐水抗休克,分为MODS生理盐水对照组60只（伤后1d、3d、5d各个时间段每组20只）和MODS丙酮酸钠治疗组60只（伤后1d、3d、5d各个时间段每组20只）,20只健康组小鼠不做烫伤处理。2.MODS生理盐水对照组方案:60只小鼠使用0.9%生理盐水腹腔注射1mL,再于烫伤后8小时腹腔注射0.9%生理盐水1mL。3.MODS丙酮酸钠治疗组方案:60只小鼠使用2.5%丙酮酸钠液腹腔注射1mL,再于烫伤后8小时腹腔注射2.5%丙酮酸钠液1mL。4.生理盐水对照组和丙酮酸钠治疗组分别于伤后1d、3d和5d各时间点禁食12小时后心脏取血;健康组小鼠适应性喂养三天禁食12小时后心脏取血,各组离心取出血清放置在超低温冰箱内-80℃保存,统一冻融使用全自动生化分析仪检测ALT、CREA、CK-MB、GLU和SOD含量;酶联免疫吸附实验检测IL-6和胰岛素水平;使用公式计算HOMA-β细胞功能指数=20×FINS/（FBG-3.5）。5.生理盐水对照组、丙酮酸钠治疗组和健康组小鼠心脏采血后于各时间点取腹部胰腺组织做HE染色病理切片分析。研究结果1.120只30%总体表面积（TBSA）Ⅲ度严重烫伤MODS小鼠伤后两组的死亡情况:60只生理盐水对照组小鼠各时间点1d、3d和5d的死亡率分别是35%、45%、50%;60只丙酮酸钠治疗组小鼠各时间点1d、3d和5d的死亡率分别是25%、30%、35%;20只健康组小鼠无意外死亡,组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.实验组制作30%总体表面积（TBSA）Ⅲ度严重烫伤MODS小鼠模型后,无论是丙酮酸钠治疗组还是生理盐水对照组小鼠都出现了颤栗,活动减少,萎靡不振,精神不佳等表现,与健康小鼠相比,实验组小鼠存活率明显下降,尤其是生理盐水对照组,丙酮酸钠治疗组比生理盐水对照组降低了严重烫伤MODS小鼠的死亡率。3.丙酮酸钠治疗组和生理盐水对照组肝功能,肾功能,心功能指标相比,丙酮酸钠治疗组小鼠伤后1d、3d、5d的血清ALT、Cr、CK-MB水平低于生理盐水对照组相同时间点（P<0.01）。4.丙酮酸钠治疗组与生理盐水对照组小鼠的炎症因子IL-6水平相比,丙酮酸钠治疗组伤后1d、3d、5d的IL-6水平低于生理盐水对照组相同时间点（P<0.01）。5.丙酮酸钠治疗组与生理盐水对照组两组SOD指标相比,丙酮酸钠治疗组1d的SOD水平与生理盐水对照组相同时间点无显着性差异（P>0.05）,丙酮酸钠治疗组小鼠伤后3d、5d血SOD水平高于生理盐水对照组相同时间点（P<0.01）。6.丙酮酸钠治疗组伤后1d、3d、5d的HOMA-β细胞功能指数水平高于生理盐水对照组各时间点（P<0.01）,比生理盐水对照组各时间点有改善。7.各组小鼠胰腺组织的HE染色结果:健康组小鼠的胰岛组织排列致密规则,细胞大小一致,细胞边界清晰;严重烫伤MODS小鼠生理盐水对照组1d、3d、5d的小鼠胰腺组织出现不同程度细胞轮廓不清晰且伴浸润炎症细胞,3d组比1d和5d组更严重;严重烫伤MODS丙酮酸钠治疗组各时间点较生理盐水对照组各时间点的胰腺组织形态均稍有改善。结论严重烫伤后MODS常会发生胰岛β细胞功能不全,出现创（烫）伤后高血糖及炎症反应,作为抗氧化和抗炎剂的丙酮酸钠,可能有助于对胰腺组织的保护作用,改善胰岛β细胞的功能。
王清华[5]（2020）在《钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究》文中研究表明急性胰腺炎是一种常见的内科急腹症,发病急,病情发展快,若不及时治疗,可能会危及生命。其发病原因多种多样,多与胆结石等胆道疾病,酗酒及暴饮暴食,胃十二指肠疾病等相关联。急性胰腺炎的病理机制仍未阐明,临床上也没有特异性的治疗药物,特别是急性重症胰腺炎,目前仍是对症治疗,愈后很差。各种因素如酶原激活、炎症介质、氧化应激、微循环障碍、核因子κB（NF-κB）途径等均参与了该发病过程。尽管胰腺炎的发病机制还没有完全阐明,研究表明激活胰腺腺泡细胞内的炎症信号通路是产生急性胰腺炎至关重要的分子机制。急性胰腺炎时,胰腺本身病变及由此引起的巨噬细胞和中性粒细胞被激活,释放大量的促炎性细胞因子,引发炎症的“瀑布样级联反应”,进而引起全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征（MODS）。胰腺腺泡细胞释放的促炎症细胞因子如TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-10和ICAM-1,以及免疫细胞是影响炎症死亡率的重要因素。这些炎症介质通过复杂的信号通路促进胰腺炎的发生与发展,其中IL-6/IL-6R/STAT3信号通路在急性胰腺炎及其全身炎症反应中起十分重要的作用。跨膜蛋白16A（TMEM16A）于2008年同时被3个实验室证明为钙激活氯离子通道,并提示其功能可能与细胞分裂周期、细胞增殖有关,是一类能被细胞内钙离子激活的阴离子通道。TMEM16A表达在多种细胞上,参与唾液腺、汗腺、呼吸道、及肠道上皮细胞钙依赖性氯离子分泌,调控平滑肌收缩,控制胃肠道起搏等生理过程。另外,TMEM16A参与肿瘤、高血压、疼痛等疾病的病理生理过程。在哮喘等呼吸道炎症的发病过程中都有TMEM16A的参与。TMEM16A在胰腺导管细胞,胰岛和腺泡细胞上均有表达,参与了导管细胞癌的发生和胰岛素分泌,并且参与胰腺细胞的酸性调节作用。但是,存在于腺泡细胞上的TMEM16A在急性胰腺炎中有什么样的作用及其作用机制有哪些仍未见报道。对此我们做了以下的研究:第一部分TMEM16A在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞上高表达目的:在动物和细胞水平观察雨蛙肽引起急性胰腺炎不同时间点的TMEM16A通道蛋白的改变。方法:在体研究:全部小鼠按体重随机分组,分为对照组、雨蛙肽6h组、雨蛙肽12h组和雨蛙肽24h组,每组6只。小鼠购进后适应性饲养3天,各组小鼠实验前一天晚自由饮水条件下禁食12小时,各雨蛙肽实验组小鼠腹腔注射雨蛙肽的生理盐水溶液,剂量为50μg/kg,每间隔1小时1次,连续注射7次,对照组小鼠同法腹腔注射等体积生理盐水。于最后一次注射后6小时、12小时和24小时分批取材:小鼠眼眶内眦部位进行采血,取出血后离心,保存血清。小鼠颈椎脱臼法处死后,摘取胰腺组织,western blot方法检测胰腺组织中TMEM16A通道蛋白;另取一部分,放置于4%的多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色的方法进行验证病理形态学检测,采用免疫组织化学方法检测胰腺组织TMEM16A通道蛋白的表达。体外实验:急性分离小鼠胰腺细胞,原代培养细胞,待细胞长到培养皿90%时,加入10-8M雨蛙肽,作用不同时间后收集细胞;保留细胞培养上清液;大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J细胞进行细胞培养,用10-8M雨蛙肽作用不同时间点后收集细胞,保留细胞培养上清液。免疫荧光方法检测TMEM16A通道蛋白在AR42J上的表达;提取细胞提取蛋白,western blot方法检测TMEM16A通道蛋白的表达。结果:雨蛙肽成功诱导急性胰腺炎小鼠模型;急性胰腺炎小鼠胰腺组织中TMEM16A通道蛋白表达上调;原代培养小鼠胰腺腺泡细胞炎症模型中TMEM16A通道蛋白表达上调;TMEM16A通道蛋白在正常AR42J细胞膜上表达,炎性AR42J细胞中TMEM16A通道蛋白表达上调。结论:TMEM16A通道蛋白在胰腺腺泡细胞上表达,雨蛙肽诱导的急性胰腺炎腺泡细胞TMEM16A通道蛋白表达上调。第二部分急性胰腺炎IL-6增多激活IL-6/IL-6R/STAT3促进TMEM16A表达目的:观察急性胰腺炎时IL-6表达增多及其对IL-6/IL-6R/STAT3信号通路的激活与TMEM16A蛋白调节作用。方法:ELISA方法检测急性胰腺炎小鼠胰腺组织及血清、原代培养小鼠胰腺腺泡细胞炎性培养上清液和AR42J细胞炎性培养上清液中IL-6含量。雨蛙肽处理AR42J细胞后western blot方法检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEME16A的表达。检测IL-6对AR42J细胞TMEM16A表达的浓度曲线筛选;IL-6处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEM16A的表达;IL-6和IL-6R中和抗体同时处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路激活和TMEM16A的表达;IL-6和STAT3抑制剂CucurbitacinⅠ同时处理AR42J细胞后检测IL-6/IL-6R/STAT3信号通路和TMEM16A的表达。结果:急性胰腺炎小鼠胰腺及血清中IL-6含量升高;炎性急性分离小鼠胰腺腺泡细胞培养上清液中IL-6含量增多,炎性AR42J细胞培养上清液中IL-6含量增多;雨蛙肽处理的AR42J细胞引起IL-6增多,激活IL-6/IL-6R/STAT3信号通路促进TMEM16A的高表达;IL-6促进AR42J细胞TMEM16A高表达,并且具有浓度依赖性;IL-6通过与IL-6R结合促进AR42J细胞TMEM16A的高表达;IL-6通过促进STAT3磷酸化促进AR42J细胞TMEM16A的高表达。结论:雨蛙肽引起的急性胰腺炎IL-6增多,激活IL-6/IL-6R/STAT3信号通路促进TMEM16A的高表达;IL-6促进AR42J细胞TMEM16A高表达;IL-6通过IL-6/IL-6R/STAT3促进TMEM16A的高表达。第三部分TMEM16A高表达促进急性胰腺炎的发生发展目的:观察急性胰腺炎高表达TMEM16A对炎症病理进程、IL-6含量及核转录因子NF-κB的影响。方法:全部小鼠按体重随机分组,分为对照组、模型组、T16Ainh-A01预先组和T16Ainh-A01后治组,除对照组外各组小鼠腹腔注射雨蛙肽的生理盐水溶液,剂量为50μg/kg,每间隔1小时1次,连续注射7次,对照组小鼠同法腹腔注射等体积生理盐水。T16Ainh-A01预先组于第一次注射雨蛙肽前30分钟时腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01,剂量为1mg/kg。T16Ainh-A01后治组于第一次注射雨蛙肽后30分钟时腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01,剂量为1mg/kg。于最后一次注射后12小时取材:小鼠眼眶内眦部位进行采血,取出血后,离心取上清。小鼠颈椎脱臼法处死后,摘取胰腺组织,采用ELISA法检测血清和胰腺组织匀浆液中IL-6的含量;western blot方法检测胰腺组织中TMEM16A通道蛋白和胞浆胞核内NF-κB活性亚基p65表达;另取一部分,放置于4%的多聚甲醛溶液中进行固定,采用HE染色的方法进行病理形态学检测,采用免疫组织化学方法检测胰腺组织TMEM16A通道蛋白的表达。通过质粒的转化、质粒扩增、质粒DNA提取、pEGF-TMEM16A和pEGF-TMEM16A-siRNA质粒与lipofection2000转染试剂共同转染AR42J细胞,荧光显微镜下观察转染效率,经过G418进行筛选,分别提取细胞胞浆蛋白和核蛋白,观察细胞核与胞浆中NF-κB的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-6的表达。通过免疫共沉淀方法检测TMEM16A与IP3R的相互作用,用BAPTA阻断细胞内的钙离子,观察钙离子升高对NF-κB活性的影响。结果:雨蛙肽作用于AR42J细胞12小时已经出现显着炎症反应,此时TMEM16A通道蛋白表达增多;对细胞内NF-κB活性亚基p65检测发现胞浆中的p65蛋白减少,而细胞核中的p65蛋白表达增多,p65蛋白发生了细胞核转移;而给予T16Ainh-A01后TMEM16A通道蛋白下降,胞浆中p65蛋白增加,而减少细胞核中的p65蛋白增多,抑制了p65蛋白发生了细胞核转移。腹腔注射雨蛙肽12小时的小鼠血清和胰腺组织中IL-6的含量明显增加,与雨蛙肽组小鼠相比,给予TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01后血清和胰腺组织IL-6的含量均下降;HE染色结果显示,与对照组（生理盐水）相比,雨蛙肽作用小鼠12小时,胰腺发生急性炎症表现:小叶间隙增宽、水肿、炎性细胞渗出、腺泡细胞肿胀细胞水肿。而腹腔注射TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01后,炎症病理变化得到改善。pEGF-TMEM16A过表达质粒和敲除质粒转染成功的AR42J细胞呈现绿色荧光,经过G418进行筛选后检测TMEM16A蛋白,转染效率约为50%;过表达TMEM16A的细胞,胞浆中p65蛋白减少,细胞核中p65蛋白增多,核p65/浆p65比值明显增大,p65发生核转移;敲除TMEM16A后,应用雨蛙肽复制急性炎症模型时发现胞浆中p65蛋白增多,细胞核中p65蛋白减少,抑制了p65发生核转移,同时细胞上清中IL-6的含量减少。TMEM16A与IP3R具有直接结合作用;BAPTA阻断细胞内的钙离子,减少了钙离子对NF-κB激活作用。结论:急性胰腺炎时TMEM16A蛋白表达,通过与胞浆内IP3R直接作用,增加细胞内的钙离子浓度,促进胰腺炎症细胞NF-κB核转移,促进IL-6的合成与释放,促进急性胰腺炎的病理进程。
范开亮[6]（2019）在《HO-1和中药大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究》文中指出研究背景重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis,SAP）病情重,并发症多,常释放大量炎症介质诱发全身系统性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,导致肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和严重感染等多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）[’1,2],病死率很高。SAP的临床治疗包括保守治疗或手术治疗,大量临床研究证实,外科治疗因为手术的创伤和应激反应会加重胰腺局部和全身的炎症反应,而且会继发严重感染,引起肺、肝、肾、心等器官的功能衰竭,病死率较高[3]。近年来我国重症急性胰腺炎的发病率升高,但缺乏有效的治疗手段来提高患者治愈率及存活率,因此重症急性胰腺炎的发病机制和治疗方法是目前临床研究的国际性难题。重症急性胰腺炎是一个多因素参与的复杂的病理生理过程[4],目前的研究表明,SAP发病的主要机制是:胰酶对胰腺的自身消化、肠道细菌移位、炎症细胞过度激活、钙超载、胰腺循环障碍和高脂血症等。胰腺内各种消化酶原被激活,诱导大量炎症细胞持续释放各种细胞因子,触发连续的炎症介质瀑布样级联反应,一系列的炎症反应导致多器官功能障碍[5]。胰腺作为原发器官,往往是受损最为严重的器官。肺作为SIRS最常见的靶器官,是最容易受累的器官,肺损伤是SAP最常见并发症之一。Bonjoch Le等[6]研究发现,采用牛磺酸诱导急性胰腺炎大鼠模型,肺泡巨噬细胞激活,炎性细胞浸润,出现急性胰腺炎相关性肺损伤。近几年的研究表明,炎症因子的持续过度释放是造成SAP病情恶化的主要因素之一。因此,SAP的临床治疗的重点是降低炎症反应、控制炎症介质瀑布样级联反应、维持促炎和抗炎反应的平衡,阻断SIRS引起的MODS。所以阻断SAP的炎症信号转导通路、抑制炎症因子的表达是目前研究和治疗的关键靶点。血红素加氧酶-1（HO-1）,是血红素降解的限速酶,也被称为热休克蛋白-32（HSP-32）,具有保护细胞、减轻氧化应激对细胞损伤的作用[7]。HO-1还具有影响细胞生长、炎症反应和凋亡等作用。一些动物实验证实,HO-1具有降低炎症反应的作用,能够减少组织细胞对不同促炎因子导致的炎症反应所引起的组织损伤[8]。在一些动物实验中,给予脂多糖（LPS）建立脓毒症模型,缺乏HO-1基因的大鼠和给予HO-1抑制剂的大鼠,器官损伤增加,死亡率升高[9-10]。这些研究表明,在缺血再灌注损伤中,在降低脓毒症模型的氧化应激反应中,在低氧环境中,HO-1在调控氧化应激、炎症反应等方面发挥重要的作用,并具有器官保护作用,HO-1具有可诱导的抗炎和器官保护作用[11-14]。TNF-α和L-10是体内重要的促炎和抗炎细胞因子,IL-10可抑制IL-2、IL-3及TNF-α等细胞因子的合成,还可以抑制TNF-α释放而减轻炎症反应、保护脏器功能,具有潜在的抗炎功能,对SAP所致的MODS有保护作用。TNF-α是由淋巴细胞以及巨噬细胞所分泌的炎症因子,释放后能诱导IL-2、IL-3、IL-6、IL-8及TNF-a的表达,导致炎性因子过度的表达和释放,过度的炎症反应导致细胞损伤和组织破坏[15-17]。近几年的一些研究发现,HO-1可调控IL-10的表达,介导IL-10的抗炎效果[18]。在小鼠巨噬细胞中,IL-10可通过p38-MAPK信号传导通路诱导HO-1的表达[19]。在LPS引起的脓毒性休克小鼠模型中,IL-10介导的抗炎作用可以被HO-1抑制剂ZnPP所减弱。近年来的研究发现,诱导HO-1基因表达与多条信号转导通路有关,而且各种炎症信号刺激通过不同的炎症信号传导通路诱导HO-1基因的表达。诱导HO-1基因表达的炎症信号传导通路可分为:（1）p38/MAPK炎症信号传导通路;（2）PI3K/AKT炎症信号传导通路（转录后水平的调节）;（3）JAK/STAT炎症信号传导通路;（4）蛋白激酶途径的调节。其中促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）炎症信号传导通路被研究证实可以诱导HO-1基因的表达。但HO-1的激活对p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用未见国内外研究报道,值得进一步研究证实,以指导临床应用。图1.HO-1及其相关p38 MAPK/NF-KB信号通路示意图在SAP中,HO-1的表达对促炎因子TNF-a、抑炎因子IL-10是否具有调节作用,对胰腺和肺是否具有器官保护作用,以及HO-1是否通过p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥调节炎症反应和器官保护作用,尚无定论。如果能从炎症信号传导通路阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供有力的武器。（国家自然基金课题（81503543）项目）目的观察血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）过表达及抑制对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠血清、胰腺和肺组织HO-1、促炎因子TNF-aα抑炎因子IL-10含量的变化,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,分析血红素加氧酶-1对胰腺和肺炎症反应的器官保护作用;观察HO-1过表达及抑制对SAP大鼠胰腺和肺组织p3 8 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,探讨HO-1抗炎作用以及对胰腺和肺器官保护作用的炎症信号传导通路机制。方法60只雄性SD大鼠,6～7周龄,220～260 g,随机分为4组:对照组、SAP模型组、HO-1抑制剂组、HO-1过表达组,每组15只。1、对照组:假手术组,只开腹,然后关腹,腹腔注射生理盐水,10ml/kg。2、SAP模型组:采用开腹经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,建模后腹腔注射生理盐水,10ml/kg。3、HO-1抑制剂组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,制备SAP模型后30min腹腔注射HO-1抑制剂锌原卟啉（Zn-protoporphyrin,Zn-PP）,20μxmol/kg。4、HO-1过表达组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,制备SAP模型后30 111min腹腔注射1HO-1促进剂血晶素,75μg/kg。在制模后24 h处死大鼠,腹主动脉留取血液标本,留取胰腺、肺组织标本。制备胰腺和肺组织石蜡切片,用HE（hematoxylin-eosin）染色法观察胰、肺组织病理学改变,进行组织病理学评分。应用免疫组织化学技术（免疫荧光法）对切片进行染色,观察促炎因子TNF-α、抗炎因子IL-10的细胞内表达情况。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清TNF-α IL-10、HO-1含量。制备胰腺和肺组织匀浆,离心提前上清液,ELISA法检测其中TNF-α IL-10、HO-1的含量。提取胰腺和肺组织的总蛋白,Western Blot法检测p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白（p38 MAPK、磷酸化P38 MAPK、MAPKAPK2、NF-1κB p65）的表达水平。结果一、各组大鼠血清HO-1、IL-10、TNF-a含量的比较1、各组大鼠的血清HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清HO-1含量明显增高（0.85±0.14vs 0.28±0.03,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清HO-1显着下降（0.75±0.11 vs 1.02±0.16,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的血清HO-1含量显着增高（1.02±0.16 vs 0.85±0.14,P<0.01）。2、各组大鼠的血清IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清IL-10含量均明显增高（71.89±8.91 vs 11.05±1.79,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清IL-10含量显着下降（64.55±7.69 vs 99.83±13.33,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的血清IL-10含量显着增高（99.83±13.33 vs 71.89±8.91,P<0.01）。3、各组大鼠的血清TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清TNF-α含量明显增高（29.26±3.69 vs 12.53±2.04,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的血清TNF-α含量显着升高（34.36±3.95 vs 21.69±2.95,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组TNF-α含量显着下降（21.69±2.95 vs 29.26±3.69,P<0.01）。二、各组大鼠胰腺组织中HO-1、IL-10、TNF-α含量的比较1、各组大鼠的胰腺HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺HO-1含量明显增高（0.52±0.08 vs 0.18±0.02,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺HO-1含量显着下降（0.37±0.06 vs 0.82±0.12,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺HO-1含量明显增高（0.82±0.12 vs 0.52±0.08,P<0.05）。2、各组大鼠的胰腺IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（52.63±6.02 vs 26.37±3.57,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺IL-10含量显着下降（48.09±6.22 vs 62.7±9.11,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（62.71±9.11 vs 52.63±6.02,P<0.05）。3、各组大鼠的胰腺TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺TNF-a含量明显增高（31.76±5.52 vs 14.78±2.39,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺TNF-α含量明显升高（34.17±5.16 vs 25.68±3.49,P<0.05）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺TNF-α含量明显下降（25.68±3.49 vs 31.76±5.52,P<0.05）。三、各组大鼠肺组织中HO-1、IL-10、TNF-α含量的比较1、各组大鼠的肺组织HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中HO-1含量明显增高（0.46±0.06 vs 0.09±0.01,P<0.01）;与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中HO-1含量显着下降（0.33±0.05 vs 0.79±0.11,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中HO-1含量明显增高（0.79±0.11 vs 0.46±0.06,P<0.05）。2、各组大鼠的肺组织IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（49.18±6.80 vs 19.51±2.92,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中IL-10含量显着下降（44.72±6.67 vs 58.34±7.81,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（58.34±7.81 vs 49.18±6.80,P<0.05）。3、各组大鼠的肺组织TNF-α含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显增高（29.61±3.89 vs 11.36±1.64,P<0.01）;与HO-1 过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显升高（35.06±4.92 vs 22.58±3.32,P<0.05）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显下降（22.58±3.32 vs 29.61±3.89,P<0.05）。四、各组大鼠胰腺组织病理学和免疫组化切片观察:1、胰腺大体标本观察:对照组胰腺组织无水肿、充血、及胰腺坏死,未见明显病理变化;SAP模型组胰腺组织水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;HO-1抑制剂组胰腺组织明显水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;HO-1过表达组胰腺组织局部水肿、苍白,未发现明显皂化斑。2、光镜下观察:对照组胰腺腺泡排列规则,腺管形态正常,未见明显变化;SAP模型组胰腺间质不同程度的充血、水肿,伴有炎症细胞浸润,胰腺部分出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱;HO-1抑制剂组胰腺间质明显充血、水肿,大量炎症细胞浸润,胰腺大片出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱,与模型组比较,病变较重;HO-1过表达组胰腺间质轻度水肿,少量炎症细胞浸润,小叶间隔增宽,与模型组比较,病变较轻。3、胰腺组织病理学评分:与HO-1过表达组相比,HO-1抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（13.50±0.76 vs 7.00±0.49,P<0.01）,与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的胰腺组织病理评分明显降低（7.00±0.49 vs 11.50±0.53,P<0.05）;有显着统计学差异。4、各组大鼠胰腺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠胰腺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-a表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内TNF-α表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。五、各组大鼠肺组织病理学和免疫组化切片观察:1、大体标本观察:对照组大鼠肺无水肿、充血,表面红润,气管内无渗出液。SAP模型组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下可见渗血,气管内较多渗出液。HO-1抑制剂组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下较多渗血,气管内大量渗出液,病变较SAP模型组大鼠重。HO-1过表达组大鼠肺可见水肿、充血,较SAP模型组大鼠轻,表面苍白,包膜下少量渗血,气管内少量渗出液。2、HE染色光镜下观察:对照组大鼠肺组织结构完整、清晰,细胞排列规整,无炎性细胞浸润;肺泡壁薄,无充血、水肿,肺泡内无渗出液。SAP模型组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,少量红细胞渗出;肺泡壁增厚,明显充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成。HO-1抑制剂组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,可见红细胞渗出;肺泡壁显着充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成,上皮细胞脱落,渗出较SAP模型组增加,病变明显加重。HO-1过表达组大鼠肺组织结构较完整,少量炎性细胞浸润,偶见红细胞渗出;肺泡壁轻度充血、水肿,肺泡内少量渗出液,富含蛋白,渗出较SAP模型组减轻,病变较轻。3、肺组织病理学评分:HO-1抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（12.28±0.83 vs 9.37±0.61,P<0.05）;与HO-1 过表达组相比,HO-1 抑制剂组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（12.28±0.83 vs 5.53±0.57,P<0.01）;与SAP模型组相比,HO-1过表达组大鼠的肺组织病理评分明显降低（5.53±0.57 vs 9.37±0.61,P<0.05）,有显着统计学差异。4、各组大鼠肺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠肺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;HO-1抑制剂组细胞内TNF-α表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显;HO-1过表达组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。六、各组大鼠胰腺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,HO-1抑制剂可增加胰腺组织中p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,促进NF-KB p65的表达;HO-1过表达可抑制SAP大鼠胰腺组织p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,减少NF-κB p65的表达。七、各组大鼠肺组织中p38 MAPK/NF-KB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,HO-1抑制剂可增加SAP大鼠肺组织中p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,促进NF-κκB p65的表达;HO-1过表达可抑制SAP大鼠肺组织p38的磷酸化、MAPKAPK2的表达,减少NF-κB p65的表达。Western Blot检测结果提示p38 MAPK/NF-KB传导通路可能是HO-1增加IL-10、降低TNF-α减轻SAP大鼠过度炎症反应的关键炎症信号传导通路。结论1、HO-1过表达可以降低SAP大鼠炎症因子的释放,减轻组织炎症反应,对SAP大鼠的胰腺和肺组织具有器官保护作用;2、HO-1对SAP大鼠胰腺和肺组织保护作用的机制可能与增加IL-10表达、降低TNF-α的表达有关。3、HO-1过表达可抑制SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK的磷酸化,减少NF-κB p65的表达。4、实验提示p38 MAPK/NF-KB传导通路可能是HO-1减轻SAP大鼠过度炎症反应的关键炎症信号传导通路。前言重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis,SAP）的临床治疗包括保守治疗或手术治疗。大量临床研究已经证实,外科治疗因为手术的创伤和应激反应会加重胰腺局部和全身的炎症反应,而且会继发严重感染,引起肺、肝、肾、心等器官的功能衰竭,病死率较高。近年来我国重症急性胰腺炎的发病率升高,但缺乏有效的治疗手段来提高患者治愈率及存活率,因此重症急性胰腺炎的治疗是国际性难题。中医药是我国传统文化的瑰宝,中西医结合治疗是我国的特色和优势所在。中医药治疗SAP具有独特的疗效,已成为SAP临床治疗方案中的重要组成部分。医圣汉代张仲景所着《伤寒杂病论》中的经典方剂大柴胡汤在胰腺炎的临床治疗中应用最多,临床疗效较为明显[1]。大柴胡汤是仲景名方,为表里双解剂,具有和解少阳,内泻热结之功效,主治少阳阳明合病W。临床常用于治疗消化性溃疡、急性胰腺炎、胆结石、急性胆囊炎等病症。近年来临床研究和动物实验发现,该方剂具有多种药理作用,可以抑制胃酸过多分泌以保护胃黏膜,还能松弛奥狄氏括约肌张力,具有利胆作用,还有保护肝细胞等作用[3]。大柴胡汤治疗SAP的临床疗效值得期待,其作用机制尚不明确,需要实验研究来加以证实和阐明,也将为临床应用提供实验证据的支持。TNF-α和IL-10是体内重要的促炎和抗炎细胞因子,IL-10可抑制IL-2、IL-3及TNF-α等细胞因子的合成,还可以抑制TNF-α释放而减轻炎症反应、保护脏器功能,具有潜在的抗炎功能,对SAP所致的多器官损伤有保护作用[4,5]。TNF-α是由淋巴细胞以及巨噬细胞所分泌的炎症因子,释放后能诱导IL-2、IL-3、IL-6、IL-8及TNF-a的表达,导致炎性因子过度的表达和释放,过度的炎症反应导致细胞损伤和组织破坏[6-8]。在第一部分SAP大鼠动物实验中已经证实,HO-1可以促进抑炎因子IL-10的表达、减少促炎因子TNF-α的表达,对胰腺和肺具有器官保护作用,HO-1调节p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路发挥抑制炎症反应和器官保护作用。大柴胡汤如果能通过调节HO-1抑制p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供新的治疗靶点。大柴胡汤治疗SAP的临床疗效及其作用机制尚需实验研究来加以证实和阐明,本实验应用大柴胡汤来治疗SAP大鼠模型,观察其对大鼠血清、胰腺和肺组织炎症因子HO-1、TNF-α、IL-10含量的影响,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,探讨大柴胡汤对胰腺和肺保护作用;观察大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,分析大柴胡汤治疗SAP是否通过介导HO-1/p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥抗炎作用以及器官保护作用。如果能阻断过度激活的全身炎症反应,将为SAP的临床治疗提供有力的武器,具有重要的临床意义。目的观察中药大柴胡汤（Dachaihu Decoction）对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠血清、胰腺和肺组织HO-1、TNF-α、IL-10的影响,以及对胰腺和肺组织病理学的影响,探讨大柴胡汤对胰腺和肺炎症反应的保护作用;观察大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织p38 MAPK/NF-κB炎症信号传导通路的调节作用,分析大柴胡汤治疗SAP是否通过介导HO-1/p38 MAPK/NF-KB炎症信号传导通路发挥抗炎作用以及器官保护作用。方法45只雄性SD大鼠,6～7周龄,220～260 g,随机分为3组:对照组、SAP模型组、大柴胡汤组,每组15只。1、对照组:假手术组,只开腹,然后关腹。术后给予2ml生理盐水灌胃,每天两次,自由饮水。2、SAP模型组:采用开腹经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g）方法制备SAP模型,建模后大鼠给予2ml生理盐水灌胃,每天两次,自由饮水。3、大柴胡汤组:经胰管逆行性注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/1OOg）方法制备SAP模型,制备SAP模型后给予大鼠中药大柴胡汤灌胃（2ml/200g,BID,剂量按公式计算）。大柴胡汤配方:柴胡15g,黄芩9g,芍药9g,枳实9g,半夏9g,大黄6g,大枣5枚（约10g）,生姜15g,总计82g。大柴胡汤由山东中医药大学附属医院中药房煎药室煎制,熬成200ml药液,大鼠以200g为标准体重计算,给予2ml中药灌胃,每天两次,给药量相当于含生药8.2g/（kg·d）。大鼠的用药剂量计算公式:dB=dA× RB/RA×（WA/WB）1/3。公式中dA为人每公斤体重给予的剂量,dB为大鼠每公斤体重给予的剂量,单位为mg/kg,RA=100,为人的体型系数,RB=59,为大鼠的体型系数,WA、WB分别为人和大鼠的体重值,单位为kg。人的标准体重以60kg计算,大鼠标准体重以200g计算,求得所给予剂量[9]。在制模后72h腹主动脉穿刺留取血液标本,放尽血液处死大鼠,然后留取胰腺、肺组织标本。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清TNF-α、IL-10、HO-1含量。制备胰腺和肺组织匀浆,离心提前上清液,ELISA法检测其中TNF-α、IL-10、HO-1的含量。制备胰腺组织石蜡切片,用HE（hematoxylin-eosin）染色法观察胰、肺组织病理学改变,进行组织病理学评分。应用免疫组织化学技术（免疫荧光法）对切片进行染色,观察促炎因子TNF-α、抗炎因子IL-10的细胞内表达情况。提取胰腺和肺组织总蛋白,Western Blot法检测p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白（p38 MAPK、磷酸化P38 MAPK、MAPKAPK2、NF-KB p65）的表达水平。结果一、各组大鼠的血清HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠的血清HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清HO-1含量显着增高（0.82±0.17 vs 0.26±0.05,P<0.01）;与SAP模型相比,大柴胡汤组血清HO-1 明显增高（0.99±0.15 vs 0.82±0.17,P<0.05）。2、各组大鼠的血清IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清IL-10含量均显着增高（74.62±7.28 vs 12.37±1.94,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的血清IL-10含量明显增高（91.67±10.53 vs 74.62±7.28,P<0.05）。3、各组大鼠的血清TNF-α含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的血清TNF-α含量明显增高（31.49±4.67 vs 11.73±1.88,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组TNF-α含量明显下降（23.81±3.29 vs 31.49±4.67,P<0.05）。二、各组大鼠的胰腺HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠胰腺的HO-1含量比较.:与对照组相比,SAP模型组大鼠胰腺的HO-1含量显着增高（0.49±0.07 vs 0.17±0.04,P<0.01）;与SAP模型相比,大柴胡汤组胰腺HO-1 明显增高（0.78±0.14 vs 0.49±0.07,P<0.05）。2、各组大鼠的胰腺IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（50.37±4.56 vs 25.93±2.86,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺IL-10含量明显增高（59.82±6.35 vs 50.37±4.56,P<0.05）。3、各组大鼠的胰腺TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺TNF-a含量明显增高（31.76±5.52 vs 14.78±2.39,P<0.01）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺TNF-α含量明显下降（25.68±3.49 vs 31.76±5.52,P<0.05）。三、各组大鼠的肺组织HO-1、IL-10、TNF-α含量比较1、各组大鼠肺组织的HO-1含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠肺组织的HO-1含量显着增高（0.42±0.07 vs 0.13±0.02,P<0.01）;与SAP模型相比,大柴胡汤组肺组织HO-1 明显增高（0.65±0.09 vs 0.42±0.07,P<0.05）。2、各组大鼠的肺组织IL-10含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（48.51±3.94 vs 20.63±1.89,P<0.05）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织中IL-10含量明显增高（57.26±6.07 vs 48.51±3.94,P<0.05）。3、各组大鼠的肺组织TNF-a含量比较:与对照组相比,SAP模型组大鼠的肺组织中TNF-a含量明显增高（28.43±2.92 vs 10.67±0.94,P<0.05）;与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织中TNF-α含量明显下降（10.67±0.94 vs 28.43±2.92,P<0.05）。四、各组大鼠胰腺形态学观察:1、胰腺大体标本观察:对照组胰腺组织无水肿、充血、及胰腺坏死,未见明显病理变化;SAP模型组胰腺组织水肿、苍白,表面脂肪组织散在点状皂化斑;大柴胡汤组胰腺组织局部水肿、苍白,未发现明显皂化斑。2、光镜下观察:对照组胰腺腺泡排列规则,腺管形态正常,未见明显变化;SAP模型组胰腺间质不同程度的充血、水肿,伴有炎症细胞浸润,胰腺部分出血、坏死,腺泡水肿、排列紊乱;大柴胡汤组胰腺间质轻度水肿,少量炎症细胞浸润,小叶间隔增宽,与模型组比较,病变较轻。3、胰腺组织病理学评分:与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的胰腺组织病理评分明显降低（8.50±0.78 vs 12.30±1.26,P<0.05）;与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（12.30±1.26vs0,P<0.01）。4、各组大鼠胰腺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠胰腺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-α表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。五、各组大鼠肺组织病理学观察:1、大体标本观察:对照组大鼠肺无水肿、充血,表面红润,气管内无渗出液。SAP模型组大鼠肺明显水肿、充血,表面苍白,包膜下可见渗血,气管内较多渗出液。大柴胡汤组大鼠肺可见水肿、充血,较SAP模型组大鼠轻,表面苍白,包膜下少量渗血,气管内少量渗出液。2、HE染色光镜下观察:对照组大鼠肺组织结构完整、清晰,细胞排列规整,无炎性细胞浸润;肺泡壁薄,无充血、水肿,肺泡内无渗出液。SAP模型组大鼠肺组织结构模糊,大量炎性细胞浸润,少量红细胞渗出;肺泡壁增厚,明显充血、水肿,肺泡内大量渗出液,富含蛋白,透明膜形成。大柴胡汤组大鼠肺组织结构较完整,少量炎性细胞浸润,偶见红细胞渗出;肺泡壁轻度充血、水肿,肺泡内少量渗出液,富含蛋白,渗出较SAP模型组减轻,病变较轻。3、肺组织病理学评分:与SAP模型组相比,大柴胡汤组大鼠的肺组织病理评分明显降低（5.35±0.49 vs 8.93±0.85,P<0.05）;与对照组相比,SAP模型组大鼠的胰腺组织病理评分明显升高（8.93±0.85 vs 0,P<0.01）。4、各组大鼠肺组织IL-10免疫组化检测结果:对照组细胞内IL-10表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内IL-10表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内IL-10表达明显增加,免疫组化染色较SAP模型组更加明显。5、各组大鼠肺组织TNF-α免疫组化检测结果:对照组细胞内TNF-a表达正常,未见明显病理变化;SAP模型组细胞内TNF-α表达增加,免疫组化染色较对照组明显;大柴胡汤组细胞内TNF-α表达较少,免疫组化染色较SAP模型组少。六、各组大鼠胰腺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,对照组大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-KB p65的表达正常。SAP组大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达明显增加。大柴胡汤可抑制SAP大鼠胰腺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-κB p65的表达。七、各组大鼠肺组织中p38 MAPK/NF-κB通路关键蛋白的表达水平Western Blot检测结果显示,对照组大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达正常。SAP组大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化、NF-κB p65的表达明显增加。大柴胡汤可抑制SAP大鼠肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-KB p65的表达。结论1、大柴胡汤治疗SAP大鼠可增加HO-1表达,减轻炎症反应,明显减轻胰腺及肺组织病理改变。2、大柴胡汤可抑制SAP大鼠胰腺和肺组织中p38 MAPK的磷酸化、MAPKAPK2的活化,抑制NF-κB p65的表达。3、大柴胡汤对SAP大鼠胰腺和肺组织保护作用的机制可能与诱导HO-1表达升高IL-10、降低TNF-a有关。4、p38 MAPK/NF-κB通路可能是大柴胡汤诱导HO-1表达发挥抗炎和器官保护作用的关键炎症信号传导通路。
张嘉茜[7]（2019）在《肝素衍生物靶向胞外组蛋白对脓毒症免疫抑制小鼠的保护作用研究》文中研究指明脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,是ICU常见病症。脓毒症的病理生理过程十分复杂,尽管当前抗感染及器官功能支持治疗取得了显着疗效,但脓毒症的病死率仍高达30%～50%。据统计,全球每年约有530万人死于脓毒症。脓毒症患者主要有两个死亡的高峰期,一是全身炎症阶段,二是免疫抑制期。当前的治疗水平下,绝大部分脓毒症患者能够度过严重的全身炎症反应阶段进入免疫抑制期阶段,处于免疫抑制期的患者常因无法控制的继发性感染和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）而死亡。研究显示,死亡的脓毒症患者中分布于淋巴结、脾脏、胸腺、小肠及其他器官中的淋巴细胞均发生广泛凋亡。脾脏作为人体最大的外周免疫器官,不仅是免疫细胞居住和对外源性抗原产生免疫应答的主要场所,其中的巨噬细胞还具有清除作用,使得脾脏在脓毒症免疫抑制中发挥着重要作用,胸腺和淋巴结分别作为T细胞产生和免疫应答的重要器官,在免疫抑制中同样发挥着重要作用。肝脏作为人体最大的腺体,在代谢和免疫稳态中起着重要作用,也是脓毒症最常见的损伤器官之一,在脓毒症的发展和发生过程中也起着关键作用。研究发现,免疫细胞的大量凋亡及炎症因子失衡所导致的免疫抑制现已成为脓毒症患者死亡的重要原因,病死率高达 40%～80%。近年来大量研究表明,脓毒症时胞外组蛋白作为最新发现的一种损伤模式（damage associated molecular pattern,DAMP）分子,主要由中性粒细胞外陷阱（neutrophil extracellular traps,NETs）及凋亡或坏死的细胞释放,一旦释放到细胞外,可通过多种信号通路产生细胞毒性,引起内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、固有免疫细胞等凋亡并释放大量细胞因子进而诱导免疫应答紊乱造成器官损伤甚至机体死亡。临床研究发现,在严重脓毒症和脓毒性休克患者外周血清中组蛋白-DNA混合物的含量均显着性增高。因此,胞外组蛋白现已成为脓毒症治疗的潜在靶点。肝素属于糖胺聚糖,其主要双糖单位为三硫酸双（IdoA2S03-GlcNS036S03）,具有很强的电负性。2014年Wildhagen等人通过表面等离子共振技术（surface plasmon resonance,SPR）证实肝素能直接结合组蛋白,并有效减轻组蛋白的细胞毒性作用达到对脓毒症小鼠的治疗作用。众所周知,肝素具有很强的抗凝作用,此外,其还具有抗炎、免疫调节特性、糖萼保护等多种作用。但是,肝素潜在的出血风险使其在脓毒症的应用中受到很大限制。通过对肝素进行多种方式衍生化,筛选可以有效替代肝素,且与胞外组蛋白具有较强的亲和作用同时可降低抗凝活性的肝素衍生物已成为研究发展的方向。本课题组在前期研究中发现,经高碘酸氧化、硼氢化钠还原制备的肝素糖醛酸C2-C3断裂肝素衍生物（HP-SP）,对肝素的主链结构并未破坏,同时保留了肝素的高硫酸化程度。本课题组还发现,虽然HP-SP的体外抗凝活性大幅降低,但其仍能够显着改善脓毒症小鼠高凝状态;HP-SP可通过抑制乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶-9的表达保护脓毒症小鼠的脑、小肠和心脏的糖萼;HP-SP还具有抗肿瘤转移活性。肝素衍生化的方式主要包括降解为低分子片段、脱硫酸基、破坏其抗凝戊糖结构等。本课题选择不同大小的肝素片段dp6、dp12及dp24,硫酸化低的硫酸乙酰肝素以及HP-SP为研究对象,从分子、细胞和动物水平优选出HP-SP这个胞外组蛋白拮抗剂。随后考察了其对胞外组蛋白致淋巴细胞凋亡和巨噬细胞吞噬活性减弱的保护作用;采用双打击方法复制了脓毒症免疫抑制小鼠,考察HP-SP对该模型小鼠淋巴细胞（CD4、CD8）的保护和炎症因子（IL-6、TNF-α IL-1β和IL-10）的调节作用,对免疫相关器官（脾脏、胸腺、淋巴结、肝脏、小肠）和肾脏的保护作用,以及对脓毒症免疫抑制小鼠生存率的改善作用。本研究取得的结果以及结论主要有:1.在分子和细胞水平上对不同分子量、硫酸化程度、糖醛酸开环的肝素衍生物与组蛋白亲和作用规律的研究1.1分子水平考察不同肝素衍生物与组蛋白的相互作用研究利用SPR技术考察了不同分子量、硫酸化的肝素衍生物和HP-SP与组蛋白亲和力的大小及规律。结果显示,不同分子量肝素衍生物与组蛋白亲和力的大小排序为:肝素钠≈依诺肝素钠≈dp24≈dp12>dp6;肝素糖醛酸开环的衍生物与组蛋白亲和力的大小排序为:肝素≈HP-SP≈达肝素>M402;不同硫酸化肝素衍生物与组蛋白亲和力的大小排序为:肝素>硫酸乙酰肝素。1.2在细胞水平上考察不同肝素衍生物对组蛋白致内皮细胞凋亡的保护作用的研究采用流式细胞术测定了胞外组蛋白对EA.hy 926内皮细胞凋亡保护作用的研究。结果发现,100μg/mL肝素等样品干预对100μg/mL组蛋白所致EA.hy 926细胞凋亡的影响中,各组内皮细胞（空白对照组、组蛋白组、肝素组、dp6组、dp12组、dp24组、依诺肝素组、达肝素、M402组、HP-SP组、硫酸乙酰肝素组）存活率分别为:（92.53土0.47）%、（31.83±2.48）%、（90.26±1.80）%、（49.77土0.47）%、（76.03±1.08）%、（81.50士0.79）%、（84.7±1.87）%、（87.87±1.02）%、（84.4±1.93）%、（89.13±1.87）%、（85.77±0.76）%。不同分子量肝素衍生物对内皮细胞保护强弱为:dp6<dp12<dp24<肝素;糖醛酸开环肝素衍生物对内皮细胞保护的存活率为:HP-SP>M402;不同硫酸化肝素衍生物对内皮细胞保护的存活率为:肝素>硫酸乙酰肝素。上述分子和细胞水平研究表明,肝素及其衍生物与组蛋白拮抗能力的大小与其分子量（亲和力实验,分子量小于1800 Da时分子量越小结合能力越弱;内皮细胞实验,分子量越小,拮抗组蛋白细胞毒性的能力越弱）、硫酸化程度（硫酸化程度越低,结合能力越弱）有一定的关系,糖醛酸开环对其无明显影响,从分子水平和细胞水平筛选HP-SP作为拮抗组蛋白最优的肝素衍生物。2.HP-SP的体外抗凝活性测定及其对组蛋白所致小鼠生存率的影响采用羊血浆抗凝法测定了 HP-SP的抗凝效价为17.08 IU/mg。通过小鼠尾静脉注射100 mg/kg组蛋白,并提前2 min尾静脉注射30 mg/kg肝素钠和HP-SP溶液进行干预后,考察了小鼠24h生存率。其中,组蛋白组小鼠24 h的生存率为0%,给予HP-SP和肝素治疗后二者均能快速拮抗组蛋白发挥对机体的保护作用,给药组24h存活率均为100%。上述结果表明,肝素糖醛酸开环反应制备所得的HP-SP,能在体内迅速拮抗组蛋白达到对机体的保护作用,同时抗凝活性大幅降低。3.HP-SP拮抗胞外组蛋白对淋巴细胞和巨噬细胞的保护作用3.1 HP-SP对淋巴细胞的保护作用研究采用流式细胞术测定了 HP-SP和肝素对组蛋白（50 μg/mL）作用1h时致淋巴细胞凋亡的保护作用。结果显示,空白组淋巴细胞的存活率为（87.20±2.22）%,组蛋白组（29.89±2.57）%,肝素组（84.77±1.64）%,HP-SP 组（84.91±2.55）%。该结果表明,组蛋白对淋巴细胞具有很强的细胞毒性,HP-SP和肝素能够通过拮抗组蛋白发挥对淋巴细胞的保护作用（P<0.05）。3.2 HP-SP对巨噬细胞吞噬能力的保护作用研究通过中性红实验考察了组蛋白在不同浓度、作用不同时间时对巨噬细胞吞噬作用的影响。结果显示,组蛋白对巨噬细胞吞噬能力的影响具有一定的时间（6h、12h、24h）和浓度（25、50、100、200、300、400、50μg/mL）依赖性,当组蛋白浓度为300 μg/mL,作用于巨噬细胞分别6h和12 h时均呈现出抑制吞噬的趋势（P>0.05,与空白组相比）;选择组蛋白浓度300μg/mL作用时间12 h为最佳条件,开展HP-SP对巨噬细胞保护作用的研究。进一步考察不同浓度（50、100、200、400μg/mL）HP-SP及肝素对巨噬细胞吞噬能力的保护作用。结果显示,低剂量（50 μg/mL）的HP-SP和肝素便可通过拮抗组蛋白达到对巨噬细胞的保护作用,当浓度为100μg/mL时,HP-SP和肝素对巨噬细胞吞噬能力的保护达到最大（P≤0.001,与组蛋白组相比）。上述HP-SP对免疫细胞保护作用研究表明,胞外组蛋白对淋巴细胞和巨噬细胞具有很强的细胞毒性,小剂量的HP-SP和肝素便可通过迅速拮抗胞外组蛋白,减弱淋巴细胞的凋亡和并保护巨噬细胞的吞噬能力。4.HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠炎症因子的调节及对CD4、CD8淋巴细胞和免疫器官保护作用的研究采用CLP法造模72 h后,腹腔注射5 mg/kg LPS诱导脓毒症免疫抑制小鼠模型,并CLP在手术4 h后连续3天,HP-SP和肝素组分别尾静脉注射HP-SP（8 mg/kg）和肝素（3 mg/kg）干预治疗,假手术组和CLP组均尾静脉注射同等剂量生理盐水。4.1 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠血浆中IL-6、IL-10及胞外组蛋白水平的影响CLP造模96 h后,采用ELISA法测定小鼠血浆中IL-6、IL-10及胞外组蛋白水平,结果显示,CLP组（脓毒症早期）IL-6含量显着增加（P<0.05,与假手术组比）,IL-10和胞外组蛋白水平均无明显增加;CLP-LPS组（免疫抑制期）IL-6含量明显降低,IL-10和胞外组蛋白水平均显着增加（P<0.05,与CLP组比）。当提前给予HP-SP和肝素进行干预治疗时,二者均可通过显着降低IL-10和胞外组蛋白水平,但对IL-6水平无显着性改变（P>0.05,P<0.05,与CLP-LPS组比）。上述结果表明,第二次打击后,处于脓毒症免疫抑制期（CLP-LPS组）的小鼠促炎因子IL-6的释放受到明显抑制（P<0.05）,抗炎因子IL-10释放显着增加（P<0.05）,这符合免疫抑制期机体炎症水平失衡的特征,同时胞外组蛋白水平在免疫抑制期显着升高。当提前给予肝素和HP-SP干预时,二者可通过降低胞外组蛋白水平保护免疫细胞的凋亡来抑制IL-10的释放,但对促炎因子IL-6水平无明显影响。对于所检测的这三个指标,非抗凝的HP-SP与肝素的作用均无显着差异（P>0.05）。4.2脓毒症免疫抑制小鼠脾脏、胸腺、淋巴结组蛋白H4、CD4及CD8的免疫组化测定CLP造模96h后,采用免疫组化法检测了小鼠脾脏、淋巴结及胸腺中H4、CD4和CD8蛋白表达情况。结果显示,CLP-LPS组小鼠脾脏、淋巴结及胸腺中CD4和CD8淋巴细胞均显着减少（P<0.05,与假手术阻比）,其中,CD8淋巴细胞减少程度弱于CD4淋巴细胞,且三种免疫器官中组蛋白H4表达均显着增加（P<0.05）,进一步考察CD4/CD8的比例发现,CLP-LPS组小鼠中脾脏、淋巴结及胸腺CD4/CD8的比例显着降低（P<0.05）。当提前给予肝素和HP-SP进行干预治疗时,二者均能够通过拮抗胞外组蛋白H4的细胞毒性有效缓解免疫器官中CD4和CD8淋巴细胞的凋亡情况（P<0.05）;其中HP-SP可有效提高脾脏和淋巴结CD4/CD8的比例（P<0.05）,但对胸腺CD4/CD8比例虽有提高但无显着性差异;肝素可有效提高淋巴结CD4/CD8的比例（P<0.05）,对脾脏和胸腺CD4/CD8比例虽有改善但无显着性差异。上述结果表明,免疫抑制期（CLP-LPS组）小鼠脾脏、胸腺和淋巴结都发生CD4和CD8淋巴细胞大量凋亡且CD4/CD8的比例显着下降,这与三脏器中胞外组蛋白的细胞毒性密切相关。当提前给予肝素和HP-SP进行干预治疗时,二者均能够通过拮抗胞外组蛋白H4的细胞毒性有效缓解免疫器官中CD4和CD8淋巴细胞的凋亡情况（P<0.05）,且对淋巴结的改善效果要强于脾脏和胸腺组织,HE的研究观察也支持该结果。4.3 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠脾脏、胸腺、淋巴结病理改变的影响CLP造模96 h后,采用HE染色对脾脏、胸腺和淋巴结病理变化进行了评估。结果显示,CLP-LPS组淋巴结、胸腺和脾脏中淋巴细胞均减少且排列疏松,其中脾脏中存在大量中性粒细胞且巨噬细胞增生现象。当提前给予肝素和HP-SP干预时,二者均能明显改善三者病理改变情况且对于淋巴结的改善效果强于脾脏和胸腺。上述结果表明,处于免疫抑制期小鼠免疫器官（脾脏、胸腺及淋巴结）淋巴细胞数目减少且排列疏松,免疫组化结果已验证三个脏器存在较高水平组蛋白单体（H4）,因此,三者淋巴细胞的减少与胞外组蛋白的毒性相关。当提前给予肝素和HP-SP时,二者均可通过拮抗胞外组蛋白,抑制免疫器官淋巴细胞凋亡,改善组织病理损伤,这与HP-SP和肝素拮抗胞外组蛋白,保护免疫细胞,抑制IL-10的大量释放进而改善组织免疫抑制有关。上述HP-SP对脾脏、胸腺、淋巴结保护作用研究表明,提前给予HP-SP和肝素能够在体内通过拮抗胞外组蛋白细胞毒性,可抑制免疫抑制期小鼠抗炎因子IL-10的大量释放调节炎症水平,并且可保护脾脏、淋巴结及胸腺中CD4、CD8淋巴细胞免于其大量凋亡对免疫抑制的免疫紊乱进行调节,进而改善脓毒症免疫抑制达到对机体的保护作用。5.HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠肝损伤保护作用的研究采用CLP法造模72 h后,腹腔注射5 mg/kg LPS诱导脓毒症复制免疫抑制小鼠模型,并在CLP造模4h后连续3天,尾静脉注射分别注射8 mg/kg HP-SP和3 mg/kg肝素钠溶液进行干预。5.1 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠肝组织中胞外组蛋白、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10及胞外组蛋白水平的影响CLP造模24h和96h后,采用ELISA法测定小鼠肝组织中胞外组蛋白、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10。结果显示,24h和96h时,CLP-LPS组IL-6、TNF-α IL-1β、IL-10和胞外组蛋白含量均显着性增加（P<0.05）,且96h时,胞外组蛋白和IL-6的水平明显低于24h,但IL-10水平则明显升高。当提前给予肝素和HP-SP进行提前干预时,二者均可显着降低肝组织中胞外组蛋白、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10的水平（P<0.05）。上述结果表明,在脓毒症初期（24h）由于胞外组蛋白的毒性,肝组织处于促炎因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）主导阶段,而到脓毒症免疫抑制期（96h）处于抗炎因子（IL-10）主导阶段;当给予肝素和HP-SP干预治疗时,肝素和HP-SP可以通过降低肝组织中胞外组蛋白的水平,进而降低IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10炎症因子水平,达到对肝组织的保护作用。肝脏的HE检测和肝功酶学支持这一结果。5.2 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠肝功能指标AST、ALT的影响CLP造模12h、24h和96h后,采用微孔法测定小鼠血清中AST、ALT水平变化。结果显示,CLP-LPS组小鼠在12h、24h和9h时,AST和ALT水平均显着性升高（P<0.05）,且在术后24h内持续增加。当提前给予肝素和HP-SP进行干预治疗时,二者均可通过拮抗胞外组蛋白调节炎症水平减少肝损伤,降低AST和ALT的水平支持该结果。上述结果表明,脓毒症时,小鼠肝损伤在脓毒症早期便发生,这与肝组织中胞外组蛋白可致炎症因子大量释放致使肝细胞凋亡、坏死有关。当提前给予肝素和HP-SP治疗时,二者均可通过拮抗胞外组蛋白降低TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平,减弱肝组织的损伤程度,从而降低血清中AST和ALT的水平。5.3 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠相对肝脏重量及肝组织病理损伤的影响CLP造模24h和96h后,结果显示,在24h时,各组相对肝重并无明显差异（P>0.05）,在96h时相对肝重有所增加,但无显着性差异（P>0.05,与假手术组相比）。HE染色结果显示,96h时,处于免疫抑制期的小鼠多数肝细胞出现中度肿胀,肝窦变窄,并出现灶状炎性坏死病灶。当提前给予肝素和HP-SP干预治疗时,可有效改善肝脏病理损伤。上述肝损伤的研究表明,HP-SP和肝素可以通过降低肝组织中胞外组蛋白水平进而减少肝组织中IL-6、TNF-α IL-1β和IL-10炎症因子的释放,进而改善免疫抑制状态减少肝损伤。AST、ALT水平的降低和HE染色结果均支持该结论。6 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠小肠和肾脏的保护作用以及对脓毒症免疫抑制小鼠7天生存率的影响6.1小鼠一般情况观察及7天体重变化CLP造模连续7天观察发现,脓毒症小鼠在CLP术后出现多种病态表现,即精神萎靡,尾部有稀水样粪便连,眼周存在分泌物有的内眦有出血症状,体重下降,且解剖后腹部恶臭等。结果表明,脓毒症小鼠造模成功。观察小鼠7天体重变化发现,CLP-LPS组小鼠7天内体重显着降低,肝素和HP-SP干预治疗可明显改善小鼠体重的下降。6.2小鼠小肠和肾脏HE染色及7天生存率考察CLP造模96h后,小鼠小肠和肾脏HE染色发现,CLP-LPS组小肠绒毛萎缩并且上皮细胞发生明显脱落,肾脏被膜增厚。当提前给予肝素和HP-SP的干预治疗时,可以有效改善小肠和肝脏的病理变化状态。7天生存率观察发现,CLP-LPS组小生存率为14.2%,当提前给予肝素和HP-SP的干预治疗时,二者均能显着的提高脓毒症小鼠的生存率,其中肝素组生存率为42.8%,HP-SP组生存率为35.7%。上述表型研究表明,提前给予HP-SP和肝素能够在体内通过拮抗胞外组蛋白细胞毒性调节炎症水平和保护免疫细胞进而改善免疫抑制状态,达到对脓毒症小鼠小肠粘膜损伤和肾脏的损伤的保护作用,同时可有效改善脓毒症小鼠的体重降低并显着提高脓毒症小鼠7天的生存率。7结论本课题研究发现,低抗凝的HP-SP在体内外均具有拮抗胞外组蛋白细胞毒性的作用,籍此发挥对脓毒症免疫抑制小鼠的免疫相关器官和免疫细胞等的多方面保护作用,改善免疫抑制状态,或藉此作用阻止脓毒症由SIRS期进入更为棘手和凶险的CARS期,这对于脓毒症的治疗有重要价值。8本课题的创新性及潜在的应用价值（1）肝素衍生物可以与组蛋白相互作用,但是,其作用规律并未进行系统研究。本课题在分子和细胞水平探索了肝素及其衍生物和组蛋白相互作用与分子量大小、硫酸化程度及糖醛酸开环之间的规律。结果发现,肝素及其衍生物与组蛋白的亲和作用会随着肝素分子量和硫酸化程度的降低而减弱,而肝素非硫酸化糖醛开环对其无明显影响。（2）肝素的潜在出血危险使其在临床应用中受到很大限制。本课题发现,HP-SP具有较小的抗凝活性,且保留了肝素较强的硫酸化程度,与肝素有着几乎相同的亲和组蛋白的能力。（3）胞外组蛋白作为DAMP分子,对于其研究大多数集中在脓毒症早期研究。本课题研究发现,在脓毒症免疫抑制期,胞外组蛋白仍有着较高水平,这为免疫抑制期的干预研究提供了新的研究方向。10本课题今后的研究方向HP-SP拮抗组蛋白对免疫细胞保护的分子机制,以及HP-SP拮抗胞外组蛋白发挥肝脏和小肠保护作用后,对脓毒症时紊乱的免疫水平的调节作用和机制需要进一步研究。
陆江阳[8]（2014）在《多器官功能障碍综合征的病理学变化》文中认为严重创伤感染及危重病后期出现多个脏器的渐进性损伤,进而发生多器官功能障碍综合征（NODS）。本文系统介绍了MODS的病理变化。有助于提高病理工作者在临床活检、尸检及科研教学中对MODS发病原因、病变特征和病程规律的认识,为MODS防治提供病理学依据。
刘晨风[9]（2014）在《高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠病理损伤特征及补体介导的免疫病理损伤机制研究》文中研究指明目的:目前人高致病禽流感H5N1病毒引起的高病死率和新发人禽流感病毒的频繁出现对公共卫生提出了严峻挑战。人禽流感病毒感染后的生理和病理特征仍需进一步探讨，不同人禽流感病毒的感染损伤特征及宿主反应分析仍需研究。此外，免疫病理损伤在人禽流感病毒感染致病中的分子机制仍然没有充分系统的认识，尤其是对补体介导的免疫病理损伤作用及机制缺乏了解。为此，本研究建立高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型，同时对比分析H5N1、H7N9及H1N1病毒感染小鼠后的病理损伤特征及宿主反应。此外应用H5N1病毒感染小鼠模型系统阐明补体介导的免疫病理损伤的致病作用及分子机制，以期为防治新发人禽流感病毒及探索新的免疫治疗策略等提供参考。方法:（1）高致病性H5N1病毒感染小鼠模型建立：生物安全三级实验室内滴鼻感染20μl10LD50H5N1病毒感染小鼠，对照组同样方法接种PBS。观察小鼠生命状态及体重变化、生存时间及存活率。感染后1天、3天和5天分别处死小鼠，检测H5N1病毒感染组织嗜性及组织中病毒分布及滴度，苏木素-伊红（HE）染色检测小鼠各组织病理变化；免疫组化技术检测肺组织中性粒细胞表达及浸润程度；ELISA技术检测感染后血清白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）和肺组织匀浆液中的髓过氧化物酶（MPO）的表达变化；荧光实时定量PCR技术检测肺组织中干扰素反应水平变化。（2）不同流感病毒感染小鼠损伤特征比较分析：利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型，对比分析各小鼠模型不同流感病毒感染后存活率和体重变化、分析小鼠组织病理损伤、病毒复制和抗原分布差异，感染后中性粒细胞表达变化，及免疫组化技术检测增殖细胞核抗原（PCNA），旨在对比分析各流感病毒的致病性及以宿主针对不同流感病毒感染后的自身修复能力。（3） H5N1病毒感染后补体激活研究：在H5N1病毒感染所致严重肺炎的小鼠模型中，分别使用免疫组化技术检测补体成分C3和C5b-9在肺组织的沉积和补体受体C3aR和C5aR及凝集素途径MBL-c成分的表达变化，使用荧光实时定量PCR技术检测C3aR、C5aR和MBL激活相关丝氨酸蛋白2（MASP2）的转录水平的表达变化，以评价小鼠模型在H5N1病毒感染后补体的激活情况。（4）抑制补体激活在H5N1病毒所致肺炎的保护作用研究：在H5N1病毒建立的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症（ALI/ARDS）模型中，分别使用眼镜蛇毒因子（CVF）降低机体补体的整体水平，C3aR抑制剂（C3aRa）阻断C3a与C3aR结合以及抗小鼠C5a抗体封闭C5a活性等方式抑制补体过度激活，实验共分为4组：①CVF干预组：在感染前24h和48h分别腹腔注射CVF（2.5μg/只/次）；②C3aRa阻断组：在感染后立即尾静脉注射C3aRa（1mg/kg）；③Anti-C5a Ab阻断组：在感染之后立即尾静脉注射Anti-C5a Ab（400ug/只），④H5N1病毒感染未治疗组。对比观察各组小鼠存活率及生命状态，检测小鼠肺组织病理损伤差异及炎症细胞数量及炎症因子及干扰素反应水平差异，评价抑制补体激活在H5N1感染所致严重肺炎中的保护作用。结果：（1）高致病性禽流感H5N1病毒感染小鼠模型研究。小鼠感染H5N1病毒后所呈现出的生命状态、生理病理特征以及炎症反应均与临床H5N1病毒感染患者的ALI/ARDS相似，主要体现为：小鼠活动力明显减弱，体重减轻；出现倒毛、弓背等现象；从第7天开始死亡，10d内小鼠全部死亡，死亡率达100%；在病毒感染小鼠之后能够检测病毒在肺组织存在并复制，感染早期存在于气管和支气管腔，晚期浸润到肺泡腔和肺间质内，多数小鼠脑内也能分离到病毒。病毒感染后主要损伤器官为肺组织，感染早期肺支气管上皮细胞脱落、坏死，感染后期肺组织出现弥漫性损伤，肺泡腔塌陷、组织大量充血水肿。感染后肺组织出现显着的炎症反应，中性粒细胞增多并且在感染后期浸润到肺泡腔内，中性粒细胞分泌的MPO表达明显增多，血清中致炎细胞因子IL-6和TNF-α也发生上调，小鼠肺组织IFN-γ表达增强，IFN-α/β R表达水平下降。（2）不同流感病毒感染小鼠损伤特征分析研究：利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型，对比分析不同流感病毒感染后的小鼠损伤特征，主要表现为：H7N9病毒感染后小鼠无死亡，H5N1和H1N1病毒感染后小鼠均全部死亡，但H5N1病毒小鼠存活时间更短；三种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和少量间质细胞。H7N9病毒感染小鼠肺组织呈现脉管炎和间质炎的病理特征，脾脏偶见轻微病变；而H5N1和H1N1病毒感染后小鼠肺组织呈现ARDS的典型病理特征，并且H5N1病毒的肺损伤更为严重，两者脾脏炎细胞均明显增多。H7N9病毒感染之后宿主炎症反应较小，感染后小鼠肺组织自我修复能力较强；H5N1和H1N1病毒感染小鼠后机体炎症反应强烈，感染后恢复能力差，其中H5N1病毒感染炎症最为明显，恢复能力最差。（3）H5N1病毒感染小鼠后补体激活研究：H5N1病毒感染小鼠后小鼠补体成分C3和C5b-9在肺组织沉积明显增多，补体受体C3aR和C5aR表达明显上调，其中感染早期补体成分及受体主要沉积和表达在支气管腔上皮细胞，感染后期在肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等大量沉积和表达，并且发现凝集素途径中的MBL-c沉积及MBL活化相关的丝氨酸蛋白2的表达也明显增强。使用实时定量PCR检测到C3aR, C5aR和MASP2转录水平同样在感染后升高，其中C5aR和MASP2升高更为明显。提示补体在H5N1病毒感染后大量激活，其中凝集素途径是重要的病毒感染后的补体激活途径。（4）抑制补体激活在H5N1病毒所致严重肺炎中的保护作用研究：分别使用CVF降低机体补体的整体水平，C3aRa阻断C3a与C3aR结合以及抗小鼠Anti-C5aAb封闭C5a活性等方式抑制补体过度激活，与未治疗组对比分析，在抑制补体激活之后，小鼠的存活时间明显延长，死亡率降低，小鼠的活动力增强，生命状态改善，治疗后小鼠在感染后期均未出现严重肺炎的病理特征，仅出现肺间隔增宽，小灶性肺泡腔塌陷等。另外，抑制补体激活后有效降低H5N1病毒感染所致炎症反应，主要体现为中性粒细胞浸润程度降低，肺组织MPO表达降低，血清中TNF-α因子下降及宿主II型干扰素反应降低。以上结果提示抑制补体激活能够降低炎症反应，有效减轻H5N1病毒感染所致的肺组织病理损伤。结论:本研究成功建立了高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型，并详细评价感染后小鼠的病理生理特征和炎症变化，同时对比分析了不同流感病毒的感染特征和损伤特征的差异，明确了流感病毒毒力及宿主反应的差异。此外，应用H5N1病毒感染小鼠模型阐明了补体介导的免疫病理损伤致病作用及分子机制，并采取不同的补体抑制方式探索基于补体为治疗靶点的免疫治疗策略研究。该研究为探讨人禽流感病毒感染损伤特征及致病机制，探索预防和治疗新发人禽流感病毒的新的免疫治疗策略研究奠定基础。
陈仲清[10]（2014）在《PD对MODS模型大鼠的抗氧化应激、炎症反应和凋亡的保护作用》文中研究指明多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）是重症监护病房（intensive care unit, ICU）患者发病和死亡的一个重要原因。MODS的成年患者在ICU中的发生率为11%～40%,在我国归因于MODS的总死亡率超过了60%。目前对于MODS的共识认为它是一种连续的生理紊乱状态,但对于这种状态的发病机制尚未完全明了。现有观点认为MODS与炎症反应、自由基生成增加和肠道菌群移位等有关。缺血再灌注损伤和严重脓毒症是MODS最常见的致病原因之一。MODS的治疗主要集中在支持性治疗,如增加氧输送,营养支持等。开发一种以减少氧化应激和调节炎症反应为靶点的药物可能是一种具有前景的研究方向。虎杖苷（3,4’,5-三羟基芪-3-葡萄糖甙,Polydatin,PD）是单晶体药物,它是从中国传统中药虎杖分离出来的（图1）。我们实验组以往工作表明,在严重失血性休克大鼠模型中,PD能通过减少大鼠动脉血管平滑肌细胞和神经元线粒体损伤发挥作用,这些作用与减少机体氧化应激水平有关。本实验拟通过复制大鼠失血性休克和盲肠结扎穿刺（cecal ligation puncture, CLP）二次打击模型,研究PD是否具有治疗MODS大鼠的作用以及它作用的可能机制。本研究主要分为两个步骤进行：1.MODS模型复制和PD最佳给药剂量探索；2.PD作用于MODS大鼠的机制探讨。第一部分MODS模型复制和PD最佳给药剂量探索方法：实验分为正常对照组（sham组）、MODS后生理盐水组（normal saline,NS）组和MODS后PD给药组,其中PD组又分为不同的给药剂量组（15mg/kg,30mg/kg,45mg/kg,60mg/kg大鼠体重）。sham组大鼠仅行基本外科操作,其余组大鼠在以上外科操作基础上进行失血性休克和CLP双重打击,随后立即进行给药（图2）。NS组给药为0.3mlNS×3次（CLP操作完成后立即开始,之后每6小时1次）,PD组给药为不同剂量的PD溶解于0.3mlNS中通过股静脉10分钟内缓慢推注。建模治疗后各组大鼠（每组8只）撤管并缝合伤口,回笼,室温下自由饮食饮水。观察各组生存时间（每小时观察1次,以72小时为观察终点）,计算各组72小时的生存率。为评估MODS诱导24小时后大鼠造模是否成功,抽取静脉血测定血清生化指标（BUN,CR-MB,TBIL,LDH,CK,ALT and AST）和动脉血气。随后立即颈椎脱臼法处死大鼠,常规固定肾、肺和肝组织,苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色行病理分析。采用SPSS13.0软件录入数据,Kaplan-meier法进行各组生存时间分析,One-way ANOVA方法比较各组平均数±标准差,LSD-t法检验多重样本均数。1.各组给药后生存时间观察和最佳PD给药剂量sham组8只大鼠在24h、36h和48h三个观察时间点均存活。MODS处理的各组均有大鼠死亡。其中MODS+NS组前36小时仅有2只大鼠存活,48小时内全部死亡,72h观察时间段的中位数生存时间是29h。MODS+PD各给药组中PD45mg/kg组效果最优,8只大鼠在前36小时均存活,48小时时间内仅有1只死亡,72小时的中位数生存时间为49小时。由此初步确立PD45作为以后的给药剂量。2.生化指标测定和血气分析和sham相比,MODS+NS组大鼠血生化值均显着增高且两组间比较差别具有统计学意义（P<0.05）.MODS+NS组的血气参数,包括pH值、血乳酸、碱剩余和HC03-均较sham组均有增高且两组间差值具有统计学意义（P<0.05）。同时PD各给药组中45mg/Kg组对于MODS各脏器的生化指标和血气分析改善作用最佳且明显优于MODS+NS组。3.病理鉴定sham组大鼠各脏器均未出现明显病理变化。然而,在MODS+NS组中,肾、肝和肺的病理均出现了病变。部分近端肾小管上皮细胞出现浊肿、变性、细胞部分缺失、管腔狭窄,有的管腔伴有少量血栓沉积；部分肝中央静脉缩小,肝窦扩张充血,肝细胞胞浆呈混浊肿胀,许多肝细胞出现气球样变或退行性变；肺间质水肿和扩大,部分肺泡萎陷,血管和间质周围有许多炎症细胞浸润。PD45mg/Kg给药组均有病变减轻。结论1.大鼠MODS模型诱导24小时后,肝脏、肾脏、心脏、肺脏功能均出现了损伤,肝、肾和肺的病理学结果支持了功能学的变化。2.以血生化指标增高倍数和病理的结果作为判定标准,大鼠MODS建模24小时后NS组肝脏和肾脏的功能出现了衰竭,说明MODS模型复制成功。3.结合MODS发生率、中位数生存时间、生化和血气指标的测定,45mg/kg的PD单次静脉给药是最合适的剂量。第二部分PD对MODS大鼠的治疗作用和机制探索方法实验分为sham组,MODS+NS组和MODS+PD组。sham组和MODS+NS组的操作同前,MODS+PD组大鼠每次给药为等容积的PD（45mg/Kg）。为评估MODS诱导24小时后大鼠多脏器情况（每组8只）。血清生化指标（BUN, CR, TBIL, LDH, CK, ALT,AST）、动脉血气分析、晚期氧化蛋白产物（advance oxidative protein products,AOPPs）和炎症因子（IL-1, IL-6, TNF-α）分别被测定。之后颈椎脱臼法处死大鼠,取肾、肺和肝组织常规固定HE染色,免疫组化法测定凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cytochrome C）和ELISA法测定肾和肝匀浆的caspase-3活性（每组6-8只）。采用SPSS13.0软件录入数据,Kaplan-meier法进行各组生存时间分析,One-way ANOVA方法比较各组平均数±标准差,LSD-t法检验多重样本均数。结果1.PD对于MODS大鼠模型整体生存时间的影响sham组的大鼠48小时均存活。MODS+PD组和MODS+NS组的中位数生存时间为分别为49小时和29小时,PD处理后实验大鼠的中位数生存时间明显延长。2.PD对MODS大鼠模型主要血液生化指标和动脉血气的影响和MODS+NS组相比,MODS+PD组所有的血生化值均显着降低（图3）。血气参数包括pH值、血乳酸、碱剩余和HC03-在MODS+PD组均有改善,以上参数两组比较均具有统计学意义（P<0.05）。3.PD对MODS大鼠的病理的影响在MODS+NS组中,肾、肝和肺的病理均出现了病变。部分近端肾小管上皮细胞出现浊肿、变性、细胞部分缺失、管腔狭窄,有的管腔伴有少量血栓沉积；部分肝中央静脉缩小,肝窦扩张充血,肝细胞胞浆呈混浊肿胀,许多肝细胞出现气球样变或退行性变；肺间质水肿和扩大,部分肺泡萎陷,血管和间质周围有许多炎症细胞浸润。与NS组比较,PD45mg/Kg给药组肾脏、肝脏和肺脏的病理损伤均有减轻。4.PD对MODS的大鼠血清AOPPs水平的影响MODS+NS组血清AOPPs明显增高,PD治疗组血清AOPPs浓度显着下降。较sham组比较,两组的增高率分别为77.4%和33.5%,两组间比较具有统计学意义（F=7.919,P<0.05）。5.PD对MODS大鼠肾脏、肝脏和肺脏组织凋亡相关蛋白表达的影响与MODS+NS组相比,MODS+PD组在肾脏和肝脏组织胞质细胞色素C免疫组化染色的相对灰度值均显着减少。各组肺组织蛋白表达之间无显着差异。（两组在肾脏和肝脏组织的相对值分别是110%vs30.2%,F=70.4,P<0.01；40%vs11.2%,F=22.4,P<0.05）。与MODS+NS组相比,MODS+PD组在肾脏和肝脏组织Bax蛋白免疫组化染色的相对灰度值均显着减少。各组肺组织蛋白表达之间无显着差异。（两组在肾脏和肝脏组织的相对值分别是67.1%vs24.2%,F=110.7,P<0.01；49.6%vs34.1%,F=67.4,P<0.05）。与MODS+NS组相比,MODS+PD组在肾脏和肝脏组织Bcl-2免疫组化染色的相对灰度值均显着增加。各组肺组织蛋白表达之间无显着差异。（两组在肾脏和肝脏组织的相对灰度值在肾脏和肝脏分别是9.9%vs31.4%,F=21.1,P<0.01；18.3%vs33.3%,F=4,P<0.05）。同sham组相比,MODS+NS组和MODS+PD组中caspase-3活性增高明显。然而,MODS+PD组的caspase-3的活性显着低于MODS+NS组且两组间比较具有统计学意义。（肾脏52.1%vs148%,F=44.5,P<0.01；肝脏39.8%vsl23.8%,F=27.9,P<0.01）。6.PD对MODS大鼠血清炎症细胞因子水平的影响同sham组相比,MODS+NS组和MODS+PD组的三种细胞因子水平均升高。然而,这些指标在MODS+PD组明显低于MODS+NS组,且两组间比较均具有统计学意义（IL-6：12倍vs8倍,F=33.6,P<0.01；TNF-α:13倍vs10倍,F=77.5,P<0.05;IL-1：8倍vs5倍,F=41,P<0.05）。结论PD改善了MODS大鼠多个器官（肝、肾和肺）的功能和整体生存时间。它的作用机制可能与抑制氧化应激、降低炎症反应和抑制激活线粒体介导的凋亡途径等有关。
二、小鼠迟发型多器官功能障碍综合征模型复制及病理学观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠迟发型多器官功能障碍综合征模型复制及病理学观察（论文提纲范文）
（1）循环组蛋白与急重症时多器官功能障碍综合征发病机制相关性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 本章小结 |
| 第二章 胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 本章小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处(详见学术成果之已发表论着2) |
| 文献综述 细菌 DNA、免疫细胞死亡与脓毒症 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间学术成果 |
| 致谢 |
（2）益精方调控慢性缺氧诱导的睾丸Leydig细胞凋亡治疗LOH的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述一 迟发性性腺功能减退症诊断、危险因素和动物模型研究述评 |
| 1.LOH诊断上的困惑 |
| 1.1 LOH精准诊断相对困难 |
| 1.2 LOH症状与睾酮水平低下不能完全对等 |
| 1.3 LOH诊断方法难以统一 |
| 1.4 LOH样症状如何定义有待商榷 |
| 1.5 LOH相关新概念的提出 |
| 1.6 小结 |
| 2.LOH动物模型构建概况 |
| 2.1 将老龄雄性大鼠(14-24月龄)视为LOH动物模型 |
| 2.2 环磷酰胺诱导生殖系统受损构建LOH动物模型 |
| 2.3 对退役种鼠进行“孤养+复合情志刺激”构建LOH动物模型 |
| 2.4 将去势小鼠视作LOH动物模型 |
| 2.5 小结 |
| 3.LOH危险因素研究概况 |
| 3.1 LOH常见的危险因素 |
| 3.2 肥胖与LOH |
| 3.3 LOH散在报道的危险因素 |
| 3.4 缺氧可能是LOH 一个尚未得到重视的潜在危险因素 |
| 3.5 小结 |
| 4.缺氧代谢产物乳酸与睾丸生殖机能 |
| 5.结语 |
| 6.参考文献 |
| 综述二 中医药对男性生殖内分泌的认识与诊疗进展 |
| 1.男性生殖内分泌的基础生理病理概况 |
| 1.1 下丘脑-垂体-睾丸轴是男性生殖内分泌的核心 |
| 1.2 HPT轴功能可受到多种危险因素的影响 |
| 2.以“天癸”为核心的中医男性生殖内分泌理论的构建 |
| 2.1 天癸是一种与人体生殖机能密切相关且客观存在的物质 |
| 2.2 天癸的本质和中西医结合研究 |
| 2.3 以天癸为核心或信使的中医“肾-天癸-精室”男性性腺轴的构建 |
| 2.4 小结 |
| 3.中医药在男性生殖内分泌疾病上的运用 |
| 3.1 常见的男性生殖内分泌疾病 |
| 3.2 中医药在动物实验研究方面对HPT轴的调控作用 |
| 3.3 中医药在临床研究方面对HPT轴的调控作用 |
| 3.4 小结 |
| 4.结语 |
| 5.参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 临床研究 症状性迟发性性腺功能减退症(sLOH)中医体质证候调查以及与慢性间歇性缺氧相关性研究 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 基本资料 |
| 2.2 sLOH患者“中医体质证候”基本调研概况 |
| 2.3 男性激素及静脉血乳酸值异常情况 |
| 2.4 cAMS评分与Epworth评分、STOP-bang评分的相关性分析 |
| 2.5 Epworth评分、STOP-bang评分与cAMS性功能症状、自主神经紊乱症状、心理和躯体症状评分之间的相关性分析 |
| 2.6 乳酸正常sLOH组与乳酸升高sLOH组各指标的比较 |
| 2.7 缺氧高中低风险3组间各指标的比较 |
| 2.8 cAMS评分轻度和中度2组间各指标的比较 |
| 3.讨论 |
| 3.1 sLOH患者中医体质证候 |
| 3.2 sLOH与缺氧 |
| 4.小结 |
| 5.参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 慢性间歇性缺氧诱导的LOH动物模型构建探究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要设备与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 造模第15天时,3组大鼠血TT、FT、乳酸检测对比 |
| 2.2 造模第30天时,3组大鼠血TT、FT、乳酸检测对比 |
| 2.3 造模第30天时,3组大鼠悬尾实验、游泳实验检测对比 |
| 2.4 模型判定与造模成功情况 |
| 3.讨论 |
| 3.1 增龄、缺氧与血TT、FT水平 |
| 3.2 缺氧对模型大鼠体能和情志的影响 |
| 3.3 乳酸的结果讨论 |
| 3.4 LOH动物模型讨论 |
| 4.小结 |
| 5.参考文献 |
| 研究二 补肾活血益精方对慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠睾丸Leydig细胞凋亡的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 各组大鼠睾丸指数的对比 |
| 2.2 各组大鼠血TT、FT水平的比较 |
| 2.3 各组大鼠血乳酸水平的比较 |
| 2.4 各组大鼠睾丸Leydig细胞凋亡率的情况对比 |
| 2.5 各组大鼠睾丸组织内Caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白表达情况 |
| 2.6 各组大鼠睾丸组织内Caspase-3、Bcl-2及Bax的基因表达情况 |
| 2.7 各组大鼠睾丸病理组织学情况比较 |
| 2.8 各组大鼠睾丸Leydig细胞超微结构的情况比较 |
| 3.讨论 |
| 3.1 Leydig细胞数量、功能与雄激素的关系 |
| 3.2 睾丸Leydig细胞的凋亡调控 |
| 3.3 益精方的组方分析及前期研究基础 |
| 3.4 益精方对LOH模型大鼠的可能作用机制一:调控睾丸Leydig细胞的凋亡 |
| 3.5 益精方对LOH模型大鼠的可能作用机制二:恢复雄激素合成睾丸内调节的正常环境,促进睾丸Leydig细胞分泌功能 |
| 4.小结 |
| 5.参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（3）半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的临床疗效评价及其调控PI3K/Akt/HO-1信号通路作用机制的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 理论研究 脓毒症胃肠功能障碍的中西医研究进展 |
| 1.脓毒症胃肠功能障碍的西医研究进展 |
| 1.1 脓毒症胃肠功能障碍认识 |
| 1.2 胃肠功能障碍的定义和诊断标准 |
| 1.3 脓毒症胃肠功能障碍西医治疗 |
| 2.脓毒症胃肠功能障碍的中医研究进展 |
| 2.1 脓毒症病因病机的探讨 |
| 2.2 脓毒症胃肠功能障碍病因病机探讨 |
| 2.3 脓毒症胃肠功能障碍中医治法探讨 |
| 第二章 临床研究 半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的临床观察 |
| 1.研究对象 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 剔除标准 |
| 1.6 脱落标准 |
| 2.研究方法 |
| 2.1 临床分组 |
| 2.2 治疗药物 |
| 2.3 治疗方案 |
| 2.4 观察指标 |
| 3.统计分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 病人的一般资料 |
| 4.2 胃肠指标 |
| 4.3 实验室指标 |
| 4.4 中医症候积分变化及疗效评价 |
| 4.5 预后评价指标 |
| 4.6 不良反应发生情况 |
| 5 讨论 |
| 5.1 气机逆乱是脓毒症MODS根本病机 |
| 5.2 调畅气机治疗脓毒症MODS之本 |
| 5.3 中焦脾胃贯穿脓毒症MODS的始终 |
| 5.4 半夏泻心汤选方依据及方药分析 |
| 5.5 临床研究结果分析 |
| 6.小结 |
| 第三章 实验研究 |
| 实验一 半夏泻心汤对脓毒症大鼠肠道损伤的保护作用 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 脓毒症大鼠模型建立 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 给药方法 |
| 2.4 标本的采集及处理 |
| 2.5 观测指标 |
| 3.统计分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 各组大鼠一般情况和生存率 |
| 4.2 血清二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸、内毒素水平 |
| 4.3 小肠组织病理学比较及评分 |
| 4.4 血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平 |
| 4.5 免疫组化检测各组脓毒症大鼠肠组织炎症因子表达 |
| 5.讨论 |
| 5.1 脓毒症模型建立 |
| 5.2 全身炎症反应与脓毒症肠损伤相关性 |
| 5.3 全身炎症反应的中医认识 |
| 5.4 实验结果分析 |
| 6.小结 |
| 实验二 基于PI3K/Akt/HO-1 信号通路半夏泻心汤减轻炎症反应保护脓毒症大鼠肠损伤的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 复制脓毒症大鼠模型 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 给药方法 |
| 2.4 标本的采集及处理 |
| 2.5 观测指标 |
| 3.统计学处理 |
| 4.结果 |
| 4.1 各组大鼠血清二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸、内毒素水平 |
| 4.2 各组大鼠肠组织病理损伤及评分 |
| 4.3 半夏泻心汤对脓毒症大鼠血清炎症因子的影响 |
| 4.4 各组大鼠肠组织炎症因子蛋白水平表达 |
| 4.5 各组大鼠肠组织炎症因子m RNA水平表达 |
| 4.6 各组脓毒症大鼠肠组织PI3K、P-Akt和 HO-1 蛋白表达水平 |
| 4.7 各组脓毒症大鼠肠组织PI3K、P-Akt和 HO-1m RNA水平表达 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 中药治疗脓毒症胃肠功能障碍的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
（4）丙酮酸钠改善严重烫伤MODS小鼠胰岛β细胞功能不全实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 多器官功能障碍综合征与高血糖 |
| 1.2 主要实验室指标 |
| 1.3 胰岛β细胞功能 |
| 1.4 丙酮酸钠主要作用 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 严重烫伤多器官功能障碍综合征小鼠模型的建立 |
| 2.2.2 小鼠的处置 |
| 2.2.3 实验样本收集 |
| 2.2.4 主要指标检测 |
| 2.2.5 病理切片制备和染色 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 多器官功能障碍综合征小鼠 |
| 3.2 小鼠主要脏器和组织病理形态学改变 |
| 3.3 小鼠血清肝、肾及心功能水平变化 |
| 3.4 小鼠血清IL-6和SOD水平变化 |
| 3.5 小鼠胰岛β细胞功能变化 |
| 3.6 小鼠胰腺组织病理改变 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果及荣誉 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :TMEM16A在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞上高表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.4 小鼠分组及急性胰腺炎模型的建立 |
| 2.4.1 分组及给药 |
| 2.4.2 取材 |
| 2.5 小鼠胰腺腺泡细胞的分离培养及细胞炎症模型建立 |
| 2.5.1 小鼠胰腺腺泡细胞的分离培养 |
| 2.5.2 急性分离腺泡细胞炎症模型建立 |
| 2.6 AR42J细胞传代培养及炎症模型的建立 |
| 2.6.1 AR42J细胞传代培养 |
| 2.6.2 AR42J细胞炎症模型的建立 |
| 2.7 观察指标及检测方法 |
| 2.7.1 胰腺病理学检测—苏木素/伊红(HE)染色 |
| 2.7.2 免疫组织化学技术 |
| 2.7.3 western blot |
| 2.7.4 细胞免疫荧光技术 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎病理模型 |
| 3.2 TMEM16A在急性胰腺炎小鼠胰腺中高表达 |
| 3.3 TMEM16A在小鼠胰腺原代培养腺泡细胞的急性炎症中高表达 |
| 3.4 炎性AR42J细胞中TMEM16A表达结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :急性胰腺炎IL-6 增多激活IL-6/IL-6R/STAT3 促进TMEM16A表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3.1 IL-6不同浓度的配制 |
| 2.3.2 CucurbitacinⅠ液体 |
| 2.3.3 含Ig G抗体1μg/ml的培养液 |
| 2.3.4 含IL-6R中和抗体的培养液 |
| 2.3.5 TMEM16A抗体稀释液 |
| 2.4 IL-6--酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 2.4.1 标准品的配置 |
| 2.4.2 标准品曲线的制备 |
| 2.4.3 待测样品IL-6含量检测 |
| 2.5 不同浓度IL-6处理AR42J细胞 |
| 2.6 IL-6和IL-6R中和抗体共同处理AR42J细胞 |
| 2.7 IL-6和STAT3 抑制剂CucurbitacinⅠ共同处理AR42J细胞 |
| 2.8 IL-6R抗体和CucurbitacinⅠ分别处理AR42J炎性细胞 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 急性胰腺炎小鼠胰腺及血清中IL-6增加 |
| 3.2 炎性AR42J细胞上清液中IL-6增加 |
| 3.3 炎性细胞中激活 IL-6/IL-6R/STAT3 信号通路促进 TMEM16A 的高表达 |
| 3.4 IL-6对AR42J细胞TMEME16A影响浓度筛选 |
| 3.5 IL-6与IL-6R相互作用促进AR42J细胞TMEM16A的高表达 |
| 3.6 IL-6 通过激活STAT3 信号促进腺泡细胞TMEM16A的高表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IL-6急性胰腺炎早期升高 |
| 4.2 STAT3在急性胰腺炎中被激活 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :TMEM16A高表达促进急性胰腺炎发生发展 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及来源 |
| 2.3 常用试剂的配制 |
| 2.4 动物实验 |
| 2.5 质粒的基因表达 |
| 2.5.1 质粒的转化 |
| 2.5.2 质粒扩增 |
| 2.5.3 单个菌落培养 |
| 2.5.4 质粒DNA提取 |
| 2.5.5 转染 |
| 2.5.6 细胞基因表达及细胞处理 |
| 2.5.7 细胞核蛋白提取 |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 western blot |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TMEM16A高表达促进急性胰腺炎的病理进程 |
| 3.1.1 T16Ainh-A01 抑制急性胰腺炎病理进程 |
| 3.1.2 T16Ainh-A01 抑制急性胰腺炎胰腺细胞TMEM16A蛋白表达 |
| 3.2 T16Ainh-A01 减少胰腺炎症中IL-6 含量 |
| 3.3 TMEM16A高表达激活小鼠胰腺炎腺泡细胞NF-κB信号通路 |
| 3.4 TMEM16A高表达激活AR42J细胞NF-κB信号通路 |
| 3.4.1 TMEM16A质粒在AR42J细胞过表达 |
| 3.4.2 TMEM16A质粒过表达促进AR42J细胞NF-κB核转移 |
| 3.4.3 敲除TMEM16A抑制胰腺炎细胞NF-κB核转移及减少IL-6 的释放 |
| 3.4.4 T16Ainh-A01 能抑制AR42J炎症细胞TMEM16A表达 |
| 3.4.5 TMEM16A增加钙离子释放促进急性胰腺炎病理进程 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1.急性胰腺炎病因 |
| 2.急性胰腺炎发病机制 |
| 3.细胞因子与急性胰腺炎 |
| 3.1 促炎性细胞因子 |
| 3.1.1 白细胞介素1β(IL-1β) |
| 3.1.2 白细胞介素6(IL-6) |
| 3.1.3 白细胞介素8(IL-8) |
| 3.1.4 白细胞介素17A(IL-17A) |
| 3.1.5 白细胞介素18(IL-18) |
| 3.1.6 白细胞介素33（IL-33） |
| 3.1.7 肿瘤坏死因子（TNF-α） |
| 3.2 抗炎性细胞因子 |
| 3.2.1 白细胞介素-10(IL-10) |
| 3.2.2 白细胞介素-22(IL-22) |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）HO-1和中药大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 HO-1对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的SCI论文目录 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
| 外文论文三 |
| 外文论文四 |
| 外文论文五 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（7）肝素衍生物靶向胞外组蛋白对脓毒症免疫抑制小鼠的保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 脓毒症免疫抑制 |
| 1.1 脓毒症免疫抑制概况 |
| 1.2 脓毒症免疫抑制机制 |
| 2 胞外组蛋白与脓毒症 |
| 2.1 组蛋白的结构和功能 |
| 2.2 胞外组蛋白的产生 |
| 2.3 脓毒症时胞外组蛋白的细胞毒性 |
| 2.4 胞外组蛋白与炎症反应 |
| 2.5 胞外组蛋白与凝血功能阵碍 |
| 2.6 胞外组蛋白与脓毒症免疫抑制 |
| 2.7 胞外组蛋白与多器官功能障碍 |
| 2.7.1 肝损伤 |
| 2.7.2 脾脏损伤 |
| 2.7.3 小肠黏膜损伤 |
| 2.7.4 肾损伤 |
| 3 拮抗胞外组蛋白相关药物研究进展 |
| 3.1 抗组蛋白抗体 |
| 3.2 带负电荷药物 |
| 3.2.1 糖胺聚糖类药物 |
| 3.2.2 非糖胺聚糖类药物 |
| 3.3 活化蛋白C(activated protein C, APC) |
| 4 肝素非抗凝衍生物HP-SP的研究概况 |
| 4.1 肝素基本结构 |
| 4.2 HP-SP的制备及结构 |
| 4.3 HP-SP与肝素结构及活性比较 |
| 4.3.1 HP-SP与肝素结构对比 |
| 4.3.2 HP-SP与肝素活性对比 |
| 4.4 肝素衍生物对脓毒症治疗研究概况 |
| 4.4.1 抗凝作用研究概况 |
| 4.4.1.1 肝素抗凝作用研究概况 |
| 4.4.1.2 HP-SP抗凝研究概况 |
| 4.4.2 抗炎研究概况 |
| 4.4.2.1 肝素抗炎作用研究概况 |
| 4.4.2.2 HP-SP抗炎作用研究概况 |
| 4.4.3 免疫调节作用研究概况 |
| 4.4.3.1 肝素免疫调节作用研究概况 |
| 4.4.3.2 HP-SP免疫调节作用研究概况 |
| 4.4.4 糖萼保护作用研究概况 |
| 4.4.4.1 脓毒症糖萼损伤 |
| 4.4.4.2 肝素对糖萼保护作用研究概况 |
| 4.4.4.3 HP-SP对糖萼保护作用研究概况 |
| 4.5 肝素衍生物拮抗组蛋白对脓毒症治疗的研究进展 |
| 4.6 HP-SP在其他方面的应用研究 |
| 4.6.1 抗肿瘤 |
| 4.6.2 在脏器移植中的研究应用 |
| 4.6.3 在贫血中的研究应用 |
| 5 本课题的主要研究思路 |
| 第二章 肝素系列衍生物与组蛋白亲和力作用的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试药 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 肝素等样品与组蛋白亲和能力研究 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 配体蛋白CTH的预富集、偶联及再生试剂选择 |
| 3.2 动力学参数的测定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 肝素系列衍生物对内皮细胞保护作用的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 试药 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 EA.hy 926细胞的复苏与传代 |
| 2.3 肝素衍生物拮抗胞外组蛋白对内皮细胞凋亡的保护作用 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同浓度组蛋白对内皮细胞凋亡的影响 |
| 3.2 不同肝素衍生物对内皮细胞的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 第四章 HP-SP对组蛋白致小鼠生存率影响的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试药 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 羊血浆抗凝效价测定 |
| 2.3 组蛋白作用小鼠24 h生存率考察 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HP-SP抗凝效价 |
| 3.2 组蛋白作用小鼠24h生存率情况 |
| 4 讨论 |
| 第五章 HP-SP对淋巴细胞和巨噬细胞保护作用的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 试药 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 HP-SP对淋巴细胞凋亡的保护作用研究 |
| 2.3 HP-SP对巨噬细胞吞噬作用保护的研究 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HP-SP对小鼠淋巴细胞保护作用研究 |
| 3.2 HP-SP对巨噬细胞吞噬作用的影响 |
| 4 讨论 |
| 第六章 HP-SP对脓毒症小鼠炎症因子的调节及对CD4、CD8细胞和免疫器官保护作用的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试药 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 小鼠双打击脓毒症免疫抑制模型的建立 |
| 2.3 小鼠血浆IL-6、IL-10及胞外组蛋白的含量测定 |
| 2.4 小鼠脾脏、胸腺及淋巴结病理学及免疫组化测定 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脾脏一般形态观察和相对重量分析 |
| 3.2 小鼠血浆中IL-6、IL-10及细胞外组蛋白含量 |
| 3.3 小鼠免疫器官中CD4、CD8及H4免疫组化测定 |
| 3.4 小鼠免疫器官HE染色 |
| 4 讨论 |
| 第七章 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠生存率的改善以及对肝损伤、肾脏和小肠保护作用的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试药 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 小鼠双打击脓毒症免疫抑制模型的建立 |
| 2.3 小鼠一般情况观察 |
| 2.4 小鼠7天体重考察 |
| 2.5 小鼠7天生存率考察 |
| 2.6 小鼠肝大体形态观察 |
| 2.7 小鼠肝脏相对重量分析 |
| 2.8 小鼠肝组织中IL-6、IL-I0、THF-α、IL-1β及胞外组蛋白含量测定 |
| 2.8.1 小鼠肝组织中IL-6含量测定 |
| 2.8.2 小鼠肝组织中IL-10含量测定 |
| 2.8.3 小鼠肝组织中TNF-α含量测定 |
| 2.8.4 小鼠肝组织中IL-1β含量测定 |
| 2.8.5 小鼠肝组织中胞外组蛋白含量测定 |
| 2.9 小鼠血清AST、ALT肝功能指标测定 |
| 2.9.1 小鼠血清中AST的测定 |
| 2.9.2 小鼠血清中ALT的测定 |
| 2.10 小鼠肝、小肠、肾病理学检测 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠一般状况观察 |
| 3.2 小鼠7天体重变化 |
| 3.3 小鼠生存率变化 |
| 3.4 小鼠肝组织大体形态观察 |
| 3.5 小鼠相对肝脏重量分析 |
| 3.6 肝组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10及胞外组蛋白含量变化 |
| 3.7 小鼠血清中肝功能指标AST、ALT变化 |
| 3.8 肝组织HE染色 |
| 3.9 小肠组织HE染色 |
| 3.10 肾脏HE染色 |
| 4 讨论 |
| 4.1 脓毒症时肝组织胞外组蛋白和炎症因子水平 |
| 4.2 脓毒症时肝功能损伤和病理检测 |
| 4.3 小鼠生存率及小肠、肾脏病理检测 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）多器官功能障碍综合征的病理学变化（论文提纲范文）
| 1 多器官功能障碍综合征的概念与发展沿革 |
| 2 病因与发病机制 |
| 2.1 缺血再灌流损伤假说 |
| 2.2细菌毒素假说 |
| 2.3 肠源性损伤假说 |
| 2.4 炎症失控假说 |
| 3 主要脏器病理改变 |
| 3.1 肺 |
| 3.1.1 大体 |
| 3.1.2 光镜 |
| 3.1.3 电镜 |
| 3.2 肝 |
| 3.2.1 光镜 |
| 3.2.2 电镜 |
| 3.3 肾 |
| 3.3.1 光镜 |
| 3.3.2 电镜 |
| 3.4 心 |
| 3.4.1 光镜 |
| 3.4.2 电镜 |
| 3.5 脑 |
| 3.5.1 光镜 |
| 3.5.2 电镜 |
| 3.6 胃肠 |
| 3.6.1 大体 |
| 3.6.2 光镜 |
| 3.6.3 电镜 |
| 4 免疫系统病理改变 |
| 4.1 胸腺 |
| 4.1.1 光镜 |
| 4.1.2 电镜 |
| 4.2 脾 |
| 4.2.1 光镜 |
| 4.2.2 电镜 |
| 4.3 脏器间质树突状细胞 |
| 5 结语与展望 |
（9）高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠病理损伤特征及补体介导的免疫病理损伤机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 中文摘要 Abstract 前言 第一部分 高致病禽流感 H5N1 病毒感染小鼠模型的建立及感染损伤特征分析 |
| 第一节：高致病禽流感 H5N1 病毒感染小鼠模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节：禽流感 H5N1、H7N9 病毒及流感 H1N1 病毒感染损伤特征研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 第二部分 补体介导的免疫病理损伤在 H5N1 病毒感染所致严重肺炎中的作用研究 |
| 第一节：补体在 H5N1 病毒感染后的激活研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节：抑制补体过度激活在 H5N1 病毒感染所致严重肺炎的保护研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 结论 参考文献 附录 个人简历 致谢 综述 |
| 参考文献 |
（10）PD对MODS模型大鼠的抗氧化应激、炎症反应和凋亡的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 多器官功能不全综合征模型的复制和PD给药最佳剂量探索 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 第二部分 PD对于多器官功能不全综合征大鼠的治疗作用和机制探讨 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间研究成果 |
| 缩略语中英文对照 |
| 统计学证明 |
| 致谢 |
四、小鼠迟发型多器官功能障碍综合征模型复制及病理学观察（论文参考文献）
- [1]循环组蛋白与急重症时多器官功能障碍综合征发病机制相关性的研究[D]. 程振兴. 东南大学, 2020
- [2]益精方调控慢性缺氧诱导的睾丸Leydig细胞凋亡治疗LOH的机制研究[D]. 闵潇. 中国中医科学院, 2020(01)
- [3]半夏泻心汤治疗脓毒症胃肠功能障碍的临床疗效评价及其调控PI3K/Akt/HO-1信号通路作用机制的研究[D]. 李国臣. 山东中医药大学, 2020(01)
- [4]丙酮酸钠改善严重烫伤MODS小鼠胰岛β细胞功能不全实验研究[D]. 宁丽萍. 南昌大学, 2020(08)
- [5]钙激活氯通道TMEM16A在急性胰腺炎中的表达及作用机制研究[D]. 王清华. 中国医科大学, 2020(01)
- [6]HO-1和中药大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺保护机制的研究[D]. 范开亮. 山东大学, 2019(03)
- [7]肝素衍生物靶向胞外组蛋白对脓毒症免疫抑制小鼠的保护作用研究[D]. 张嘉茜. 山东大学, 2019(03)
- [8]多器官功能障碍综合征的病理学变化[J]. 陆江阳. 诊断病理学杂志, 2014(06)
- [9]高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠病理损伤特征及补体介导的免疫病理损伤机制研究[D]. 刘晨风. 安徽医科大学, 2014(10)
- [10]PD对MODS模型大鼠的抗氧化应激、炎症反应和凋亡的保护作用[D]. 陈仲清. 南方医科大学, 2014(11)
标签：多器官功能障碍综合征论文; 脓毒症论文; 组蛋白论文; 血清蛋白论文; 健康论文;